בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

הפרוטוקול מדגים שיטה אמינה וניתנת לשחזור לבידוד ותרבית תאי אנדותל ברמת טוהר גבוהה מעכברים שיכולים להיות להם יישומים מרובים. טכניקה זו היא שיטה פשוטה יותר המשמרת את התשואה והטוהר של תאי אנדותל. מי שתדגים את ההליך תהיה נינה נגוין, עמיתת מחקר בצוות מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל, מערבל את החרוזים המגנטיים במשך כמה שניות. פיפטה 50 מיקרוליטר של החרוזים לשני צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר עבור CD31 ו- CD102. מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ שטיפת חרוזים ומערבבים היטב.

מניחים את הצינורות על מפריד מגנטי ומסירים את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה פסטר מזכוכית. השהה מחדש את החרוזים ב 50 מיקרוליטר של חיץ שטיפת חרוזים. לאחר מכן הוסף חמישה מיקרוליטר או 2.5 מיקרוגרם של נוגדן CD31 או CD102 לכל 50 מיקרוליטר של חרוזים.

יש לדגור על מתלי חרוזים עם סיבוב עדין על קצה מעל מסובב הקצה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס או למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר. לשטוף immunobeads ארבע פעמים ולאחר מכן להשעות מחדש את immunobeads ב 50 מיקרוליטר של מאגר לשטוף חרוזים. ביום הבידוד, יש להוסיף 25 מיליליטר HBSS ל-25 מיליגרם של collagenase מסוג 1 ולדגור עליו בסיבוב עדין.

לאחר מכן סנן באמצעות מסנן 22 מיקרומטר. לאחר המתת חסד של גור עכבר בן חמישה עד שבעה ימים, רססו את הפגר באתנול 70%. לאחר מכן, לחתוך את הסרעפת כלפי מעלה לאורך כל הקירות הרוחביים של החזה כדי לחשוף את חלל החזה.

הזריקו חמישה מיליליטר של DMEM קר לחדר הימני של הלב עד שהריאות הופכות ללבנות. לאחר מכן לחתוך את האונות דיסטלי הסמפונות המתאים אחד אחד כדי להסיר את הריאות. משוך את אונות הריאה בצינור חרוטי 50 מיליליטר ממולא מראש ב -20 מיליליטר של מדיום בזאלי קר כקרח.

יש לסעיר בעדינות את הצינור ביד למשך 10 עד 15 שניות כדי לשטוף עודפי תאי דם אדומים. מוציאים את הריאות מהתקשורת עם מסננת תאים וטוחנים עם מספריים מעוקרים. מעבירים את הרקמה הטחונה לצינור החרוטי 50 מיליליטר עם 25 מיליליטר של תמיסת קולגנאז שחוממה מראש.

מתסיסים בעדינות על מיקסר מסתובב. מחברים מזרק 20 מיליליטר לצינורית קהה במשקל 15 מד ומקציפים את המתלה במרץ מבלי להקציף 10 עד 15 פעמים לתרחיף תאי. סנן את המתלה דרך מסננת תאים 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר.

לאחר מכן לשטוף את הצינור החרוטי המשמש לעיכול ואת מסננת התא עם 15 מיליליטר של מדיום בסיסי. צנטריפוגה את המתלה הסלולרי ב-400 כפול G למשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס. להשהות את הגלולה בשני מיליליטר של מדיום שלם.

מוסיפים שמונה מיליליטר של מדיום שלם ודגרים עליו. למחרת, לשטוף צלוחיות פעמיים עם 10 מיליליטר של HBSS ללא סידן ומגנזיום ולהוסיף 10 מיליליטר של מדיום מלא. ברגע שהתאים נפגשים ב-90% עד 95%, הם מוכנים לבידוד ראשוני של מערכת החיסון.

יש לשטוף תאי אנדותל דבקים פעמיים עם 10 מיליליטר HBSS ללא סידן ומגנזיום. הוסף שני מיליליטר של תמיסת ניתוק תאים ללא טריפסין ודגר עליה כדי להבטיח את הרמת כל התאים מהצלוחית. מוסיפים שמונה מיליליטר של מדיום בסיסי.

לאחר מכן, לסובב את התאים ב 400 פעמים G במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר ולהשעות אותם מחדש בשני מיליליטר של המדיום הבסיסי. מערבולת חרוזים מצופים נגד CD31 למשך מספר שניות כדי להשעות מחדש את החרוזים. הוסיפו 30 מיקרוליטר חרוזים לכל שני מיליליטר של תרחיף תאים והדקו את המכסה.

יש לדגור על הצינור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב קצה. לאחר מכן הניחו את הצינורות על מפריד מגנטי למשך שתי דקות. שאפו את הסופרנאטנט והוציאו את הצינור מהמגנט.

השהה מחדש את גלולת תא החרוז על ידי הוספת שלושה מיליליטר של מדיום בסיסי לצינור ופיפטציה למעלה ולמטה מספר פעמים. החלף את הצינור על המפריד המגנטי למשך שתי דקות. לאחר מכן שאפו בזהירות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה פסטר זכוכית.

לאחר השטיפה הסופית, כאשר הסופרנאטנט מתבהר, השהה מחדש את גלולת תא החרוז בשלושה מיליליטר של מצע צמיחה מלא והעבר אותו לצלוחית T75. מוסיפים שבעה מיליליטר ממדיום הגידול השלם ודגרים עליו. למחרת, שטפו מחדש את התאים עם HBSS ללא סידן ומגנזיום.

לאחר מכן להוסיף 10 מיליליטר של בינוני מלא. ברגע שהתאים נפגשים ב-90% עד 95%, הם מוכנים לבידוד חיסוני משני. הבחירה החיסונית הראשונה מזהה את התאים החיוביים CD31, אשר גדלים בתצורת מרוצף.

בחירה שנייה של חרוזים מצופים נגד CD102 מגבירה את טוהר תאי האנדותל ומיון תאים מופעל פלואורסצנטי משמש כדי לאשר שאוכלוסיית התאים חיובית CD31 וחיובית CD102. כדי לחקור מסלולים דלקתיים אנדותל ותפקוד מחסום האנדותל, טיפול במורין ציטוטומיקס שימש לגרימת ייצור IL-6 משמעותי על ידי תאי אנדותל עם ערך P של פחות מ -0.01. יתר על כן, התנגדות transendothelial ירד מראה חדירות אנדותל מוגברת.

תאי אנדותל מבודדים יכולים לשמש בגירויים של תאי אנדותל או במבחני תפקוד מחסום כדי לגלות מטרות טיפוליות מבוססות אנדותל להפרעות בתפקוד האנדותל.