אנו מודים ננסי Papalopulu ואת בויאן Bonev לסיוע עם electroporation Xenopus. אנו מודים גם מארק את דיון על קריאה ביקורתית, ג&#39;רמי גרין וג&#39;ון שוולינגפורד לדיונים וחברי מועיל של המעבדה ליו על תמיכתם. עבודה זו מומנה על ידי תרומות של BBSRC (BB/E013872/1) ואת האמון Wellcome (081880/Z/06/Z) כדי KJL.

חלק 1 א. ציוד מיקרוסקופ: היקף סטריאו לנתח זקוף במטרה צריכת חשמל נמוכה <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתח / Pulse Generator: BTX ECM 830 מערכת כיכר electroporation Wave </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה חולץ: P-87 micropipette פולר (החברה סאטר Instrument, CA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Manipulator: גס, או בשילוב גס קנס תלוי בהכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעל micropipette: כלים המדע פיין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודה: תוצרת בית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporation קאמרית: תוצרת בית </li></ul> בצורת אלקטרודות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור 8 ס&quot;מ של טוהר גבוהה 0.4 מ&quot;מ תיל טונגסטן (גודפלו) ו להטביע את נקודת האמצע מזרק 1ml באמצעות מרק (אנו משתמשים Blu-Tack). השאירו 4 טונגסטן ס&quot;מ חוט חשוף מקצה המזרק ואת קצה לכופף לצורה-L, 1 ס&quot;מ מהקצה (איור 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיתוך קצה, כך בסופו של דבר באמצעים 0.5 מ&quot;מ אורך. Tהטיפ שלו הוא הסופית אלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלה מקבילה עודף תיל טונגסטן כדי מזרק ולהשתמש בו כדי לחבר את מחולל דופק אלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך קבלת זוג אלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף אלקטרודות מחולל גל מרובע הדופק באמצעות כבלים DC. </li></ol> Electroporation קאמרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השורה התחתונה של צלחת 90 ​​מ&quot;מ עם פלסטלינה ~ 5 רעיל מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו צלחת עם התקשורת electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש מס &#39;5 מלקחיים של שען לגלף היטב בצורת האות T (איור 2). גם ארוך צריך למדוד ~ 2 מ&quot;מ x 2 מ&quot;מ x 10 מ&quot;מ קצר ~ 2 מ&quot;מ x 2 מ&quot;מ x 5 מ&quot;מ. המנה electroporation ניתן לכבס ולעשות בהם שימוש חוזר. </li></ol> חלק 1B. ריאגנטים דנ&quot;א או מקרומולקולות טעונה <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropipettes: 1 מ&quot;מ רחב 4 &quot;ארוך בורוסיליקט זכוכית נימים (WPI, TW100-F) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התקשורת: רגיל אמפיבי מדיה (NAM) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &gt; 10 X במלאי: 1100 mM NaCl, 20KCl mM, 10 mM Ca (NO 3) 2 • 4H 2 O, 1 mM EDTA. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 X NAM: מדולל מתוך המאגר 10x מניות, עם 0.1 מ&quot;מ NaHCo 3 ו - 0.2 mM Na 3 PO 4. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Xenopus laevis ראשנים, שלב 28 </li></ul> ה-DNA הכנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פלסמידים ביטוי תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend DNA לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / μl ב nuclease חינם H 2 0. </li></ol> * יש לנו הצלחה עם וקטורים המכיל מקדם חזק CMV, כגון pCS2 + [16]. לניתוח השושלת, אנחנו בדרך כלל כוללים DNA קידוד חלבון הפלואורסצנט הירוק (GFP pCS2 +) בריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / μl. [ריכוזי ה-DNA בין 0.1-3 מיקרוגרם / μl נבדקו גם. מצאנו כי ריכוזים מתחת 0.8 מיקרוגרם / μl תאים שכותרתו יעיל, בעוד ריכוזי DNA יותר מ 2 מיקרוגרם / &amp; Mu; אני לא לשפר את יעילות electroporation]. Morpholino oligonucleotide הכנה: (הערה:. MOS צריך להיות fluoresceinated (3&#39;-carboxyfluorescein שונה) או טעונים אחרת) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend morpholino oligonucleotides (MOS) (Genetools, <a href="http://www.genetools.com" target="_blank">www.genetools.com</a> ) בריכוז של 2 מ&quot;מ ב nuclease חינם H 2 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot חום של פתרון המניה ב 65 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הריכוז הסופי של mM 0.5 במים nuclease חינם. </li></ol> * 0.1-1mm MO פתרונות נבדקו. 0.5 mM פתרונות MO היו מספיק electroporation של תאים mesenchymal רבים. Micropipettes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן micropipettes מ בורוסיליקט זכוכית נימים (1 מ&quot;מ רוחב, 4 &quot;ארוך, WPI לא. TW100-F). השתמש חולץ מחט להכין micropipettes עם להתחדד ארוך 8-12 מ&quot;מ טיפ נאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראש קצה ~ 2 מ&quot;ממקצה באמצעות מלקחיים, יצירת לשבור משוננים. </li></ol> מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקשורת דגירה: הכן טרי 3 / 4 רגילה אמפיבי מדיה (NAM) ממלאי 1x. הוסף 0.025 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​gentamycin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקשורת electroporation: כאמור לעיל, עם 0.1% בנזוקאין (סיגמא, 06950). </li></ol> 2. Electroporation Micropipette ההתקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו micropipette עם פתרון 1 ~ הזרקת μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure micropipette ב micromanipulator ומתחברים microinjector (Picospritzer II). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זווית micropipette ב 50 ° מן השולחן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הלחץ הזרקה ב 20 PSI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיול micropipette להזריק 30 nl לכל הדופק. </li></ol> ראשן הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי 28 הבמה הזחלים Xenopus ידי דוגרים בתקשורת electroporation במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הראשנים מרדים לתוך תא electroporation מלא התקשורת electroporation. מיקום העוברבתוך הארוך גם כך הראש נח צומת הטי עם הצד הגבי למטה בצד הגחון חשוף. הראש צריך להיות מוגבה מעט לעומת הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, בעדינות מאובטח הראשן היטב עם הסובבים פלסטלינה. (הערה:.. אם הראשן אינו מאובטח, הוא עשוי להתעוות מגע אלקטרודה במהלך electroporation במקרה זה לבטל את ראשן כמו רקמות הפנים ייפגעו קשות) </li></ol> Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת טיפ micropipette האחורי מיד בלוטת מלט לתוך mesenchyme הפנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 30 פתרון nl לתוך mesenchyme. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropipette לסגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות ליישר טיפים אלקטרודה במקביל הראש של העובר (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 8 50 ms, קטניות 20mV רבועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסגת אלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים ובזהירות לשחרר הראשן מבאר ולהעביר 3 / 4 NAM, 0.025 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​gentamycin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הראשנים ניתן מודגרות ב 3 / 4 NAM, 0.025 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​overnight, או יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך עוברים electroporation יעיל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר 24 שעות. </li></ol> 3. נציג תוצאות: השימוש מולקולות ניאון מאפשר סינון קל של עוברים electroporated. איור 4 מראה טיפוסי של אצווה MO electroporated הראשנים ~ 12, 48 ו - 96 שעות לאחר electroporation, מודגרות על 14.5 ° C. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, MOS ניתן דמיינו מיד לאחר electroporation ו להימשך מספר ימים לאחר electroporation. מניסיוננו, הקרינה מתבטא בחולשה בשלב 46 (~ 5 ימים לאחר מכן). ב סחוסים, הקרינה פוחתת באופן דרמטי לאחר תחילת התמיינות (~ רח&#39; 42), אולם MO הקרינה נמשכת חזק יותר סוגי תאים אחרים כגון האנדודרם בלוע. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מראה כי oligonucleotides משולבות רקמות craniofacial מספר כולל סחוס. Oligonucleotide פלואורסצנציה גלעתים קרובות להיות דמיינו ברקמות משני צדי הראש. זהו כנראה עקב דיפוזיה מהירה של הפתרון הזרקת ברחבי mesenchyme craniofacial משוחרר לפני electroporation. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig1.jpg" /> איור 1 אלקטרודות ביתי. בצורת תיל טונגסטן מצורף מזרק 1 מ&quot;ל באמצעות חומר רעיל או מרק. (א) אלקטרודה הסופית אמצעים 5 מ&quot;מ. (ב) צרף זוג אלקטרודות, כך Termini לרוץ במקביל. אלקטרודות מחוברות על ידי גנרטור הדופק כבלים DC. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig2.jpg" /> איור 2 קאמרית electroporation. (א) 90 מ&quot;מ צלחת מרופדת פלסטלינה מלא מדיה תא T בצורת חרוט עם מלקחיים לא שען של 5. (ב) צד ארוך צעדים 2 מ&quot;מ X 2 מ&quot;מ X10 מ&quot;מבעוד צעדים קצרים 2 מ&quot;מ X 2 מ&quot;מ X 5 מ&quot;מ. ראש העובר מונח בצד, T-בצומת עד הגחון. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig3.jpg" /> איור 3 הממחישות סכמטי הליך electroporation. 28 סנט הראשן ממוקם בתא electroporation, בצד הגחוני למעלה. Micropipette מוכנס לתוך הפנים בלוטת מלט הבסיסית mesenchyme. להזריק. Micropipette יוסר בצורת אלקטרודות מיושרים במקביל משני צדי הראש. החל eight 50 מילישניות, 20 mV פולסים מרובעים. לסגת אלקטרודות. לגדל ראשנים לשלבים הרצוי. Visualise MOS או ביטוי של GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig4.jpg" /> איור 4 ראשנים נציג 12 (א), 48 (ב) ו 96 (ג) שעות electroporation פוסט (שלבים 30, 34 ו 44 בהתאמה). (&quot;-B&quot;) פלורסנט MO ניתן דמיינו בתוך mesenchyme craniofacial בבית צביes 30 ו 34. Fluorescence ניתן להבחין סחוסים בשלב 44 (ראש חץ, C&#39;-C &quot;). במעיים היא autofluorescent מאוד.

<ol>
	<li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis.">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev. Cell. 20, 19-32 (2011).</li><li>Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li><li>Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+RNA+interference+in+post-implantation+mouse+embryos+using+directional+electroporation+and+whole+embryo+culture.">Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture.</a> Differentiation. 72, 92-102 (2004).</li><li>Drinjakovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+ligase+Nedd4+promotes+axon+branching+by+downregulating+PTEN.">E3 ligase Nedd4 promotes axon branching by downregulating PTEN.</a> Neuron. 65, 341-357 (2010).</li><li>Falk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC. Dev. Biol. 7, 107-107 (2007).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Electroporation+in+vivo+within+the+Intact+Developing+Brain.">Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain.</a> J. Vis. Exp. (17), e705-e705 (2008).</li><li>Kuriyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tsukushi+controls+ectodermal+patterning+and+neural+crest+specification+in+Xenopus+by+direct+regulation.">Tsukushi controls ectodermal patterning and neural crest specification in Xenopus by direct regulation.</a> of BMP4 and X-delta-1 activity. Development. 133, 75-88 (2006).</li><li>Mende, M., Christophorou, N. A., Streit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+effective+gene+knock-down+in+early+chick+embryos+using+morpholinos+but+not+pRFPRNAi+vectors.">Specific and effective gene knock-down in early chick embryos using morpholinos but not pRFPRNAi vectors.</a> Mech. Dev. 125, 947-962 (2008).</li><li>Neumann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> Embo. J. 1, 841-845 (1982).</li><li>Price, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+motor+neuron+pool+sorting+by+differential+expression+of+type+II+cadherins.">Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins.</a> Cell. 109, 205-216 (2002).</li><li>Grossin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+gene+transfer+into+rat+articular+cartilage+by+in+vivo+electroporation.">Direct gene transfer into rat articular cartilage by in vivo electroporation.</a> Faseb. J. 17, 829-835 (2003).</li><li>Khoury, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+on+intra-articular+versus+systemic+gene+electrotransfer+in+experimental+arthritis.">A comparative study on intra-articular versus systemic gene electrotransfer in experimental arthritis.</a> J. Gene. Med. 8, 1027-1036 (2006).</li><li>Takahashi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+cathepsin+K+in+synovium+leads+to+progression+of+osteoarthritis+in+rabbits.">Down-regulation of cathepsin K in synovium leads to progression of osteoarthritis in rabbits.</a> Arthritis. Rheum. 60, 2372-2380 (2009).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Wheeler, G. N., Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+vertebrate+models+for+chemical+genetics+and+drug+discovery+screens:+lessons+from+zebrafish+and+Xenopus.">Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: lessons from zebrafish and Xenopus.</a> Dev. Dyn. 238, 1287-1308 (2009).</li><li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate.">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes. Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li></ol>

המחברים אין ניגוד אינטרסים.

בסרטון הזה, אנחנו הדגימו את ההיתכנות של משלוח electroporation בתיווך גנים לתוך mesenchyme הפנים של Xenopus ראשנים. בגישה זו, אנו יכולים לעקוף את השפעות ההתפתחות המוקדמים של מניפולציה תפקוד הגן מאפשר לנו למקד רקמות ספציפיות בנקודות זמן מאוחר יותר. המחקרים שלנו מראים כי באוכלוסיות הטרוגנית של תאים mesenchymal craniofacial יכול להיות מושפע, מאפשר לנו לבחון את שושלת היוחסין של תאים electroporated כמו גם דרישות אוטונומי התא חלבונים של עניין. בשילוב עם הדמיה לחיות, אנחנו יכולים להשתמש בגישה זו כדי לחקור תפקוד גנים, במשך הזמן, במהלך ההתפתחות craniofacial. שיטה זו מדגישה את הרומן נהילות של Xenopus לחקר organogenesis. אנו צופים כי בשיטה זו ניתן להתאים באופן כללי ללמוד המורפוגנזה והבחנה של רקמות אחרות.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3381">Electroporation of Craniofacial Mesenchyme</a>. There was an incorrect unit used for the voltage.

Erratum: Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

electroporation of craniofacial mesenchyme

Electroporation היא שיטה יעילה של אספקת DNA ו מקרומולקולות טעונים אחרים לרקמות בנקודות זמן מדויק במקומות מדויקים. לדוגמה, electroporation שימש בהצלחה רבה ללמוד ההתפתחות העצבית ואת רשתית ב Xenopus, עוף עכבר 1-10. עם זאת, חשוב לציין כי כל המחקרים הללו, החוקרים לא היו המיקוד הרקמות הרכות. כי אנו מעוניינים בפיתוח craniofacial, התאמנו שיטה למקד mesenchyme הפנים. כאשר חיפשנו את הספרות, גילינו, להפתעתנו, דיווחים מעטים מאוד מוצלח של העברת גנים לתוך רקמת סחוס. רוב המחקרים הללו היו מחקרים ריפוי גנטי, כגון משלוח siRNA או החלבון לתוך שורות תאים chondrogenic, או במודלים של בעלי חיים של דלקת פרקים 11-13. במערכות אחרות, כגון עוף או עכבר, electroporation של mesenchyme הפנים כבר מאתגר (communicat אישייונים, מחלקת פיתוח Craniofacial, KCl). החוקרים שיערו כי electroporation לרקמות procartilaginous ו סחוסי ב Xenopus יכול לעבוד טוב יותר. במחקרים שלנו, אנו מראים כי העברת גנים לתוך סחוסים הפנים מתרחשת ביעילות בשלבים מוקדמים (28), כאשר primordium הפנים מורכבת עדיין של רקמות רכות לפני בידול הסחוס. Xenopus היא מערכת החולייתנים נגיש מאוד לניתוח של פיתוח craniofacial. מבנים Craniofacial הם בקלות רבה יותר גלוי Xenopus מאשר כל מודל חוליות אחרים, בעיקר משום עוברי Xenopus הן מופרות באופן חיצוני, דבר המאפשר ניתוח בשלבים המוקדמים, והקלה על הדמיה ברזולוציה לחיות תא בודד, כמו גם שימוש חוזר של 14 אמהות. בין הדגמים חוליות פיתוח חיצונית, Xenopus שימושית יותר לניתוח craniofacial מאשר דג הזברה, כמו זחלים Xenopus הם גדולים יותר, קל יותר dissect, ובאזור הפנים פיתוח נגיש יותר מאשר באזור הדמיה המקבילה דגים. בנוסף, Xenopus היא אבולוציונית קרוב יותר לבני אדם מאשר דג הזברה (~ 100 מיליון שנה קרובה) 15. לבסוף, בשלבים אלה, ראשנים Xenopus הם שקופים, והביטוי מקביל של חלבונים או מולקולות ניאון תאפשר ראיה קל של הסחוסים מתפתחות. אנו צופים כי גישה זו תאפשר לנו במהירות וביעילות מבחן מולקולות מועמד במערכת מודל vivo.

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation of Craniofacial Mesenchyme at JoVE.com

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

הסחוסים Craniofacial לפתח בקשר הדוק עם רקמות אחרות וקשה לתפעל חיות לחיות. אנחנו משתמשים electroporation לספק כלים מולקולריים במהלך הצמיחה של השלד craniofacial תוך עקיפת תופעות העוברית המוקדמת. גישה זו תאפשר לנו לבחון ביעילות מולקולות מועמד<em&gt; In vivo.</em

Electroporation של Mesenchyme Craniofacial

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

electroporation-of-craniofacial-mesenchyme

Research

JoVE Journal

Biology

11.8K Views.  King's College London. הסחוסים Craniofacial לפתח בקשר הדוק עם רקמות אחרות וקשה לתפעל חיות לחיות. אנחנו משתמשים electroporation לספק כלים מולקולריים במהלך הצמיחה של השלד craniofacial תוך עקיפת תופעות העוברית המוקדמת. גישה זו תאפשר לנו לבחון ביעילות מולקולות מועמד In vivo.

Video: Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Electroporation של mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

ה-DNA transfection של שרירי השלד היונקים באמצעות In vivo Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

הערכת נכסים איתות של Ectodermal epithelia במהלך פיתוח Craniofacial

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Assay Explant להערכת התנהגות ניידת של mesenchyme הגולגולת

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

מחיקות Gene הגנום ב<em&gt; סטרפטוקוקוס sanguinis</em&gt; על ידי תפוקה הגבוהה PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

הפרדת אקטודרם עכבר העוברי פן וmesenchyme

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

ויזואליזציה של Craniofacial פיתוח בsox10: קאאד מהונדס דג הזברה הקו באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

תרבויות אלטרנטיבי לפלוריפוטנטיים אנושיים לתאים גזע ייצור, תחזוקה וניתוח גנטי

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

הערכת תרומות מינים ספציפיות כדי Craniofacial פיתוח באמצעות מפלצות שליו-ברווז

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...