אנו מודים ג&#39;ף טאקר, אריקה Scappini, ואגנס Janoshazi עזרתם עם מיקרוסקופיה, Ligon Perrow לניהול לה המושבה העכבר, ו- Jun חן ומיכאל סנדרסון לעזרה עם מבצעה רקמה, ומייקל Fessler ודרק קין על קריאה ביקורתית של את כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי הסניף העירוני של NIEHS, NIH (זיא ES102025-09), אשר בתורו בחסות מח&#39; בריאות ושירותי אנוש.

נהלים Animal ניסיוני המתואר במאמר זה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים NIEHS ושימוש (IACUC). 1. הכנת ריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים בבית בין 6 ו 12 שבועות של גיל בתנאים הפתוגן ללא ספציפיים בהתאם להנחיות שסופקו על ידי ועדות הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש. הערה: עכברים צלמו יכולים להיות נאיביים, או מטופלים, בהתאם לכל תחומי העניין הספציפיים של חוקר. כאן, אנו מתארים לוקליזציה תא חיסון בעכברים נאיביים בעכברים שטופלו 100 מיקרוגרם ovalbumin (OVA) ו 0.1 מיקרוגרם lipopolysaccharide (LPS), באמצעות פוספט בופר (PBS) ככלי בהיקף כולל של 50 μL. כדי oropharyngeally להנחיל OVA / LPS לתוך דרכי הנשימה, חיות היו מורדמים עם שאיפה isoflurane ו מושעה אנכית על ידי השיניים שלהם עם גומייה. הלשון היתה תפס בעדינות עם מלקחיים והחזיק לצד אחד כדי למנוע בליעה, ו 50 &amp; #181; L של פתרון OVA / LPS שהופקד בחלק האחורי של חלל הפה כפי שתוארו לעיל 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם זריקה intraperitoneal של pentobarbital נתרן (100 מ&quot;ג / ק&quot;ג), ואת הסיכה חיה לבסיס פוליסטירן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלל הבטן עם מספריים על ידי חיתוך העור הצפק מאמצע הבטן עד הלסת. משוך את המעיים הצידה עם מלקחיים או בצד הקהה של המספריים, וחתוך את הווריד הנבוב הנח לנקז דם הרחק ריאות. נקב את הסרעפת עם קצה חד של מספריים כדי לאפשר הרחבת בית החזה, נזהרים שלא לחתוך את הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוטות רוק מנקים ורקמות אחרות הרחק קנה הנשימה על ידי גרירה של הרקמה ידנית משייכתו הרחק קנה נשימה הבסיסית עם מלקחיים. ביצוע חתך קטן קנה הנשימה בצד הקדמי של הלהקה העבה של סחוס באמצעות מלקחיים קנס או מספריים, נזהרים שלא לחתוך כל הדרך למרות traצ&#39;יאה. החתך יהיה גדול מספיק כדי לאפשר מחט 20 G כדי לעבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק מחט 1.5 אינץ &#39;, 20 G על קטע של צינורות פוליאתילן, והשאיר כ 1 סנטימטר של צינורות מעבר לסוף המחט. חותכים את צינורות בזווית של כ 45 מעלות כדי שפוע הקצה, לצרף את המחט למזרק 1 מ&quot;ל, ולטעון את המזרק על ידי ציור 0.8 מ&quot;ל של חם (40 מעלות צלזיוס) 2% נקודת התכה נמוכה agarose דרך המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקצה של הצינור לתוך החתך של קנה הנשימה לאט להזריק את agarose לתוך הריאות. מבלי להזיז את המחט או מזרק, ידביק את המזרק לבסיס פוליסטירן כדי להבטיח את המחט נשארת בתוך קנה הנשימה. הערה: לאחר הזרקה, הריאות תהיינה גדולות מנופח בתוך החזה. האונות התקינה להרחיב הראשונה, ואחריה האונה השמאלית. אם רק אחד אונה מתרחבת, המחט הוכנסה עמוקה מדי (בעבר הסמפונות), וזה יהיה צורך לשלוף אותו מעט לפני שתמשיך. חלק זה שלהליך שצריך לעשות יחסית מהר, לפני agarose מתחיל לגבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את העכבר, עם בסיס המזרק עדיין מוכנס בתוך קנה הנשימה, בחדר או מקרר קר עבור דק &#39;10 לפחות. במידת צורך, החיה יכולה להישמר שם עד כמה שעות, גם אם שימשיך נדידת תאי תמונה על ידי מיקרוסקופ וידאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העכבר הוא קר, בזהירות שיחתוך את הריאות מנופח agarose באמצעות מספריים, ומניחים אותם בצלחת 3 ס&quot;מ עם קרח קר PBS. שמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את האונה הרצויה עבור חיתוך רקמות (למשל, באונה מעולה מימין). ודא שהחלק הפנימי של הריאות (במקום חיבור שלו קנה נשימה) הוא עם הפנים כלפי מטה בצלחת. הערה: האונה בשימוש והכיוון שלה על הבוכנה יקבע את גודל כלי ובדרכי הנשימה כי יהיה גלוי. האורינטציה המתוארת כאן היא אידיאלית עבור להדמיה של דרך נשימה גדולה, ואת parenchyma. יש עכברים אונה אחת גדולה שמאל ארבע אונות קטנות בצד הימין. להדמית PCLS הבא כניסתה של אלרגנים לתוך הריאות באמצעות לוע תחתון או שאיפת אפי, באונה המעולה התקינה מחולקת בדרך כלל, בין שאר משום שמדובר בגודל נוח, אבל גם בגלל סוכנים בשאיפה לפיזור אחיד בתוכה. עם זאת, אונות אחרות, במיוחד באונה השמאלית, יכולות להיות גם למדו. כאשר משווים זני עכבר או טיפולים, חשוב להשוות אותו האונה. </li></ol> 2. חיתוך ריאות הערה: הפוך פרוסים באמצעות מבצעה אוטומטי, מתכת קירור בלוק, בוכנה במזרק מתכת, בהתאם להוראות היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים טיפה קטנה של כל המטרה, דבק מגע ג&#39;ל ללא ריצה על הבוכנה ולהפיץ את הדבק בתנועה מעגלית, נזהר שלא לתת הדבק לגעת בצידי מזרק המתכת. אם הדבק נוגע בצידי המזרק, זה יהיה להדביק את מזרק בוכנה ביחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר כיסוי הבוכנה עם דבק, בעדינות לתפוס אתאונה ניכרת עם מלקחיים עם הצד קנה הנשימה למטה, מורחת אותו על רקמה להסיר עודפי נוזלים, ובזהירות למקם אותו על גבי הבוכנה. חתוך כל רקמה נוספת משתרעת מעבר לקצה הבוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הבוכנה כלפי מטה כדי שהצדדים של מזרק המתכת לעלות מעל הרקמה, יצירה היטב עם הריאות מודבקות בתחתית, לא יותר מאשר כמה סנטימטרים עמוקים. סרט סביב החלק התחתון של מזרק המתכת להחזיק בעמדה זו במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים בזהירות נמוכה להמיס agarose 2% ב 40 ° C לתוך הבאר, כך שהוא רק מכסה את החלק העליון של האונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקף את המזרק מתכת עם בלוק מצמרר-קר קרח לקרר את האונה ו agarose עבור 1 - 2 דקות. הערה: קירור זמן קצר של agarose סביב הרקמה עלולה להוביל להתפוררות agarose במהלך חיתוך, אשר עלול לגרום PCLS לחתוך בצורה לא אחידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המזרק הדגים לתוך מבצעה האוטומטי למלא את טנק החיץ עם PBS הקר כקרח. יישר את<html> צעד כונן מנוע עם המזרק דגימה ולהסיר את הנייר דבק מלמטה. הפעל את המתג קדימה מהר (FF) עמד עד שכונן מנוע הצעד פשוט נוגע בחלק האחורי של הבוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הלהב הטרי עם מזרק הדגימה. עובי רקמת סט, רציף / יחיד פרוס, תנודה ומהירות של מבצעה. לדוגמא, עובי רקמה: 150 מיקרומטר, חיתוך רציף (המשך.), תנודה: 9, ומהירות: 3 - 4. לחצו על Start. ההגדרות שלמעלה צריכות להיות מותאמים מפרטי מבצעה האוטומטיים הספציפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מרית או מכחול דק, לאסוף את PCLS אחד בכל פעם כפי שהם נופלים לתוך טנק החיץ ומניחים אותם בצלחת 24-היטב המכילה קרח קר PBS. הערה: חשוב לשמור על הפרוסות על מנת לשמור על עקביות בין ניסויים. למרות כל הריאה משתנה בהתאם לגיל, מין ומשקל, פרוסה 10 th, למשל, בדרך כלל תשואות בגודל דרכי הנשימה בצורה דומה. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 3. מכתים נוגדנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב פאנל של נוגדנים מתויג fluorescently בהתאם לסוג התא של עניין, תוך התחשבות הפוטנציאל חפיפה ספקטרלית ניאון ואת יכולות זיהוי של המיקרוסקופ. הערה: כדוגמה, פאנל לגילוי משנה DC הוא כדלקמן: CD11c / אלפא integrin X - BrilliantViolet (BV) 605 (עירור: 405 ננומטר, שיא פליטת: 605 ננומטר), CD324 / E-cadherin - אלקסה 488 (AF488 (עירור): 488 ננומטר, פליטת שיא: 519 ננומטר), CD88 / C5Ra1 - Phycoerythrin (PE) (עירור: 561 ננומטר, פליטת שיא: 578 ננומטר), CD103 / אלפא E integrin - Allophycocyanin (APC) (עירור: 633 ננומטר , פליטת שיא: 660 ננומטר). כלי קרינה הצופה ספקטרלי (ראו רשימת חומרים) שימושיים לעיצוב פנלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן קוקטייל נוגדנים המכיל את הנוגדנים הרצויים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה PCLS סטטי, להוסיף 800 μL חיץ מכתים, 100 חוסם Fc μL, 50 μL סרום עכבר רגיל, ו 50 μL סרום חולדה נורמלית microcentrifu 1.5 מ&quot;לצינור gation עבור נפח כולל של 1 מיליליטר. הדמיה תא חי, להשתמש 800 בינוני של μL ליבוביץ (1x) המכיל 10% FBS (ליבוביץ-10) במקום חיץ מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדנים כדי להתאים ריכוז סופי רצוי של כל נוגדן. מעבירים את הפתרון נוגדן לצלחת 3 ס&quot;מ, ולשמור בחושך עד מוכן לשימוש. הערה: הריכוזים הסופיים צריכות להיות מותאמת עבור כל נוגדן בודד (בדרך כלל 1 - 5 מיקרוגרם / מיליליטר). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר PCLS עם שטח אנטומי של עניין, כגון דרכי הנשימה גדול או בפריפריה של הריאה, ומניחים בצלחת 3 ס&quot;מ המכיל פתרון נוגדן 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCLS הכתם בחושך, על קרח, נדנדה לאט במשך דקות 30 או 60. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה PCLS סטטי, המשך לסעיף 4. הדמיה תא חי, המשך לסעיף 5. </li></ol> 4. הדמיה סטטי של PCLS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 60 דקות דגירה של PCLS עם נוגדנים, להסיר את פתרון נוגדן מצלחת ולשטוף tהוא פרוסות פעמיים עם 1 מ&quot;ל קרח קר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50 μL PBS על צלחת זכוכית התחתונה עגול 3 ס&quot;מ. בעזרת מרית או מכחול, להעביר את PCLS מוכתם עד הטיפה, מניפולציה של הפרוסה בעדינות עד שהוא שטוח ופרש. הסר את PBS עם טפטפת. הפרוסה צריכה לשקר שטוחה ככל האפשר. התהליך המתואר לעיל צריך להתבצע במהירות כדי למנוע photobleaching. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 1 טיפה של המדיום גובר בטמפרטורת החדר על פרוסה בעדינות ושחרר coverslip זכוכית לתוך הבאר של צלחת. שמור PCLS בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שעה לפני הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת ההצגה תחת מיקרוסקופ confocal, להשתמש מטרת 20X (ראה רשימת חומרים). השתמש באפשרות &quot;אריח&quot; לאתר ולסמן את הקצוות של הרקמה בסביבה &quot;קמור&quot;. זה יעזור להפחית את זמן סריקת האריח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הגדרת טווח Z- מחסנית, מאמת ברמת אזורים מרובים של הפרוסה, במיוחד לאורך הקצוות, כי טווחי הסטמתאימים. הערה: טווח z סביר להניח שיידרש להיות גדול מ העובי של הרקמה עצם כי זה מאוד קשה לקבל את הרקמה להניח שטוחה לחלוטין. לדוגמה, עם PCLS עבה 150 מיקרומטר, בטווח Z- מחסנית סביר להניח שאתה צריך להיות מוגדר 200 - 250 מיקרומטר כדי להכיל בליטות עקומות של הפרוסה. בהתאם לטווח Z- מחסנית ואת הגודל של הרקמות, כל סריקת ריאות מלאה תיקח בין 7 - 12 h עם מטרת 20X. ריאות הן ייחודיות וההגדרות חייבות להיות מותאמות עבור כל ניסוי. </li></ol> 5. הדמיה של תא חי PCLS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות הדגירה של PCLS עם נוגדנים, להסיר את הפתרון נוגדן מצלחת ולשטוף את פרוסות פעמיים עם 1 מ&quot;ל קר ליבוביץ-10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה הטרי 50 μL ליבוביץ-10 לתוך חריץ אחד של coverglass חדרים (8 חריצים). להשתמש במרית להעביר את PCLS למדיום, בעדינות מניפולציה אותו עד הפרוסה שטוחה פרושים. התהליך המתואר לעילצריך להתבצע במהירות כדי למנוע photobleaching. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום 50 μL בעזרת פיפטה. הפרוסה היא לשכב שטוחה ככל האפשר. הערה: זה מקובל אם הקצוות של הפרוסה הם הורמו למעלה אנכיים על הקיר של החדר. יתר על כן, אם קיים, משקל פלטינה מתכת יכול לשמש כדי לעגן את הפרוסה לפני שתמשיך לשלב הבא. ראה רשימת חומרים המצורפת למשל אחד של חוט פלטינה שניתן לגזור כפוף לתוך משקולות קטנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחדר קר 4 ° C, לערבב 100 μL של צמיחה מופחתת גורם, מטריקס האדום ללא פנול עם 100 μL ליבוביץ-10. השתמש בעצות פיפטה precooled לכך, או מטריקס יהיה לגבש בקצה. הערה: יחס זה של מטריקס ובינוני (1: 1) יוצרת ג&#39;ל סמיך מספיק כדי להחזיק את PCLS למטה בתנאים-בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה המטריצה ​​לערבב, ו פיפטה בזהירות על גבי PCLS, ולוודא כי הג&#39;ל ממשיך העליון של lung פרוסה, וכי הפרוסה שלא תצוף למעלה על גבי הג&#39;ל. הג&#39;ל אמור לעבוד כמו משקל, עיגון PCLS מטה אל החלק התחתון של הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את coverglass החדרים חממה 37 ° C ולתת המטריצה ​​לחזק עבור ~ 5 דק &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר coverglass החדרים כולו על הבמה המחוממת מראש של מיקרוסקופ confocal. שמור על החדר ב 37 מעלות צלזיוס במשך הדמיה. אספקת CO 2 אינה נדרשת במהלך הדגירה התא בעת שימוש בינוני של ליבוביץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את טווח טווח אריח Z- מחסנית מבוסס על המרווח הרצוי בין מסגרות. בעת ההצגה תחת מיקרוסקופ confocal, להשתמש מטרת 20X (ראה רשימת חומרים). השתמש באפשרות &quot;אריח&quot; כדי לציין את האזור של עניין הרקמה, באמצעות הגדרת &quot;ממורכז רשת&quot; (למשל, רשת מרוכז 2x2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הגדרת טווח Z- מחסנית, מאמת ברמת אזורים מרובים של הפרוסה כי טווחי הסט מתאימים. הערה: ZRAnge צפויה להיות שווה את עובי הרקמה. ריאות הן ייחודיות וההגדרות חייבות להיות מותאמות עבור כל ניסוי. אריחי 2x2 ו 10 Z- ערימות יגרמו בדרך כלל ~ 1 מסגרת / 2 דקות. ודא שפונקציית המיקוד האוטומטי מופעלת לפני תחילת הניסוי כדי למזער XY ו- Z-נדידה בתקופת ההדמיה. </li></ol>

<ol>
	<li>Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+quantitation+of+eosinophil+and+neutrophil+recruitment+to+allergic+lung+inflammation+in+a+brown+Norway+rat+model.">Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).</li><li>Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+migratory+dendritic+cells+rapidly+transport+antigen+from+the+airways+to+the+thoracic+lymph+nodes.">Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes.</a> J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).</li><li>Sung, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+lung+CD103+(alphaE)-beta7+integrin-positive+epithelial+dendritic+cell+population+expressing+Langerin+and+tight+junction+proteins.">A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins.</a> J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).</li><li>Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lasker+Basic+Medical+Research+Award.+Dendritic+cells:+versatile+controllers+of+the+immune+system.">Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system.</a> Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).</li><li>Jakubzick, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph-migrating,+tissue-derived+dendritic+cells+are+minor+constituents+within+steady-state+lymph+nodes.">Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes.</a> J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).</li><li>Julia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+restricted+subset+of+dendritic+cells+captures+airborne+antigens+and+remains+able+to+activate+specific+T+cells+long+after+antigen+exposure.">A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure.</a> Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).</li><li>Nakano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+properties+of+pulmonary+dendritic+cells+are+determined+by+their+developmental+lineage.">Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage.</a> Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).</li><li>Nakano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+receptor+C5aR1/CD88+and+dipeptidyl+peptidase-4/CD26+define+distinct+hematopoietic+lineages+of+dendritic+cells.">Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells.</a> J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+lung+slices:+a+powerful+approach+for+assessment+of+lung+pathophysiology.">In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology.</a> Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).</li><li>Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+tissue+slices:+applications+in+pharmacology+and+toxicology.">Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology.</a> Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).</li><li>Bergner, A., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+stimulates+Ca2++oscillations+and+contraction+in+airway+smooth+muscle+cells+of+mouse+lung+slices.">ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).</li><li>Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Videomicroscopy+of+methacholine-induced+contraction+of+individual+airways+in+precision-cut+lung+slices.">Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices.</a> Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).</li><li>Henjakovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+testing+of+immune+responses+in+precision-cut+lung+slices.">Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).</li><li>Henjakovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+lung+function+measurements+in+precision-cut+lung+slices+(PCLS)+from+chemical+allergen-sensitized+mice+represent+a+suitable+alternative+to+in+vivo+studies.">Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies.</a> Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).</li><li>Paddenberg, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+vasoconstriction+of+partial+muscular+intra-acinar+pulmonary+arteries+in+murine+precision+cut+lung+slices.">Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices.</a> Respir Res. 7, 93 (2006).</li><li>Wilson, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergic+sensitization+through+the+airway+primes+Th17-dependent+neutrophilia+and+airway+hyperresponsiveness.">Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness.</a> Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).</li><li>Schlitzer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cDC1-+and+cDC2-committed+DC+progenitors+reveals+early+lineage+priming+at+the+common+DC+progenitor+stage+in+the+bone+marrow.">Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow.</a> Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).</li><li>Baluk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+lymphatic+growth+in+bronchus-associated+lymphoid+tissue+in+sustained+lung+inflammation.">Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation.</a> Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).</li><li>Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymus+cell+antigen+1+(Thy1,+CD90)+is+expressed+by+lymphatic+vessels+and+mediates+cell+adhesion+to+lymphatic+endothelium.">Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium.</a> Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).</li><li>Truman, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProxTom+lymphatic+vessel+reporter+mice+reveal+Prox1+expression+in+the+adrenal+medulla,+megakaryocytes,+and+platelets.">ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets.</a> Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).</li><li>Wigle, J. T., Oliver, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prox1+function+is+required+for+the+development+of+the+murine+lymphatic+system.">Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system.</a> Cell. 98 (6), 769-778 (1999).</li></ol>

אין מחברי ניגוד העניינים להכריז.

הפרוטוקול המתואר כאן פותח במקור כדי להמחיש את מיקומם של שתי תת של cDCs בתוך הריאה. עם זאת, פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות ללמוד סוגי תאים שונים, תוך שמירה על כדאיות התא ואת הארכיטקטורה תלת ממדי של הריאה. התכונה השנייה היא יתרון חשוב על פני מערכות תרבית תאים ומקל זיהוי של ס...

בעקבות שאיפה של גירויים פרו-דלקתיים כגון lipopolysaccharide (LPS), ישנה תנועה מתואמת של תאי מערכת החיסון לתוך, בתוך, ומן הריאות. לדוגמא, נויטרופילים מגויסים במהירות אל parenchyma הריאות בדרכי הנשימה. בנוסף, כמה תאי מציגי אנטיגן מקצועיים המכונים תאי דנדריטים קונבנציונליים (cDCs) עוברים דפוס הגירה מורכב יחסית 1, 2. ניתן לזהות cDCs באמצעות cytometry הזרימה, מבוססת בחלקה על התצוגה שלהם של הסמן משטח, CD11c. תת ברור של DCs ניתן להבחין על ידי ביטוי משטח הפרש של CD103 ו CD11b 3. לאחר רכישת אנטיגן בשאיפה, כמה cDCs לצאת ריאות ולהעביר דרך כלי הלימפה כדי לנקז-ריאה בלוטות לימפה (LNs) שבו הם מציגים פפטידים אנטיגן ספציפי בתאי T 4. זהו אירוע מוקדם קריטי בייזום של r אדפטיבית החיסוניתesponses. מסיבות שאינן ידועות, אולם, לא כל cDCs כי ירכשו אנטיגנים בשאיפה לעזוב את הריאות, ורבי תאים אלה נשארים כי איבר במשך כמה חודשים 5, 6. תצפית זו יכולה להיות חלקית מוסברת על ידי שושלת התפתחותיות של תאים אלה משום CD11c נגזר מונוציטים + תאים שחסרו את הקולטן chemokine, CCR7, אינן מסוגלות להעביר LNs האזורית 7, 8. סביר להניח כי פוטנציאל ההגירה של cDCs נקבע גם, לפחות בחלקה, על ידי העמדה האנטומי שלהן בתוך הריאה. עם זאת, הלוקליזציה המדויקת של אוכלוסיות שונות אלה של cDCs הבריאה לא מאופיינת במלואו. ידע משופר של לוקליזציה תא חיסון בתוך הריאות, ושל המולקולות לכוון אותו, נדרש הבנה טובה יותר של איך המערכת החיסונית של הריאות הופכת מופעלת. PCLS שמתבצע הגדלהly בשימוש כגישה לשעבר vivo לדמיין אינטראקציות מיצוב תא-תא הסלולר, תוך שמירה על שלמות מבנית של אדריכלות ריאות 9, 10. PCLS שמש ללמוד ריאות של מינים רבים, כוללים עכברים, בקר, קופים, כבשים, סוסים, ובני אדם 11. יתרון עיקרי של שיטה זו הוא כי כ 20 פרוסות ניתן להכין מן אונה יחידה של ריאות עכבר, ובכך להפחית את מספר בעלי החיים הנדרשים ניסויים בודדים. כמעט כל סוגי תאים חיסוניים, כולל DCS, מקרופאגים, נויטרופילים, ותאי T, נמצאים PCLS ולתחזק מבנים הרגיל שלהם. PCLS יכול לשמש גם כדי ללמוד סידן איתות התכווצות של תאי דרכי הנשימה ואת שריר חלק לאחר הטיפול עם אצטילכולין 12 או methacholine 13. בגישה זו, רק חלק קטן של הריאות הואalyzed מיקרוסקופית, אבל מחקר אחד דיווח כי מדידות של כיווץ דרכי הנשימה PCLS להשתנות רק על 10% מן פרוסה לחתוך, ושונות זו דומה לזו לראות באמצעות בדיקת תפקודי ריאה בבעלי חיים שלמים 14. חוקרים אחרים השתמשו PCLS כגישה לשעבר vivo לחקר שינויי סמני משטח ביטוי ציטוקינים ותא לאחר דגירה עם LPS 15. PCLS גם שמש מודל vivo לשעבר של כיווץ כלי דם ריאתי היפוקסי בעורקי תוך acinar קטנים. כלים אלה נמצאים בחלק של הריאה כי לא ניתן להגיע באמצעות הליכים אחרים, כולל הקלטות מפלחים עורקי גזור או ניתוח של כלי subpleural 16. במעבדה שלנו השתמשה PCLS בעיקר לדמיין לוקליזציה תא החיסון ברקמת הריאה חי על מצב יציב ובעקבות גירוי דלקתי in vivo. הנהלים פתחנו לכך הם כדלקמן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prox1-TdTomato transgenic mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>018128</td>
			<td>B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>004194, 006617</td>
			<td>B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rag1 knock-out mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>002216</td>
			<td>B6.129S7-Rag1tm1Mom/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin, Low Endo, Purified</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>L2630-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft</td>
			<td>BD Diagnostic Systems</td>
			<td>427421</td>
			<td>0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>E-3112-125</td>
			<td>2% solution dissolved in PBS at 70 &#176;C and held at 40 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compresstome VF-300</td>
			<td>Precisionary Instruments, Inc.</td>
			<td>VF-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Razor Blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td>Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue All Purpose Instant Gel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>500033-484</td>
			<td>Commonly available for $3/tube in local drugstores&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rat Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td>
			<td>012-000-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Mouse Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td>
			<td>015-000-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Buffer</td>
			<td>Made in House</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies)</td>
			<td>Made in House</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b eFluor 450</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0112-80</td>
			<td>Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101237</td>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c Phycoerythrin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0114-82</td>
			<td>PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c Allophycocyanin</td>
			<td>BD Phamingen</td>
			<td>550261</td>
			<td>APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD88 Phycoerythrin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>135806</td>
			<td>PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD103 Allophycocyanin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1031-82</td>
			<td>Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0902-82</td>
			<td>Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1721-82</td>
			<td>Anti-mouse CD172a APC (clone: P84)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564188</td>
			<td>BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>53-3249-82</td>
			<td>Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>51-3249-82</td>
			<td>Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Microwell Dishes 35mm petri dish, 14mm Microwell, No. 1.5 coverglass</td>
			<td>MatTek Corperation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>155411PK&#160;</td>
			<td>Pack of 16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness</td>
			<td>MatTek Corperation</td>
			<td>PCS-1.5-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bare Platinum Wire</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PTP201</td>
			<td>0.020&#34; (0.5mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an &#34;L&#34; shape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td>Keep at 4 &#176;C, warm to room tempterature before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 objective lends</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420650-9901-000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells

שאיפת אלרגנים ופתוגנים מעוררת שינויים מרובים במגוון סוגי תאים חיסוניים הריאה. Cytometry זרימה היא טכניקה רבת עוצמה לניתוח כמותי של חלבונים בתא השטח על תאי מערכת החיסון, אבל זה לא מספק מידע על דפוסי לוקליזציה והגירה של תאים אלה בתוך הריאה. בדומה לכך, מבחני chemotaxis ניתן לבצע כדי לחקור את הפוטנציאל של תאים להגיב גורמי chemotactic במבחנה, אך אלה מבחנים אינם מתרבים בסביבה המורכבת של הריאה השלמה. בניגוד לטכניקות הנ&quot;ל, המיקום של סוגי תאים בודדים בתוך הריאה ניתן מדמיין בקלות על ידי יצירת פרוסות ריאה-לחתוך Precision (PCLS), השאיר זמין מסחרי, נוגדנים מתויגים פלורסנטי, באופן חזותי את הסעיפים על ידי מיקרוסקופ confocal. PCLS יכול לשמש הוא לחיות קבועות רקמת ריאה, ואת הפרוסות יכולות להקיף תחומים גדולים כמו חתך של אונה כולו. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי להמחיש את המיקום בהצלחה במגוון רחב של סוגי תאים בתוך הריאה, כולל סוגים שונים של תאים דנדריטים, מקרופאגים, נויטרופילים, תאי T ותאי B, כמו גם תאים מבניים כגון הלימפה, אנדותל, וכן תאי האפיתל. היכולת לחזות אינטראקציות הסלולר, כגון אלו בין תאים דנדריטים ותאי T, ב live, רקמת הריאה תלת ממדי, יכול לחשוף כיצד תאים לנוע בתוך הריאה ולתקשר אחד עם השני על מצב יציב ובמהלך דלקת. לפיכך, כאשר נעשה שימוש בשילוב עם טיפולים אחרים, כגון זרימת cytometry וכמותיים PCR, PCLS יכול לתרום להבנה מקיפה של האירועים הסלולר העומדים בבסיס מחלות אלרגיות ודלקתיות של הריאה.

כדי לזהות את המיקום של שני תת DC, cDCs היי CD11b ו CD103 + cDCs, PCLS C57BL / 6 עכברים נחתכו מוכתם נוגדנים חד שבטיים (מבז) הספציפיים CD11c, CD88, CD103, ו CD324 (E-cadherin). נוגדנים לתאי האפיתל בדרכי הנשימה כתם CD324, ו CD88 מוצג על מאקרופאגים נויטרופילים, אך לא cDCs 8. ...

Watch this Scientific Journal Video about Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells at JoVE.com

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

אנו מתארים שיטה לייצור פרוסות ריאה-לחתוך Precision (PCLS) ו immunostaining להם לדמיין את הלוקליזציה של סוגי תאים שונים חיסוניים הבריא. פרוטוקול שלנו ניתן להאריך לדמיין את המיקום והתפקוד של סוגי תאים שונים תחת מגוון של תנאים.

Precision-לחתוך פרוסות ריאת עכבר לדמיין תאי דנדריטים ריאה חיים

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

precision-cut-mouse-lung-slices-to-visualize-live-pulmonary-dendritic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K Views.  National Institute of Environmental Health Sciences, NIH.  אנו מתארים שיטה לייצור פרוסות ריאה-לחתוך Precision (PCLS) ו immunostaining להם לדמיין את הלוקליזציה של סוגי תאים שונים חיסוניים הבריא. פרוטוקול שלנו ניתן להאריך לדמיין את המיקום והתפקוד של סוגי תאים שונים תחת מגוון של תנאים. 

Video: Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

ניתוח של התבגרות ריאתי Cell Migration הדנדריטים ובמהלך דלקת אלרגית Airway

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is a common modifier of heart and lung function, by elaborating cellular infiltration, production of cytokines and growth factors, and by initiating remodeling processes 1.
Compared to the left ventricle, the right ventricle is a low-pressure pump that operates in a relatively narrow zone of pressure changes. Increased pulmonary artery pressures are associated with increased pressure in the lung vascular bed and pulmonary hypertension 2. Pulmonary hypertension is often associated with inflammatory lung diseases, for example chronic obstructive pulmonary disease, or autoimmune diseases 3. Because pulmonary hypertension confers a bad prognosis for quality of life and life expectancy, much research is directed towards understanding the mechanisms that might be targets for pharmaceutical intervention 4. The main challenge for the development of effective management tools for pulmonary hypertension remains the complexity of the simultaneous understanding of molecular and cellular changes in the right heart, the lungs and the immune system.
Here, we present a procedural workflow for the rapid and precise measurement of pressure changes in the right heart of mice and the simultaneous harvest of samples from heart, lungs and immune tissues. The method is based on the direct catheterization of the right ventricle via the jugular vein in close-chested mice, first developed in the late 1990s as surrogate measure of pressures in the pulmonary artery5-13. The organized team-approach facilitates a very rapid right heart catheterization technique. This makes it possible to perform the measurements in mice that spontaneously breathe room air. The organization of the work-flow in distinct work-areas reduces time delay and opens the possibility to simultaneously perform physiology experiments and harvest immune, heart and lung tissues.
The procedural workflow outlined here can be adapted for a wide variety of laboratory settings and study designs, from small, targeted experiments, to large drug screening assays. The simultaneous acquisition of cardiac physiology data that can be expanded to include echocardiography5,14-17 and harvest of heart, lung and immune tissues reduces the number of animals needed to obtain data that move the scientific knowledge basis forward. The procedural workflow presented here also provides an ideal basis for gaining knowledge of the networks that link immune, lung and heart function. The same principles outlined here can be adapted to study other or additional organs as needed.

A specific and rapid protocol to simultaneously investigate right heart function, lung inflammation, and the immune response is described as a learning tool. Video and figures describe physiology and microdissection techniques in an organized team-approach that is adaptable to be used for small to large sized studies.

מדידות נכונות חדרית סיסטולי לחץ בשילוב עם קציר של ריאה ודגימות רקמה חיסוניות בעכברים

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa מושרה ריאות פגיעה דגם

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

האדם תאים דנדריטים ריאות: הפריסה המרחבית וזיהוי פנוטיפי ב Endobronchial ביופסיות שימוש אימונוהיסטוכימיה ו cytometry זרימה

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

הערכת ציטוטוקסיות ואפקטים Immunomodulatory של חומרים אמבריולוגיה דיוק-לחתוך פרוסות

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...