שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תיקון רקמות והתחדשות על הקשרים בין המסלולים cytoprotective, מתח חמצוני, ואת התגובה ריפוי הפצע. היתרון העיקרי של טכניקה רבת עוצמה זו הוא שאתה יכול למדוד מינים חמצן תגובתי בפצע, בזמן אמת, כדי לקבוע את השפעתם על התחדשות רקמות. הפגנת ההליך איתי תהיה ג'ניפר קוונג, עוזרת מחקר במעבדה שלי.
השתמש בגלוקומטר כדי למדוד את רמת הגלוקוז בדם של כל עכבר סוכרתי הרדמה בן שמונה עד 12 שבועות. ולהשתמש גוזם שיער קרם depilatory כדי להסיר את השיער הגבי מן החיה הראשונה. השתמשו במגבוני אלכוהול פעמיים כדי לנקות את העור החשוף ולעטף את החיה כך שרק האזור הכירורגי ייחשף.
כאשר האלכוהול התייבש, להשתמש אגרופים ביופסיה סטרילית 10 מילימטר כדי ליצור שניים, 10 מילימטר פצעי עובי מלא המשתרעים דרך panniculus קרנוסוס על פי טכניקת ריפוי פצע כריתה הוקמה היטב. השתמש גיליון סיליקון עבה 0.5 מילימטר עם 10 מילימטר חתכים עגולים כדי לפזר את הפצעים פתוחים ולאבטח את התקופות עם תפרים משי מופרע 4/0. לאחר מכן מניחים את העכברים על כרית חום עם ניטור עד להחלמה מלאה, לפני החזרה לכלוב האישי שלה, מתן מגבות נייר כחומר קינון נוסף במשך שבועיים.
למחרת, להחיל גם לשלוט שטויות קטן מפריע ג'ל RNA או ניסיוני קטן מפריע Keap1 ג'ל על החלק העליון של הפצע של כל בעל חיים לעטוף כל פלג גוף עליון עם רוטב סרט שקוף כדי לשמור על הג'ל במקום תוך השארת הגפיים חופשיות. ביום השלישי של הניסוי, לטעון מזרק מילימטר אחד מצויד מחט 27 מד עם פתרון L-012 מוכן טרי לעטוף את המזרק כדי להגן על הפתרון מפני אור. כדי לדמיין את הפצעים, הסר בעדינות את רוטב הסרט השקוף מכל אחד מהעכברים מבלי להפריע לפצעים והכנס את העכברים לתא ההדמיה של מערכת הדמיה ביולומינציה.
הגדר את זרימת מערכת ההדמיה ואת רמות החמצן בתא אינדוקציה לליטר אחד לדקה ותדמיין את העכברים על ידי ביולומינציה ושדה בהיר בבסיס. לאחר מכן, לנגב את הבטן עם מגבונים אלכוהול ואז להזריק חמישה מיליגרם של פתרון L-012 לכל 200 גרם משקל גוף, IP, לתוך כל עכבר פעם האלכוהול התייבש. הזרקת פתרון L-012 מבלי להפריע לפצעים על העור הגבי היא קריטית, כי כל עיוות ישפיע על מסלול ריפוי הפצע ופרשנות הנתונים.
ודא כי החיה היא בבטחה בהפוגה הגבית לפני הזריקה. מיד לאחר ההזרקה, החזירו את העכברים למקומם בתא ההדמיה ודמיינו את בעלי החיים במשך דקה אחת כל ארבע דקות במשך 60 דקות, והגדירו את הפצע 10 מילימטר כאזור העניין בקביעת רמת מיני החמצן תגובתי. לאחר מכן מניחים את העכברים על כרית חום עם ניטור עד החלמה מלאה לפני החזרת בעלי החיים לכלובים האישיים שלהם.
שלושה ימים לאחר יצירת פצעים דו-צדדיים על פי מודל הפצע כריתה הוקמה, אין bioluminescence נצפתה לפני הזרקת L-012. בעקבות הזרקת פתרון L-012 תוך-אישית, ביולומינציה נצפית באזורי הפצע שבהם מזוהים מיני חמצן תגובתי. הקלטת הביולומינציה במשך דקה אחת כל ארבע עד חמש דקות במהלך 60 דקות מדגימה את הרוויה הביולומינסנטית של אזור העניין לאורך זמן, עם זמן ההדמיה האופטימלי להגיע לרוויה L-012 מלאה שנצפתה בערך 50 דקות.
הביולומינציה בכל אזור פצע של עניין לפני ואחרי הזרקת L-012 לתוך שטויות RNA מפריע קטן מטופלים או Keap1 עכברים קטנים מפריעים RNA מטופלים אז ניתן לחשב על ידי חלוקת הספירה הכוללת של עוצמת האור על ידי האזור. ניתוח של יום 10 מקטעי רקמת פצע כדי לאשר את הדיוק של מדידת רמת מיני חמצן תגובתי על ידי כתמי H&E מגלה חדירה תאית מופחתת לפצעים קטנים המפריעים Keap1 מטופלים בהשוואה לרקמות קטנות שטופלו בשטויות מפריעות, מה שמצביע על מורפולוגיה דלקתית מופחתת בבעלי החיים הניסיוניים שטופלו בג'ל. ניתוח האימונו-תגובתיות של F4/80, סמן מקרופאג חלבון על מקטעי רקמת פצע, מצביע על מספר מופחת של מקרופאגים בפצעים קטנים שטופלו ב- Keap1 בהשוואה לפצעים קטנים שטופלו בשטויות מפריעות, מה שמדגיש עוד יותר את תוקפה של שיטה זו.
בעת ניסיון הליך זה, הקפד לאשר L-012 לא פג ולעורר את הפתרון במקום מוגן מפני אור. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בבדיקות ממוקדות ובשיטות מבוססות אימונו-בדיקה כדי לחקור את לוקליזציה תת-תאית של מיני חמצן תגובתי ואת קורלציה שלהם, המאפשר הערכה מהירה של התערבויות ומנגנונים המשפיעים על הנתונים הסטטיסטיים redux של פצעים.
