我々はアフリカツメガエルのエレクトロポレーションの支援のためのナンシーPapalopuluとBoyan Bonevに感謝しています。我々はまた彼らのサポートのために劉ラボの有用な議論とメンバーのための重要な読書、ジェレミーグリーンとジョンウォーリング用マークディオンヌに感謝。この作品は、BBSRC（BB/E013872/1）とウェルカムトラスト（081880/Z/06/Z）からKJLへの補助金によって賄われていた。

部分1A。機器の 顕微鏡：低消費電力を目的とした直立ステレオ解剖範囲<ul><li> 電圧/パルスジェネレータ：BTX ECM 830方形波のエレクトロポレーションシステム</li><li> ピペットプラー：P - 87マイクロピペットプラー（サッターのインストゥルメント社、カリフォルニア州） </li><li> マニピュレータ：準備に応じて粗い、または複合粗調整と微。 </li><li> マイクロピペットホルダー：ファイン科学ツール</li><li> 電極：手作り</li><li> エレクトロポレーションチャンバー：手作り</li></ul> L字型電極： <ol><li>高純度の8センチメートル0.4mmのタングステン線（グッドフェロー）と中間点に貼ってカットパテを（我々はBlu -タックを使用）を使用して1ミリリットル注射器。 L字状にシリンジと曲げ先端の先端から露出して4cmのタングステン線を残し、最後から1cm（図1A）。 </li><li>端の長さが0.5ミリメートルを測定するように先端をトリミング。 T彼の先端が電極の末端です。 </li><li>注射器への過剰なタングステン線を平行に実行し、電極のパルス発生器を接続するためにそれを使用。 </li><li>一対の電極を作るプロセスを繰り返します。 </li><li> DCケーブルを介して方形波のパルス発生器に電極を取り付けます。 </li></ol>エレクトロポレーションチャンバー<ol><li> 〜5 mmノン毒性粘土で90 mmディッシュのラインの底。 </li><li>エレクトロポレーションメディアで皿を埋める。 </li><li>第5号時計メーカーの鉗子を使用すると、T字型だけでなく（図2）を彫る。長いもは〜2 × 2mmの× 10 mmと短い〜2 × 2mmの× 5 mmを測定する必要があります。エレクトロポレーション皿を洗浄し、再利用することができます。 </li></ol>パート1B。試薬 DNAまたは荷電高分子<ul><li> マイクロピペット：1 mm幅4&quot;長いホウケイ酸ガラス毛細管（WPI、TW100 - F） </li><li> 文化メディア：ノーマル両生類メディア（NAM） </li><li> &gt; 10 X株式：1100 mMのNaCl、20mMのKCl、10mMのカルシウム（NO 3）2•4H 2 O、1mMのEDTA。 <ul><li> 4℃でオートクレーブと店舗</li><li> 1 X NAM：0.1mMのNaHCO 3及び0.2mMののNa 3 PO 4で10倍株式、バッファから希釈します。 </li></ul></li><li> アフリカツメガエルのオタマジャクシ、ステージ28 </li></ul> DNAの調製： <ol><li>標準プロトコルを使用して発現プラスミドを準備します。 </li><li>ヌクレアーゼフリーH 2 0での1μg/μlの最終濃度にDNAを再懸濁します。 </li></ol> *我々は、このようなpCS2などの強力なCMVプロモーターを含むベクター、成功させている+ [16]。系統解析のために、我々は、通常は0.1μg/μlの最終濃度で、緑色蛍光タンパク質（pCS2 + GFP）をコードするDNAが含まれています。 0.1から3μg/μLの間に[DNAの濃度も試験した。我々は発見した0.8μ​​g/μLの非効率的に標識された細胞以下の濃度、DNA濃度に対し、より大きい濃度2μg/ A＆MU、Lは、エレクトロポレーションの効率を改善しなかった]。 モルホリノオリゴヌクレオチドの準備： （注：MOSは、フルオレセインする必要があります（3&#39; -カルボキシ変更された）またはそうでなければご利用いただけます。） <ol><li>再懸 ​​濁し、モルフォリノオリゴヌクレオチド（MOS）（Genetools、 <a href="http://www.genetools.com" target="_blank">www.genetools.com</a>ヌクレアーゼフリーH 2 0 2 mMの濃度で）。 </li><li> 65℃原液の熱のアリコート℃で5分間。 </li><li>ヌクレアーゼフリー水で0.5mMの最終濃度に希釈する。 </li></ol> * 0.1 - 1mMのMOソリューションを試験した。 0.5mMのMOソリューションは、多くの間葉細胞のエレクトロポレーションするのに十分だった。 マイクロピペット<ol><li>ホウケイ酸ガラス毛細管（幅1 mmの4&quot;長い間、WPIない。TW100 - F）からマイクロピペットを準備します。8-12 mm長テーパーと細かいチップでマイクロピペットを準備するためにニードルプラーを使用してください。 </li><li>クラッシュの先端約2 mm先端から、ピンセットを使ってギザギザの休憩を作成する。 </li></ol>メディアの<ol><li>インキュベーションメディア：1X在庫から新鮮な4分の3ノーマル両生類メディア（NAM）を準備。 0.025 mg / mlのゲンタマイシンを追加。 </li><li>エレクトロポレーションメディア：上記のように、0.1％ベンゾカイン（シグマ、06950）。 </li></ol> 2。エレクトロポレーションマイクロピペットのセットアップ<ol><li> 〜1μL注入液でマイクロピペットを埋める。 </li><li>マイクロマニピュレータにマイクロピペットを固定し、マイクロインジェクター（Picospritzer II）に接続します。 </li><li>卓上から50 °の角度をマイクロピペット。 </li><li> 20 PSIにおける射出圧力を設定します。 </li><li>パルスあたり30 NLをインジェクトするためにマイクロピペットを較正します。 </li></ol>オタマジャクシの準備<ol><li> 5分間エレクトロメディアでインキュベートすることにより、ステージ28 アフリカツメガエルの幼虫を麻酔。 </li><li>エレクトロポレーションメディアで満たされたエレクトロポレーションチャンバーに麻酔オタマジャクシを移す。位置の胚長い内でもそう頭が背側を下にして露出した腹側とのT字路にかかっている。頭は少し尾に比べて上昇する必要があります。 </li><li>鉗子を使用して、静かに粘土を囲むとうまくでオタマジャクシを確保する。 （注：おたまじゃくしが保護されていない場合、それがけいれんし、エレクトロポレーション中に電極を接触する可能性がある顔の組織が著しく損傷されるので、この場合にはオタマジャクシを破棄。。） </li></ol>エレクトロポレーション<ol><li>セメント腺のすぐ後方マイクロピペットの先端を挿入し、顔の間充織に。 </li><li>間充織に30 nlのソリューションを注入。 </li><li>マイクロピペットを引っ込めます。 </li><li>すぐに胚の頭部（図3）に平行電極チップの位置を合わせます。 </li><li> 8 50ミリ秒、20mVの方形パルスを印加して下さい。 </li><li>電極を引っ込めます。 </li><li>鉗子を使用すると、慎重に井戸からオタマジャクシを放すと3 / 4にNAM、0.025 mg / mlのゲンタマイシンを転送する。 </li><li>オタマジャクシ3 / 4 NAM、0.025 mg / mlのovernでインキュベートすることができます。IGHT、またはより長い。 </li><li> 24時間後に蛍光顕微鏡法による効率的なエレクトロポレーションのための画面の胚。 </li></ol> 3。代表的な結果： 蛍光分子の使用は、エレクトロポレーション胚の簡単なスクリーニングを可能にします。図4は、14.5でインキュベートしたMOエレクトロオタマジャクシ〜12、48、エレクトロポレーション後96時間の典型的なバッチ、℃を示しています。蛍光顕微鏡を使用して、MOは直ちにエレクトロポレーション後可視化し、エレクトロポレーション後の数日間持続することができます。我々の経験では、蛍光はステージ46（〜5日後）に弱く明らかである。軟骨では、蛍光は分化の開始（〜ST 42）の後に劇的に減少するが、MO蛍光は咽頭内胚葉などの他の細胞型においてより強く保持されます。蛍光顕微鏡は、オリゴヌクレオチドは、軟骨を含むいくつかの頭蓋顔面の組織に組み込まれていることを示しています。オリゴヌクレオチド蛍光C多くの場合、頭部の両側にある組織で可視化される。これはおそらく、エレクトロポレーションの前に緩んで頭蓋間充織全体に注射液の急速な普及によるものです。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig1.jpg" /> 1自家製の電極を示しています。 L字型のタングステン線は、非毒性の粘土やパテを使用して、1mlのシリンジに接続されています。 （A）電極の末端は、5 mmを測定します。 （B）末端を並列実行するように、一対の電極を取り付けます。電極は、DCケーブルによるパルス発生器に接続されています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig2.jpg" /> 2エレクトロポレーションチャンバーを示します 。 （）プラスティと並ぶ90 mmのディッシュは、メディアおよびNo 5の時計メーカーの鉗子が刻まれたT字型のチャンバーで満たされている。 （B）長辺が2mmを計測するX 2ミリメートルX10ミリメートル短期対策2ミリメートルX 2㎜× 5ミリメートルをしながら。胚の長は、T字路、腹側にかかっている。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig3.jpg" /> エレクトロポレーションの手順を示す3の回路図 。聖28オタマジャクシは、腹側が上、エレクトロポレーションチャンバー内に配置されます。マイクロピペットは、顔の間充織基盤となるセメント腺に挿入されます。注入する。マイクロピペットは、削除され、L字型の電極が平行にヘッドを隣接配置されます。 eight 50ミリ、20 mVの方形パルスを印加して下さい。電極を引っ込めます。希望するステージにオタマジャクシを育てる。 MOをや蛍光顕微鏡法を用いてGFPの発現をVisu​​alise。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig4.jpg" /> 図4代表的なおたまじゃくし12（）、48（B）、および96（C）時間後にエレクトロポレーション（ステージ30、34とそれぞれ44）。 （A&quot;- B&quot;）蛍光MOはクワガタで頭蓋間充織の中で可視化することができます。ES 30〜34。蛍光は、ステージ44（矢じり、C&#39;- C&quot;）で、軟骨で検出することができます。腸が非常に自家蛍光である。

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	<li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis.">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev. 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L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate.">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes. Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li></ol>

著者らは、利害の衝突はありません。

このビデオでは、我々はアフリカツメガエルのオタマジャクシの顔の間充織にエレクトロを介した遺伝子デリバリーの実現可能性を実証している。このアプローチを使用して、我々は、私たちは後の時点で特定の組織をターゲットにすることができます遺伝子の機能を操作するの初期の発達の影響を回避することができます。我々の研究は、私たちはエレクトロポレーションした細胞だけでなく、関心のタンパク質の細胞自律的な要件の系統を検討できるように、頭蓋顔面間葉系細胞の異種集団に影響を与える可能性があることを示している。ライブイメージングと組み合わせることで、我々は、頭蓋顔面の開発中に、時間をかけて、遺伝子機能を研究するためにこのアプローチを使用することができます。この新規な方法は、器官形成の研究のためのアフリカツメガエルの従順さを強調。我々は、このメソッドが広くだけでなく、他の組織の形態形成と分化を研究するために適合させることができることを期待しています。

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Erratum: Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

electroporation of craniofacial mesenchyme

エレクトロポレーションは、正確な時間の点で組織にし、正確な位置でDNAと他の荷電高分子を提供する効率的な方法です。例えば、エレクトロポレーションは、 アフリカツメガエル 、ニワトリとマウス1-10に神経や網膜の開発を研究するために大きな成功を収めて使用されています。しかし、これらの研究のすべてで、調査官は軟部組織をターゲットにされていないことに注意することが重要です。我々は頭蓋顔面の開発に興味を持っているので、我々は、顔の間充織を対象とする手法を適応した。 我々は文献を検索するときに、我々は、私たちの驚きに、軟骨組織に成功した遺伝子導入の非常に少数の報告を発見した。これらの研究の大半はこのような軟骨細胞株へのsiRNAやタンパク質の配信、または、関節炎11月13日の動物モデルとしての遺伝子治療の研究であった。このようなニワトリやマウスなど他のシステム、、で顔面間葉のエレクトロポレーションは、挑戦されています（個人的なcommunicatをイオン、頭蓋顔面の開発の部門、KCL）。我々はアフリカツメガエルにおけるprocartilaginousと軟骨組織へのエレクトロポレーションはよりよく働くかもしれないという仮説を立てた。我々の研究では、我々はその顔の軟骨への遺伝子導入は、顔面原基がまだ前の軟骨分化への軟部組織から構成されている初期段階（28）、で効率的に起こる示す。 アフリカツメガエルは、頭蓋顔面開発の分析のための非常にアクセス可能な脊椎動物のシステムです。 アフリカツメガエルの胚が初期段階の分析を可能にする、外部から受精、そしてライブ単一細胞の解像度でのイメージングだけでなく、母親14の再利用を促進しているので、顎顔面の構造は、より容易に目に見えるアフリカの他の脊椎動物のモデルに比べて、主に。 アフリカツメガエルの幼虫はディに大きくしやすいように、外部の開発脊椎動物のモデルの中で、 アフリカツメガエルは 、ゼブラフィッシュより顔面分析のために、より便利です。ssect、および発展途上顔領域は、魚に相当する領域よりもイメージングによりアクセス可能です。さらに、 アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ（〜100万年近い）15よりヒトへの進化的に近いです。最後に、これらの段階で、 アフリカツメガエルのオタマジャクシは透明であり、蛍光タンパク質や分子の同時発現は、発展途上軟骨の容易な視覚化が可能になります。我々は、このアプローチは、私たちは迅速かつ効率的にin vivoモデル系での候補分子をテストできるようになると期待しています。

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Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

頭蓋顔面軟骨は他の組織と緊密に連絡を開発し、生きている動物で操作するのが難しいです。我々は、初期胚の影響を迂回しながら顎顔面骨格の成長中に分子ツールを提供するためにエレクトロポレーションを使用しています。このアプローチは、私たちは効率的に候補分子をテストすることができます<em&gt;生体インチ</em

顔面間葉のエレクトロポレーション

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

electroporation-of-craniofacial-mesenchyme

Research

JoVE Journal

Biology

11.8K ビュー.  King's College London. 頭蓋顔面軟骨は他の組織と緊密に連絡を開発し、生きている動物で操作するのが難しいです。我々は、初期胚の影響を迂回しながら顎顔面骨格の成長中に分子ツールを提供するためにエレクトロポレーションを使用しています。このアプローチは、私たちは効率的に候補分子をテストすることができます生体インチ

ビデオ: Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

抗酸菌のエレクトロポレーション

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

生物学

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

頭蓋顔面の開発時には外胚葉上皮のシグナリング特性を評価する

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

ニワトリ胚の網膜におけるOVOエレクトロポレーションに

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

頭蓋間葉の細胞挙動を評価するための外植片アッセイ

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

マウス胚性外胚葉顔と間葉の分離

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

SOX10中の顔面の開発の可視化：楓トランスジェニックゼブラフィッシュラインタイムラプス共焦点顕微鏡を用いて

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

4D共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュにおける顔面形態形成を分析する

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

ヒト多能性のための代替培養はセル生産、メンテナンス、および遺伝子解析幹

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

ウズラ·アヒルキメラを使用して顔面発展に種特異的な貢献を評価する

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...