עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (CA142664).

1. איתור של ROS באמצעות carboxy-H 2 DCFDA Carboxy-H 2 DCFDA הוא לא פלורסנט אלא בנוכחותו של ROS, כאשר זה מגיב מתחמצן, הוא הופך להיות פלואורסצנטי ירוק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לפני השימוש, פתרון להכין מלאי חדש של carboxy-H 2 DCFDA ב dimethylsulfoxide סטרילי (DMSO) או 100% אתנול. הימנע מרובים ההפשרה / ההקפאה מחזורים של צבע שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם HEPES שנאגרו תמיסת מלח (HBSS) או פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) כדי להסיר עקבות של המדיום המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען תאים עם צבען (ואת צבע שליטה, סעיף ראו הערה). ב assay זה השתמשנו Jurkat, קו אנושי תא לוקמיה. השתמש carboxy-H 2 DCFDA בריכוז הסופי של 1μM במדיום תרבות קבוע עם סרום מופחת (2%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התרבויות במשך 30 דקות בחושך, בתוך חממה קונבנציונלי (37 ° C, CO2 5%). מחק את כל פתרונות לצבוע בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר carboxy-H 2 DCFDA המכיל בינוני לשטוף פעמיים עם HBSS או PBS. מתוך שלב זה קדימה, להגן על התאים שלך מפני האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני טרי המכיל תרופה לפי בחירתך את carboxy-H 2 DCFDA טעון תאים דגירה כרצונכם. בדוגמה זו אנו משתמשים H 2 O 2 (0.03%) במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת ROS על ידי מיד לניתוח התאים על ידי זרימה cytometry באמצעות הערוץ FL1 (פלואורסצנטי ירוק), או על ידי קורא צלחת פלואורסצנטי, או על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הקרינה ניתן לאתר באמצעות עירור ופליטה אורכי הגל המתאימים פלואורסצנטי ירוק. </li></ol> הערה: בקרת צריכה לכלול carboxy-H 2 DCFDA טעון בתאים שלא טופלו ותאי מטופל בלא כתם. Carboxy-H 2 DCFDA ידוע לזהות peroxides אבל יכול להיות גם על ידי ROS חמצון אחרים. מגיב זה יכול גם להיות שונה באמצעים אחרים, לצבוע רגישות חמצון בקרה כגון 5 - (ו -6), carboxy-2 &quot;, 7&#39;-dichlordiacetate ofluorescein (carboxy-DCFDA) ולכן צריך להיכלל במבחן. 2. מדידה של ייצור תחמוצת החנקן (NO) יהיה עליך Sulfanilamide ו-N-1-napthylethylenediamine (NED) פתרונות dihydrochloride, ורמת ניטריט. Assay זה נקרא assay Griess. פתרון NED: הכן פתרון 0.1% dihydrochloride N-1-napthylethylenediamine מדולל פתרון water.Sulfanilamide סטרילי: הכן פתרון 1% sulfanilamide בדילול מלא חומצה זרחנית 5%. תקן ניטריט: לדלל את רמת הנתרן 0.1M הניטריט המניות 100μM במדיום סטרילי, לעשות דילול סדרתי במדיום זהה. תנאי אחסון: כימיקלים חנות לפי הוראות היצרן בטמפרטורת החדר. כאשר מחדש, נד ופתרונות Sulfanilamide מאוחסנים מיד לאחר השימוש ב 4 ° C, בחושך, וגם לתקופה מקסימלית של 3 חודשים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות תאים בצלחת 96 באר,השימוש triplicates עבור כל תנאי, והם כוללים בקרות נאותה על פי הניסויים שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את התאים כדי לגרום NO הייצור. בניסוי שלנו אנו משתמשים lipopolysaccharide (LPS) (100 ng / ml) ו-IL-4 רקומביננטי לטיפול בתאים שלנו. בפרוטוקול זה, השתמשנו RAW 264.7, macrophage עכבר קו תאים (leukaemic עכבר קו מונוציטים macrophage התא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של assay, להביא את שני ריאגנטים לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הצלחת שלך, לאסוף supernatants תא ולהעביר 50μl לצלחת 96 חדש גם כן. הכן הגבלת בארות דילול של מניות פתרון סטנדרטי שלך לעשות עקומת סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50μl הפתרון Sulfanilamide לדגום כל ולשלוט היטב ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50μl של פתרון N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride לדגום כל ולשלוט היטב ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד absorbance מיד באמצעות קורא צלחת עם מסנן של אורכי גל שבין 520nm ו 550nm. </li></ol> אם אתם משתמשים שונים צלחת / תבשיל גדלים, להשתמש 1/1/1 נפח לפתרון כל supernatant המדגם. צבע סגול יופיעו בארות חיובית. התוצאות שהושגו עם תקן יעזור לך לבדוק את היציבות של פתרונות שלך. 3. איתור של ROS פעולה: חלבונים חמצון שיטה אחרת כדי לזהות את הייצור של ROS הוא להסתכל על התוצאות הסופיות על ידי גילוי חמצון של חלבונים. ואכן, ROS לשנות גלוטתיון, נוגד חמצון זה בא לידי ביטוי ברוב התאים יש תפקיד מגן מפני ROS. בעקבות חמצון על ידי ROS, שינוי של הקטינה גלוטתיון (GSH) תוצאות בקבוצה (תיאול) sulfhydryl של ציסטאין היותו קשור גלוטתיון שנייה באמצעות גשר דיסולפיד. הדבר מוביל להיווצרות חלבון dimerized (GSSG חלבון חמצון). GSH ניתן לשחזר באמצעות שינוי של GSSG ידי רדוקטאז גלוטאתיון. הגידול יחס GSSG / GSH משקף סטרס חמצוני. Assay הבא מבוסס על זיהוי וכימות של החלבונים האלה חמצון. שיטה זו אינה סלקטיבית עבור ROS ספציפי אלא מזהה את ההשפעות של NO, H 2 O 2, O 2 ו - ROS אחרים. כאן אנו למדוד את הכמות הכוללת של חמצון (GSSG) ו מופחת (GSH) גלוטתיון באמצעות אותות bioluminescent. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים התאים בצלחת 96 באר (לבן / שקוף, תחתית שטוחה) כרגיל. לצורך ניסוי זה, השתמשנו 1x10 4 תאים לכל היטב חסיד 264.7 ו A549 תאים גלם Jurkat תאים ההשעיה. בהתאם לגודל של התאים שלך מספרים אלה יכולים להיות מותאמים. אנו ממליצים לתאי צלחת חסיד יום לפני המבחן כדי לאפשר להם לצרף את הצלחת. מספיק בארות צריכים להיות מוכנים לגילוי חלבון חמצון מופחתת, כמו גם עבור &quot;רק בינוני&quot; ובתאים שלא טופלו כפי שולטת. השתמש triplicates כל התנאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את התאים שלך עם התרופה שלך בפעם הנדרש. כאן התייחסנו תאים Jurkat ו A549 תאים 1h עם H 2 O 2 (ב 5mm ו 2.5mm בהתאמה). Raw 264.7 תאים שטופלו 200ng/ml של LPS עבור 16 ח במהלך תקופה זו הדגירה, להביא את כל ריאגנטים שלך לטמפרטורת החדר (RT). הפוך את כל ריאגנטים לא יותר מ 30 דקות לפני ביצוע הבדיקה. הטבלה שלהלן מציגה את הכרכים של ריאגנטים לכל טוב. במידת האפשר, חשוב להסיר את המדיה שמכילה את סוכן הפחתת לפני שתמשיך הבדיקה. </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="2"> חסיד תאים </td><td colspan="2"> השעיה תאים </td></tr><tr><td> תמוגה סך Glu </td><td> חמצון Glu תמוגה </td><td> תמוגה סך Glu </td><td> חמצון Glu תמוגה </sטרונג&gt; </td></tr><tr><td> Nem, 25mm </td><td> אף אחד </td><td> 0.5μl </td><td> אף אחד </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> Luciferin-NT </td><td> 1 μl </td><td> 1 μl </td><td> 1 μl </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> מאגר תמוגה פסיבי, 5X </td><td> 10μl </td><td> 10μl </td><td> 10μl </td><td> 10μl </td></tr><tr><td> מים מזוקקים </td><td> 39.0μl </td><td> 38.5μl </td><td> 14μl </td><td> 13.5μl </td></tr><tr><td> נפח סופי לכל טוב </td><td> 50μl </td><td> 50μl </td><td> 25μl </td><td> 25μl </td></tr></tbody></table><ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני מבארות עם תאים חסיד. אל תסיר בינוני בבארות עם תאים ההשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מופחת מגיב תמוגה גלוטתיון מחומצן או תמוגה מגיב גלוטתיון את בארות המתאים וללחוץ במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מגיב הדור Luciferin ו incubatדואר במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מגיב איתור Luciferin ו דגירה במשך 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא את האות bioluminescent בזמן שילוב של שנייה 0.25-1 דולר היטב באמצעות luminometer הקורא צלחת. </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> חסיד תאים </td><td> השעיה תאים </td></tr><tr><td> מספר נייד לכל טוב </td><td> 1x10 4 </td><td> 1x10 4 </td></tr><tr><td> תא השעיה לכל תרופה + טוב </td><td> 100 μl, יש להסיר לפני 3.4 </td><td> 25μl, לא יוסר </td></tr><tr><td> מגיב גלוטתיון מופחתת תמוגה </td><td> 50 μl </td><td> 25μl </td></tr><tr><td> גלוטתיון מחומצן תמוגה מגיב </td><td> 50 μl </td><td> 25μl </td></tr><tr><td> Luciferin מגיב דור </td><td> 50 μl </td><td> 50 μl </td></tr><tr><td> Luciferin מגיב איתור </td><td> 100 μl </td><td> 100 μl </td></tr></tbody></table> 4. נציג תוצאות: <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3357/3357fig1.jpg" /> איור 1 איתור של ROS באמצעות carboxy-H2DCFDA לצבוע. תאים Jurkat (קו אנושי תא לוקמיה) שטופלו עם H 2 O 2 הושוו לא טופלו התאים. ROS גורם שינוי של carboxy-H 2 DCFDA כי מאיר ירוק כפי שזוהו על ידי cytometry זרימה, השיא ניאון H 2 O 2 תאים שטופלו שינוי לעומת הפסגות שולטת (H 2 O 2 תאים שטופלו מוכתמים בצבע חמצון לא רגיש ולא שטופלו בתאים מוכתם carboxy-H 2 DCFDA). תוצאות לאשר את קיומו של ROS בתאים שטופלו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3357/3357fig2.jpg" /> איור 2 איתור oו NO באמצעות ריאגנטים Griess. RAW 264.7 תאים (עכבר macrophage) טופלו LPS ו - IL-4. עלייה משמעותית בייצור NO זוהה בתאים שטופלו לעומת שליטה בתאים שלא טופלו. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שורות תאים </td><td> ללא טיפול </td><td> המטופלים </td></tr><tr><td> Raw 264.7 </td><td> 13.0 </td><td> 8.3 </td></tr><tr><td> A549 </td><td> 21.6 </td><td> 10.5 </td></tr><tr><td> Jurkat </td><td> 5.2 </td><td> 2.8 </td></tr></tbody></table> לוח 1: איתור של ROS בתיווך חמצון של חלבונים. RAW 264.7 תאים שטופלו LPS, Jurkat ו A549 (סרטן ריאה אנושית) תאים שטופלו H 2 O 2. תוצאות מבוטאות כיחס מופחת (GSH) / חמצון (GSSG) גלוטתיון. יחס נמוך של גלוטתיון (GSH) / (GSSG) התגלו תאים שטופלו לעומתשליטה בתאים שלא טופלו, חושף כי חלבונים היו מתחמצן יותר בתאים שטופלו.

<ol>
	<li>Guzik, T. J., Korbut, R., Adamek-Guzik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+superoxide+in+inflammation+and+immune+regulation.">Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation.</a> J Physiol Pharmacol. 54, 469-487 (2003).</li><li>Perl, A., Gergely, P., Banki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+T+cells+of+patients+with+systemic+lupus+erythematosus.">Mitochondrial dysfunction in T cells of patients with systemic lupus erythematosus.</a> Int Rev Immunol. 23, 293-313 (2004).</li><li>Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M. T., Mazur, M., Telser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+and+antioxidants+in+normal+physiological+functions+and+human+disease.">Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease.</a> Int J Biochem Cell Biol. 39, 44-84 (2007).</li><li>Droge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+in+the+physiological+control+of+cell+function.">Free radicals in the physiological control of cell function.</a> Physiol Rev. 82, 47-95 (2002).</li><li>Nakamura, K., Yube, K., Miyatake, A., Cambier, J. C., Hirashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+CD4+D3-D4+membrane+proximal+extracellular+domain+for+the+inhibitory+effect+of+oxidative+stress+on+activation-induced+CD4+down-regulation+and+its+possible+role+for+T+cell+activation.">Involvement of CD4 D3-D4 membrane proximal extracellular domain for the inhibitory effect of oxidative stress on activation-induced CD4 down-regulation and its possible role for T cell activation.</a> Mol Immunol. 39, 909-921 (2003).</li><li>Los, M., Droge, W., Stricker, K., Baeuerle, P. A., Schulze-Osthoff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+as+a+potent+activator+of+T+lymphocyte+functions.">Hydrogen peroxide as a potent activator of T lymphocyte functions.</a> Eur J Immunol. 25, 159-165 (1995).</li><li>Deem, T. L., Cook-Mills, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+cell+adhesion+molecule+1+(VCAM-1)+activation+of+endothelial+cell+matrix+metalloproteinases:+role+of+reactive+oxygen+species.">Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) activation of endothelial cell matrix metalloproteinases: role of reactive oxygen species.</a> Blood. 104, 2385-2393 (2004).</li><li>Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+peroxynitrite+in+health+and+disease.">Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease.</a> Physiol Rev. 87, 315-424 (2007).</li><li>Griendling, K. K., Sorescu, D., Lassegue, B., Ushio-Fukai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+protein+kinase+activity+and+gene+expression+by+reactive+oxygen+species+and+their+role+in+vascular+physiology+and+pathophysiology.">Modulation of protein kinase activity and gene expression by reactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 2175-2183 (2000).</li><li>Loh, K., Deng, H., Fukushima, A., Cai, X., Boivin, B., Galic, S., Bruce, C., Shields, B. J., Skiba, B., Ooms, L. M., Stepto, N., Wu, B., Mitchell, C. A., Tonks, N. K., Watt, M. J., Febbraio, M. A., Crack, P. J., Andrikopoulos, S., Tiganis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+enhance+insulin+sensitivity.">Reactive oxygen species enhance insulin sensitivity.</a> Cell Metab. 10, 260-272 (2009).</li><li>Goldstein, B. J., Mahadev, K., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+paradox:+insulin+action+is+facilitated+by+insulin-stimulated+reactive+oxygen+species+with+multiple+potential+signaling+targets.">Redox paradox: insulin action is facilitated by insulin-stimulated reactive oxygen species with multiple potential signaling targets.</a> Diabetes. 54, 311-321 (2005).</li></ol>

קיבלנו את התמיכה של Promega לפרסום זה.

במצבים פתולוגיים אחדים כגון מחלות, סרטן דלקתיות, איסכמיה / reperfusion, גם טיפולים כגון קרינה או כימותרפיה (ציספלטין למשל) לעורר ייצור יתר ROS. לפיכך, גילוי מדידת רמות ROS חשוב רבים, מחקרים בסיסיים טרום קליניים וקליניים. עם זאת, ROS יש מחצית חיים קצר מאוד יכול להיות מסובך לזהות. כ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> 5 - (ו -6), carboxy-2 &quot;, 7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (carboxy-DCFDA) </td><td> מולקולרית בדיקות </td><td> C369 </td><td> שליטה </td></tr><tr><td> carboxy-H 2 DCFDA </td><td> מולקולרית בדיקות </td><td> C400 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfanilamide </td><td> סיגמא </td><td> S9251-100 גרם </td><td></td></tr><tr><td> N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride </td><td> סיגמא </td><td> N9125-10G </td><td></td></tr><tr><td> ניטריט תקן </td><td> סיגמא </td><td> 237,213, 100 גרם </td><td></td></tr><tr><td> GSH / GSSG זוהרים Assay </td><td> Promega </td><td> V6612 </td><td> כדי לכמת חמצון, או חמצון מופחתת / מופחת גלוטתיון </td></tr></tbody>
</table>

production and detection of reactive oxygen species (ros) in cancers

מינים החמצן מגיב לכלול מספר מולקולות DNA ו-RNA נזק ו לחמצן חלבונים ושומנים (peroxydation שומנים בדם). אלה מכילים מולקולות חמצן כוללים H 2 O 2 (מי חמצן), NO (תחמוצת החנקן), O 2 - (אניון תחמוצת), peroxynitrite (ONOO -), חומצה hydrochlorous (HOCl), ו רדיקלי הידרוקסיל (OH -) . מינים חמצוני מיוצרים לא רק תחת מצבים פתולוגיים (סרטן, reperfusion איסכמי /, מחלות נוירולוגיות לב וכלי דם, מחלות זיהומיות, מחלות דלקתיות 1, מחלות אוטואימוניות 2, וכו ...) אלא גם במצבים פיזיולוגיים (לא פתולוגי) כגון חילוף החומרים התאי 3 , 4. ואכן, ROS ממלאים תפקידים חשובים רבים מסלולי איתות תאיים (התפשטות, הפעלת תא 5, 6, 7 הגירה וכו &#39;.). ROS יכול להיות מזיק (זה נקרא אז בשם&quot;סטרס חמצוני nitrosative&quot;) כאשר מיוצר בכמויות גבוהות של תאים תאים תאיים בדרך כלל להגיב על ידי ROS upregulating נוגדי חמצון כגון superoxide dismutase (SOD) ו Catalase (CAT), peroxidase גלוטתיון (GPX) ו גלוטתיון (GSH) המגן אותם רדיקלים חופשיים על ידי המרת מסוכן מולקולות מזיקות (כלומר מים). ויטמינים C ו-E יש גם כמתואר נבלות ROS (נוגדי חמצון). רדיקלים חופשיים הם מועילים סכומים נמוכים 3. Macrophage ו נויטרופילים בתיווך תגובות חיסוניות לערב את ייצור שחרור NO, אשר מעכב וירוסים, פתוגנים התפשטות הגידול 8. NO גם מגיב עם ROS אחרים ולכן, יש גם תפקיד כמו detoxifier (נבלות ROS). לבסוף NO פועלת על כלי לווסת את זרימת הדם שהינה חשובה ההסתגלות של השריר לממש ממושכת 9, 10. פרסומים אחדים הראו גם כי ROS מעורבים Sens אינסוליןitivity 11, 12. שיטות רבות להעריך ייצור ROS זמינים. במאמר זה אנו מציעים מבחני פשוט, מהיר, וזול מספר: מבחני הללו אומתו על ידי פרסומים רבים משמשים באופן שגרתי כדי לזהות ROS או השפעותיו בתאי יונקים. בעוד שחלק מבחני אלה לזהות ROS מרובים, אחרים לזהות רק ROS יחיד.

Watch this Scientific Journal Video about Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers at JoVE.com

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

כאן אנו מציעים שיטות פשוטות כדי לבחון ולהעריך את הנוכחות של מינים חמצן תגובתי בתאים.

הפקה וזיהוי של מינים חמצן תגובתי (ROS) סרטן

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

production-and-detection-of-reactive-oxygen-species-ros-in-cancers

Research

JoVE Journal

Medicine

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

69.8K Views.  Baylor College of Medicine. כאן אנו מציעים שיטות פשוטות כדי לבחון ולהעריך את הנוכחות של מינים חמצן תגובתי בתאים.

Video: Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of the hepatic blood supply is poorly oxygenated portal vein blood derived from the gastrointestinal tract and spleen. Oxygen is delivered to hepatocytes by blood flowing from a terminal branch of the portal vein to a central venule via sinusoids, and this makes an oxygen gradient in hepatic lobules. The oxygen gradient is an important physical parameter that involves the expression of enzymes upstream and downstream in hepatic microcirculation, but the lack of techniques for measuring oxygen consumption in the hepatic microcirculation has delayed the elucidation of mechanisms relating to oxygen metabolism in liver. We therefore used FITC-labeled erythrocytes to visualize the hepatic microcirculation and used laser-assisted phosphorimetry to measure the partial pressure of oxygen in the microvessels there. Noncontact and continuous optical measurement can quantify blood flow velocities, vessel diameters, and oxygen gradients related to oxygen consumption in the liver. In an acute hepatitis model we made by administering acetaminophen to mice we observed increased oxygen pressure in both portal and central venules but a decreased oxygen gradient in the sinusoids, indicating that hepatocyte necrosis in the pericentral zone could shift the oxygen pressure up and affect enzyme expression in the periportal zone. In conclusion, our optical methods for measuring hepatic hemodynamics and oxygen consumption can reveal mechanisms related to hepatic disease.

An optical system was developed to visualize hepatic microcirculation with FITC-labeled erythrocytes and to measure the partial pressure of oxygen in the microvessels with laser-assisted phosphorimetry. This method can be used to investigate physiological and pathological mechanisms by analyzing microvascular structure, diameter, blood flow velocity, and oxygen tension.

הדמיה וניתוח של זרימת הדם ואת צריכת החמצן microcirculation כבד: בקשה דגם הפטיטיס חריפה

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

In molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI) are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. PET is characterized by its excellent sensitivity and quantification ability while OI is notable for non-radiation, relative low cost, short scanning time, high throughput, and wide availability to basic researchers. However, both modalities have their shortcomings as well. PET suffers from poor spatial resolution and high cost, while OI is mostly limited to preclinical applications because of its limited tissue penetration along with prominent scattering optical signals through the thickness of living tissues.
 Recently a bridge between PET and OI has emerged with the discovery of Cerenkov Luminescence Imaging (CLI)4-6. CLI is a new imaging modality that harnesses Cerenkov Radiation (CR) to image radionuclides with OI instruments. Russian Nobel laureate Alekseyevich Cerenkov and his colleagues originally discovered CR in 1934. It is a form of electromagnetic radiation emitted when a charged particle travels at a superluminal speed in a dielectric medium7,8. The charged particle, whether positron or electron, perturbs the electromagnetic field of the medium by displacing the electrons in its atoms. After passing of the disruption photons are emitted as the displaced electrons return to the ground state. For instance, one 18F decay was estimated to produce an average of 3 photons in water5. 
 Since its emergence, CLI has been investigated for its use in a variety of preclinical applications including in vivo tumor imaging, reporter gene imaging, radiotracer development, multimodality imaging, among others4,5,9,10,11. The most important reason why CLI has enjoyed much success so far is that this new technology takes advantage of the low cost and wide availability of OI to image radionuclides, which used to be imaged only by more expensive and less available nuclear imaging modalities such as PET.
 Here, we present the method of using CLI to monitor cancer drug therapy. Our group has recently investigated this new application and validated its feasibility by a proof-of-concept study12. We demonstrated that CLI and PET exhibited excellent correlations across different tumor xenografts and imaging probes. This is consistent with the overarching principle of CR that CLI essentially visualizes the same radionuclides as PET. We selected Bevacizumab (Avastin; Genentech/Roche) as our therapeutic agent because it is a well-known angiogenesis inhibitor13,14. Maturation of this technology in the near future can be envisioned to have a significant impact on preclinical drug development, screening, as well as therapy monitoring of patients receiving treatments.

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Use of Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for monitoring preclinical cancer treatment is described here. This method takes advantage of Cerenkov Radiation (CR) and optical imaging (OI) to visualize radiolabeled probes and thus provides an alternative to PET in preclinical therapeutic monitoring and drug screening.

Cerenkov הארת ההדמיה (CLI) לניטור ריפוי הסרטן

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

Detection of Architectural Distortion in Prior Mammograms via Analysis of Oriented Patterns

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms of interval-cancer cases based on analysis of the orientation of breast tissue patterns in mammograms. We hypothesize that architectural distortion modifies the normal orientation of breast tissue patterns in mammographic images before the formation of masses or tumors. In the initial steps of our methods, the oriented structures in a given mammogram are analyzed using Gabor filters and phase portraits to detect node-like sites of radiating or intersecting tissue patterns. Each detected site is then characterized using the node value, fractal dimension, and a measure of angular dispersion specifically designed to represent spiculating patterns associated with architectural distortion.
Our methods were tested with a database of 106 prior mammograms of 56 interval-cancer cases and 52 mammograms of 13 normal cases using the features developed for the characterization of architectural distortion, pattern classification via quadratic discriminant analysis, and validation with the leave-one-patient out procedure. According to the results of free-response receiver operating characteristic analysis, our methods have demonstrated the capability to detect architectural distortion in prior mammograms, taken 15 months (on the average) before clinical diagnosis of breast cancer, with a sensitivity of 80% at about five false positives per patient.

Detection of Architectural Distortion in Prior Mammograms via Analysis of Oriented Patterns

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms. Oriented structures are analyzed using Gabor filters and phase portraits to detect sites of radiating tissue patterns. Each site is characterized and classified using measures to represent spiculating patterns. The methods should assist in the detection of breast cancer.

זיהוי של דיסטורשן אדריכלי בממוגרפיה לפני<em&gt; דרך</em&gt; ניתוח דפוסי Oriented

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms of interval-cancer cases based on analysis of the orientation of ...

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that system. Changes in blood flow to the small intestine can result in effects on the absorptive functions of the organ. Particular interest in toxins liberated from feedstuffs through fermentative and digestive processes has developed in ruminants as an area where productive efficiencies could be improved. The video associated with this article describes an in vitro bioassay developed to screen compounds for vasoactivity in isolated cross-sections of bovine mesenteric artery and vein using a multimyograph. Once the blood vessels are mounted and equilibrated in the myograph, the bioassay itself can be used: as a screening tool to evaluate the contractile response or vasoactivity of compounds of interest; determine the presence of receptor types by pharmacologically targeting receptors with specific agonists; determine the role of a receptor with the presence of one or more antagonists; or determine potential interactions of compounds of interest with antagonists. Through all of this, data are collected real-time, tissue collected from a single animal can be exposed to a large number of different experimental treatments (an in vitro advantage), and represents vasculature on either side of the capillary bed to provide an accurate picture of what could be happening in the afferent and efferent blood supply supporting the small intestine.

The small intestine is frequently exposed to toxins that can influence blood flow and negatively impact nutrient absorption. Using a multimyograph and mesenteric artery and vein isolates, compounds or toxins of interest can be screened for vasoactivity.

בידוד ושימוש בסעיפים של עורקי שור mesenteric ווריד כמבדק לבדיקת Vasoactivity במעי הדק

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

הערכת מחסומי transmissible מינים ספגו מוח עם<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay המרת חלבון הפריון

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in experimental models of synucleopathies. A transgenic mouse line (M83) over-expressing the human A53T &#945;S and spontaneously developing a dramatic clinical phenotype between eight and 22 months of age, characterized by symptoms including weight loss, prostration, and severe motor impairment, was used in this study. For molecular analyses of &#945;SD (disease-associated &#945;S) in these mice, an ELISA was designed to specifically quantify &#945;SD in sick mice. Analysis of the central nervous system in this mouse model showed the presence of &#945;SD mainly in the caudal brain regions and the spinal cord. There were no differences in &#945;SD distribution between different experimental conditions leading to clinical disease, i.e., in uninoculated and normally aging transgenic mice and in mice inoculated with brain extracts from sick mice. The specific detection of &#945;SD immunoreactivity using an antibody against Ser129 phosphorylated &#945;S by ELISA essentially correlated with that obtained by Western blot and immunohistochemistry. Unexpectedly, similar results were observed with several other antibodies against the C-terminal part of &#945;S. The propagation of &#945;SD, suggesting the involvement of a &#8220;prion-like&#8221; mechanism, can thus be easily monitored and quantified in this mouse model using an ELISA approach.

Detection of Disease-associated &amp;#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &amp;#945;-synuclein

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated &#945;S form or the C-terminal part of the protein.

איתור של α-סינוקלאין קשורים למחלות על ידי ELISA משופר במוח של עכברים הטרנסגניים ביתר A53T אדם מוטצית α-סינוקלאין

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive astrogliosis. Reactive astrocytes exert both inflammatory and protective effects that inhibit and promote, respectively, neural repair. The mechanisms underlying the diverse functional properties of reactive astrogliosis are not well understood. Achieving a greater understanding of these mechanisms is critical to developing therapeutic strategies to treat the injured CNS. Here we demonstrate a method to trigger reactive astrogliosis in the adult mouse forebrain using a forebrain stab lesion. This lesion model is simple, reliable, and requires only a stereotaxic device and a scalpel blade to produce the injury. The use of stab lesions as an injury model in the forebrain is well established and amenable to studies addressing a broad range of neuropathological outcomes, such as neuronal degeneration, neuroinflammation, and disruptions in the blood brain barrier (BBB). Thus, the forebrain stab injury model serves as a powerful tool that can be applied for a broad range of studies on the CNS response to trauma.

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

This article describes a detailed protocol to produce a forebrain stab injury in adult mice. The stab injury induces severe reactive gliosis and glial scar formation which can be subsequently examined by standard immunohistochemistry methods.

מפעילה תגובתי דבקה<em&gt; In vivo</em&gt; על ידי המוח הקדמי דקירת פגיעה

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent vasoactive agents, nitric oxide (NO), can also act as a powerful inhibitor of platelet aggregation. Direct NO detection in blood is very challenging due to its high reactivity with cell-free hemoglobin that limits NO half-life to the millisecond range. Currently, NO changes after interventions are only estimated based on measured changes of nitrite and nitrate (members of the nitrate-nitrite-NO metabolic pathway). However precise, these measurements are rather difficult to interpret vis a vis actual NO changes, due to the naturally high baseline nitrite and nitrate levels that are several orders of magnitude higher than expected changes of NO itself. Therefore, the development of direct and simple methods that would allow one to detect NO directly is long overdue. This protocol addresses a potential use of platelets as a highly sensitive NO sensor in blood. It describes initial platelet rich plasma (PRP) and washed platelet preparations and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as NO generators. Phosphorylation of VASP at serine 239 (P-VASPSer239) is used to detect the presence of NO. The fact that VASP protein is highly expressed in platelets and that it is rapidly phosphorylated when NO is present leads to a unique opportunity to use this pathway to directly detect NO presence in blood.

Here, we present a protocol to address the potential use of platelets as a highly sensitive nitric oxide sensor in blood. It describes initial platelet preparation and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as nitric oxide generators.

זיהוי מבוסס על טסית דם של תחמוצת החנקן בדם על ידי מדידת זרחון VASP

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of the fresh gas entering a lung region divided by the region&#8217;s end-expiratory volume &#8213; in the human lung, using only inhaled oxygen as a contrast agent. Regional quantification of specific ventilation has the potential to help identify areas of pathologic lung function. Oxygen in solution in tissue shortens the tissue&#8217;s longitudinal relaxation time (T1), and thus a change in tissue oxygenation can be detected as a change in T1-weighted signal with an inversion recovery acquired image. Following an abrupt change between two concentrations of inspired oxygen, the rate at which lung tissue within a voxel equilibrates to a new steady-state reflects the rate at which resident gas is being replaced by inhaled gas. This rate is determined by specific ventilation. To elicit this sudden change in oxygenation, subjects alternately breathe 20-breath blocks of air (21% oxygen) and 100% oxygen while in the MRI scanner. A stepwise change in inspired oxygen fraction is achieved through use of a custom three-dimensional (3D)-printed flow bypass system with a manual switch during a short end-expiratory breath hold. To detect the corresponding change in T1, a global inversion pulse followed by a single shot fast spin echo sequence was used to acquire two-dimensional T1-weighted images in a 1.5&#160;T MRI scanner, using an eight-element torso coil. Both single slice and multi-slice imaging are possible, with slightly different imaging parameters. Quantification of specific ventilation is achieved by correlating the time-course of signal intensity for each lung voxel with a library of simulated responses to the air/oxygen stimulus. SVI estimations of specific ventilation heterogeneity have been validated against multiple breath washout and proved to accurately determine the heterogeneity of the specific ventilation distribution.

Specific ventilation imaging is a functional magnetic resonance imaging technique that allows for quantification of regional specific ventilation in the human lung, using inhaled oxygen as a contrast agent. Here, we present a protocol to collect and analyze specific ventilation imaging data.

מיפוי כמותי של אוורור ספציפי בריאה האנושית באמצעות דימות תהודה מגנטית פרוטון וחמצן כסוכן ניגודיות

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...