פרוטוקול זה מספק הבנה רבת פנים של הפעלת תהליכי מוות תאי, אשר יכולה לספק תובנות קריטיות לגבי מנגנוני מחלה וליידע אסטרטגיות טיפוליות. פרוטוקול זה מסתמך על שימוש בטכניקה פשוטה יותר וכדי לגשת להפעלה של קספזות מרובות הכרחיות מאוכלוסייה אחת של תאים אנדוגניים כדי לקבוע במידה רבה את ההפעלה. מוות מולד של תאי מערכת החיסון היה מעורב בכל ספקטרום המחלות, מזיהומים, דרך מחלות דלקתיות ועד סרטן.
הבנת המנגנונים המולקולריים של מוות תאי באמצעות הפעלת קספז יכולה לספק תובנות קריטיות על תהליכי מחלה. ד"ר ג'וליאן, עמיתת מחקר פוסט-דוקטורנטית ממעבדה, תדגים את ההליך. לאחר בידוד מח העצם והבחנה BMDMs, להדביק את התאים עם וירוס שפעת A.
חשב את נפח הנגיף הדרוש בריבוי זיהום של 20 יחידות יוצרות פלאק. הסר את המדיה מן BMDMs ולשטוף את התאים פעם אחת עם 500 מיקרוליטר של PBS. הוסף 450 מיקרוליטר של וירוס שפעת A ב- DMEM גלוקוז גבוה ללא FBS מומת חום לכל באר, ודגר על הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת באינקובטור לח כדי לאפשר ספיגה.
בתום הדגירה של שעה, מוסיפים 50 מיקרוליטר של FBS מומת בחום ומחזירים את הצלחות לאינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות בסך הכל. לאחר 12 שעות דגירה, מוציאים את הצלחת מהאינקובטור. לשאוף 150 מיקרוליטר של supernatant ולהשליך או לשמור את זה לניתוח supernatant.
אל תסיר את הסופרנטנט שנותר. כעת, צרו את פתרון איסוף החלבונים על ידי שילוב של 50 מיקרוליטר של חיץ קספז ליזה ו-100 מיקרוליטר של ארבעה חיץ XSDS לכל באר. לאחר מכן, להוסיף 150 מיקרוליטר של תערובת לכל באר.
עבור כל באר, פיפטה את התערובת כדי לאסוף את התאים lysed ו supernatant. תוך כדי פיפט, מגרדים את תחתית הבאר עם קצה פיפטה כדי לשבש את התאים. לאחר גירוד ו pipetting, לאסוף את חלבון lysate לתוך מסומן 1.5 מיליליטר צינורות.
באמצעות בלוק חום, לחמם את כל הצינורות ל 100 מעלות צלזיוס במשך 12 דקות. הסר את הצינורות מבלוק החום והצנטריפוגה ב 14, 500 גרם למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר כדי להניף רכיבים בלתי מסיסים. הכן את מנגנון אלקטרופורזה עם ג'ל 12% polyacrylamide עם 10 בארות.
מלא את מנגנון האלקטרופורזה בחיץ ריצה והסר את מסרק הג'ל. לאחר מכן, מחממים את הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. צנטריפוגה את הדגימות ב 14, 500 גרם במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר לפני הטעינה.
לאחר מכן, לטעון לאט 30 מיקרוליטר של הדגימה לתוך כל באר. השתמש משולב supernatant וחלבון lysate ו caspase lysis buffer או את הרקמה homogenate עבור caspase 1, 3, 7 ו 8 blots, ולהשתמש בחלבון lysate DN RIPA buffer המתואר בפרוטוקול או הומוגנט רקמות עבור caspase 11 ו 9. כדי להעריך את כל ששת הקספזות בבת אחת, השתמש באותו הליך כדי לטעון את אותן דגימות לכל אחד מששת הג'לים.
חבר את מכשיר האלקטרופורזה למקור החשמל והגדר את ההספק ל -80 וולט למשך 20 דקות כדי להתחיל את ריצת הג'ל. לאחר 20 הדקות הראשונות, כוונן את ההספק ל -100 וולט למשך 45 עד 60 דקות. שימו לב לחזית הצבע.
ברגע שחזית הצבע מגיעה לתחתית הג'ל, כבו את החשמל. בזמן שהג'ל פועל, הכינו את מאגר ההעברה כמתואר בכתב היד. הפוך את הפתרון לרענן בכל פעם.
הסר את הג'ל ממנגנון האלקטרופורזה באמצעות משחרר הג'ל. כדי להגדיר את מחסנית ההעברה עבור הג'ל, הפעל קרום PVDF על ידי השרייתו במתנול למשך דקה אחת. הרטיבו מראש שתי פיסות נייר פילטר, הג'ל וקרום PVDF וחיץ העברה למשך חמש דקות.
שמור את קרום PVDF וג'ל במיכלים נפרדים במהלך הדגירה בת חמש הדקות הזו. התחל להרכיב את ערימת ההעברה במערכת היבשה למחצה. בצד התחתון של ננו פלטינה, הניחו פיסת נייר מסנן אחת, את קרום PVDF, את הג'ל, ולבסוף פיסת נייר סינון אחת.
גלגלו בעדינות החוצה או לחצו החוצה בועות אוויר בין השכבות וסגרו את החלק העליון של המערכת. כעת, התחבר למקור החשמל. הגדר את המתח ל -25 וולט למשך 40 דקות.
לאחר ההעברה, מפרקים את ערימת ההעברה, אוספים את הממברנה ומניחים אותה בצלחת פטרי מרובעת. לאחר מכן, בצעו חסימת ממברנה על ידי הוספת 15 מיליליטר של תמיסת חלב רזה 5% ודגרו על הממברנה על שייקר נדנדה במהירות 50 עד 70 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר הדגירה מסירים את תמיסת החסימה, מוסיפים 10 מיליליטר מתמיסת הנוגדנים המדוללת, ודגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר או ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה על שייקר נדנדה, כפי שהודגם קודם לכן.
לאחר מכן, לאסוף את תמיסת נוגדנים ולשטוף את הממברנה על ידי הוספת 15 מיליליטר של TBST לממברנה על שייקר נדנדה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. מחק את TBST. חזור על הכביסה עם 15 מיליליטר של TBST שלוש פעמים.
הוסף 10 מיליליטר של תמיסת נוגדנים מצומדת משנית מדוללת של HRP. יש לדגור על שייקר נדנדה בטמפרטורת החדר למשך שעה. בסוף הדגירה, לאחר הסרת תמיסת הנוגדנים, שטפו את הממברנה על ידי הוספת 15 מיליליטר TBST על שייקר נדנדה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
לאחר השלמת שלבי השטיפה והסרת TBST, יש להוסיף 10 מיליליטר של מצע HRP בעל רגישות גבוהה. תן לו לשבת בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת. מוציאים את הקרום מהמצע.
המשך ישירות להדמיה באמצעות מכונת הדמיה chemiluminescence עם מגש טרנס לבן אביזר מוכנס במיקום התחתון. חשוף את הממברנה באמצעות מצב חשיפה אוטומטית. מנותחים הקספז הפרו והפעיל 1, 11, 3, 7, 8 ו-9 בסוג פראי ומוטנט ZBP1 לאחר זיהום בנגיף שפעת A, מוטציה מסוג פראי ומוטציה AIM2 לאחר זיהום HSV1, וזיהום Francisella novicida, או BDM מוטנטי מסוג פראי ו-NLRP3 לאחר גירוי ליפופוליסכריד ו-ATP.
תאים החסרים חיישני PANoptosis במעלה הזרם אינם עוברים מוות תאי חזק בתגובה לגירויים הקוגניטיביים המעוררים PANoptosis. זיהום בנגיף שפעת A גורם להיווצרות ZBP1-PANoptosome והתאים החסרים בנגיף ZBP1 מוגנים באופן משמעותי ממוות תאי במהלך הדבקה בנגיף שפעת A. באופן דומה, זיהומים HSV1 ו-Francisella novicida גורמים להיווצרות של פנאופטוזום AIM2, ותאים חסרים ב-AIM2 אינם מצליחים לעבור מוות תאי חזק בתגובה לזיהומים אלה.
תאים החסרים חיישני דלקת במעלה הזרם מוגנים מפני מוות תאי בתגובה לגירויים שלהם, ותאים חסרי NLRP3 אינם עוברים מוות תאי בתגובה לליפופוליסכריד ו- ATP. חשוב לזכור להכין תערובת של שני התא lysate כדי לקבוע קספאז מסוים. לאחר טעינת הסילון, הדגימה הזוהרת צריכה להיות מאוחסנת מינוס 20 מעלות כדי לשמור על שלמות המטרות של קספז למעקב בשילוב עם פרוטוקול זה, ניתן להשתמש בהדמיית מוות תאי בזמן אמת או בדיקות LDH כדי לפקח על ביצוע מוות תאי, וניתן להשתמש ב- ELIZAs כדי לבדוק שחרור ציטוקינים או DAMPs מתאים שעוברים סוגים שונים של מוות תאי.
