הכותב הוא בריטניה פרקינסון עמית מחקר (מענק F1002). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי התקשר Wellcome Trust / MRC משותפות הפרס ניוון מוחיים (WT089698) כדי Consortium מחלת פרקינסון בריטניה (UKPDC) שחבריה הם ממכון UCL לנוירולוגיה, אוניברסיטת שפילד ואת זרחון חלבון MRC יחידת בבית מאוניברסיטת דנדי.

בטיחות פרוטוקול המתואר להלן מנצל ATP שכותרתו עם P 32 הרדיואקטיבי במיקום פוספט γ לעקוב אחר פעילות קינאז של LRRK2. הוא מבוסס על פרוטוקולים סטנדרטיים המשמשים במעבדה שלנו, וכך לגבי רבים מן השלבים בתהליך, כגון הפעלת ג&#39;לים, המערבי סופג וכולי החומרים ותנאי מדויק צריך לקחת כמדריך כמו ציוד ופרוטוקולים משמש תהליכים אלה משתנה בין מעבדה למעבדה. תרכובות המכילות איזוטופים אשר פולטים קרינה מייננת הם מזיקים לבריאות האדם רישוי קפדנית על בקרת תקנות ברמה המוסדית והארצית השימוש שלהם. הניסויים בפרוטוקול זה בוצעו לאחר אימון בשימוש בקוד פתוח קרינה ביוניברסיטי קולג&#39; בלונדון ובעקבות הנחיות לתרגול טוב מעבדה הניתנים על ידי שירותי הביטחון במכללה (הנחיות אווהilable ב <a href="http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf">http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf</a> ). שימוש בקרינה קוד פתוח לא צריך להיות ניסיון קודם הכשרה מתאימה ואישור רגולטורי. גוף התקינה האחראי על קרינה קוד פתוח במחקר מעבדה משתנה ממדינה למדינה. דוגמאות אלה הן: בריטניה, הפועל בריאות ובטיחות ( <a href="http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm">http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm</a> ), בארצות הברית הוועדה לפיקוח גרעיני ( <a href="http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html">http:// www.nrc.gov / חומרים / miau / ובתקנות, מדריכים, comm.html</a> ), בקנדה בטיחות הקנדי ועדת גרעיני ( <a href="http://nuclearsafety.gc.ca/eng/">http://nuclearsafety.gc.ca/eng/</a> ), ובגרמניה דאס Bundesamt für Strahlenschutz ( <a href="http://www.bfs.de/de/bfs">http : / / www.bfs.de / de / BFS</a> ). משתמשים במדינות אחרות יש לאשר חוקים מקומיים, תקנות רשויות הרישוי שלהם עם קצין בטיחות קרינה. אמצעי הבטיחות הרלוונטיים בפרוטוקול זה כבר ציין בטקסט, מודגשת עם סמל תלתן רדיואקטיבי ( <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="סמל 1" /> ). 1. הכנת תגובות קינאז <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="סמל 1" /> כל תערובות התגובה שהוכנו דוגמיות 1.5ml עם בורג כמוסות המכילות טבעת O כדי למנוע התפשטות של רדיואקטיביות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי חלבון על הקרח - LRRK2 סוג בר, D1994A, G2019S. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמציא תגובה על הקרח - 10nm LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 5ul של חיץ קינאז 10x, עשה עד 50μl עם מים. </li></ol> 2. הפעלת assay <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="סמל 1" /> כל הצעדים ניצול 32 P-ATP צריך לקחת pתחרה באזורים המיועדים קרינה. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="סמל 1" /> מתאים ציוד מגן אישי יש ללבוש - פי נוהל העבודה הרגיל במעבדה שלנו אלה כוללים חלוק, כפפות ומשקפי מגן כפול. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="סמל 1" /> דוגמאות המכיל 32 P-ATP צריך להיות מוגן מפני משתמשים ידי 6mm מסכי פרספקס כדי למזער את החשיפה. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="סמל 1" /> במקרים הרלוונטיים, מכשירי ניטור אישי יש להשתמש - תוך UCL, כל קרינה מוסמך לפתוח משתמש מקור חייב להיות תג הסרט כדי לפקח על חשיפה לקרינה במהלך הניסויים. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="סמל 1" /> משטחים כל ניסיוני יש לבחון על זיהום רדיואקטיבי לפני ואחרי השימוש באמצעות הגייגר הדלפק. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="סמל 1" /> כל מתכלים מזוהמים צריך להיות מסולק הקפדה על הנחיות מוסדיים לסילוק פסולת רדיואקטיבית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת assay, להגדיר אבני חימום עד 30 מעלות צלזיוס ו - 100 ° C, בהתאמה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 32 P-ATP מהמקפיא -20 (שימו לב כי תנאי האחסון הלוך ושוב 32 P-ATP עשוי להשתנות בהתאם הספק או סוג של radionucleotides בשימוש). <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="סמל 1" /> סריקה מחוץ מיכל לפני השימוש, להפשיר מאחורי מסך פרספקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם תגובות על הקרח, להוסיף 1μl של 32 P-ATP זה יחד עם 10μM של קר ה-ATP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב עם פיפטה. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="סמל 1" /> צנטריפוגה Pulse להביא נוזל לתחתית של התחתית, מזעור הסיכון של זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר aliquot 15μl עבור נקודת זמן אפסד לסיים את התגובה aliquot על ידי תוספת של 5μl של חיץ SDS 4x מדגם denaturation ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="סמל 1" /> צנטריפוגה Pulse להביא נוזל לתחתית של התחתית, מזעור הסיכון של זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם נותרת להציב בלוק חימום מודגרות ב 30 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15μl להסיר בשלב 60 זמן תגובה דקה הופסק על ידי תוספת של 5μl של חיץ SDS 4x מדגם denaturation ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="סמל 1" /> צנטריפוגה Pulse להביא נוזל לתחתית של התחתית, מזעור הסיכון של זיהום. </li></ol> 3. Immunoblotting דגימות וניתוח התוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות לרוץ על SDS-PAGE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 גם 4-12% Bis-טריס ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrilamide מוכן באמצעות מגבים חיץ פועל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20μl של המדגם כל הועמסו על ג&#39;ל יחד עם 7μl של הדיאזיםTain סולם חלבון סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;ל לרוץ 160v במשך 90 דקות, או עד לפני לצבוע הגיע לסוף של הג&#39;ל. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="סמל 1" /> נוזל כל קשר עם רדיואיזוטופים יש להתייחס כאל פסולת רדיואקטיבית להיפטר הנחיות מוסדיים כמו לכל. UCL תקנות המדינה כי פסולת רדיואקטיבית נוזלית אמור להיות מושלך על ידי ניגרת כיורים המיועדים לרשות רדיואקטיבי עם מים בשפע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבון הועברו דרך קרום PVDF כתם המערבי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ העברת מוכן, 1x טריס גליצין בתוספת מתנול 20%. PVDF ממברנה נייר לסנן לחתוך כדי לתקן את גודל ג&#39;ל והופעל עם מתנול קרחונים במקרה של הממברנה או טרום רטוב עם חיץ להעביר במקרה של נייר הסינון. הממברנה צריכה להיות מראש תווית עם כדורי דיו כדי לאפשר זיהוי של אוריינטציה. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="סמל 1" /> הוסר ג&#39;ל מ פלסטIC מעטפת acrylamide עודף להסיר מסולק כמו פסולת רדיואקטיבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הג&#39;ל אמור להיווצר לתוך כריך עם קרום נייר פילטר, להבטיח כי בועות לא קיים בין הממברנה ואת ג&#39;ל, וסידר אחר כך במנגנון כתם המערבי עם קרום בין הג&#39;ל לבין האנודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההעברה תבוצע על 25V למשך 16 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות העברת חלבון PVDF, הממברנה צריך להיות מיובש בטמפרטורת החדר. לבסוף, קרום יבש יש לבודד בין הסדינים אצטט תאית חשוף למסך או זרחן או רנטגן הסרט כדי לאפשר זיהוי של חלבון radiolabelled. זמן חשיפה יכול לברוח כמה שעות יותר משבוע בהתאם לפעילות הספציפית של radioisotope המשמש את האנזים קינטיקה של התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Phosphoscreen סרוקים / סרט מעובד. אם אתה משתמש במסך פוספור, התמונה צריכה להיות נשמר כמו TIFF ברזולוציה גבוהה או קובץ מפת סיביות, אם באמצעות סרט אז טראן כתוצאהsparency יש לסרוק באמצעות סורק שולחני נשמר כמו TIFF ברזולוציה גבוהה או קובץ מפת סיביות. התמונה לאחר מכן ניתן לנתח ImageJ, תוכנית freeware זמין המכונים הלאומיים לבריאות של האתר ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ). </li></ol> 4. נציג תוצאות איור 1 מציג תוצאות נציג assay שבוצעו באמצעות סוג בר, G2019S ו D1994A LRRK2 עם חלבון המיאלין הבסיסי כמו מצע פוספט הגנרית acceptor. Autophosphorylation של LRRK2 גלוי בבית ≈ 200kDa, עם להקות רבות המייצגות MBP phosphorylated גלוי מ 20-40kDa. הערה העדר autophosphorylation בנתיב D1994A (קינאז מת), והגדילה זירחון עקב מוטציה G2019S. הערה שיורית גם זירחון של MBP בנתיב מת קינאז. זה יכול להיות בגלל אבלציה שלם של פעילות קינאז של LRRK2 ידי מוטציה D1994A או לשקף את נוכחות of עקבות זיהום קינאזות התגובה. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1.

<ol>
	<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+ROCO+proteins+in+health+and+disease.">The function of ROCO proteins in health and disease.</a> Biol. Cell. 101, 183-191 (2009).</li><li>Paisan-Ruiz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson's+disease.">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44, 595-600 (2004).</li><li>Zimprich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology.">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44, 601-607 (2004).</li><li>West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease-associated+mutations+in+leucine-rich+repeat+kinase+2+augment+kinase+activity.">Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 16842-16847 (2005).</li><li>Gloeckner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson+disease+causing+LRRK2+mutation+I2020T+is+associated+with+increased+kinase+activity.">The Parkinson disease causing LRRK2 mutation I2020T is associated with increased kinase activity.</a> Hum. Mol. Genet. 15, 223-232 (2006).</li><li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R1441C+mutation+of+LRRK2+disrupts+GTP+hydrolysis.">The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 668-671 (2007).</li><li>Greggio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+activity+is+required+for+the+toxic+effects+of+mutant+LRRK2/dardarin.">Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin.</a> Neurobiol. Dis. 23, 329-341 (2006).</li><li>Smith, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+activity+of+mutant+LRRK2+mediates+neuronal+toxicity.">Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity.</a> Nat. Neurosci. 9, 1231-1233 (2006).</li><li>Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+selective+inhibitor+of+the+Parkinson's+disease+kinase+LRRK2.">Characterization of a selective inhibitor of the Parkinson's disease kinase LRRK2.</a> Nat. Chem. Biol. 7, 203-205 (2011).</li><li>Lee, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+leucine-rich+repeat+kinase-2+protect+against+models+of+Parkinson's+disease.">Inhibitors of leucine-rich repeat kinase-2 protect against models of Parkinson's disease.</a> Nat. Med. 16, 998-1000 (2010).</li><li>Nichols, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+inhibitors+of+LRRK2,+a+protein+kinase+mutated+in+Parkinson's+disease.">Substrate specificity and inhibitors of LRRK2, a protein kinase mutated in Parkinson's disease.</a> The Biochemical Journal. 424, 47-60 (2009).</li><li>Anand, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+leucine-rich+repeat+kinase+2:+enzymological+properties+and+novel+assays.">Investigation of leucine-rich repeat kinase 2: enzymological properties and novel assays.</a> FEBS. J. 276, 466-478 (2009).</li><li>Daniels, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+mode+of+action+of+the+LRRK2+Y1699C+pathogenic+mutant.">Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant.</a> Journal of Neurochemistry. 116, 304-315 (2011).</li><li>Jaleel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+phosphorylates+moesin+at+Thr558;+characterisation+of+how+Parkinson's+disease+mutants+affect+kinase+activity.">LRRK2 phosphorylates moesin at Thr558; characterisation of how Parkinson's disease mutants affect kinase activity.</a> Biochem. J. , (2007).</li><li>Qing, H., Wong, W., McGeer, E. G., McGeer, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lrrk2+phosphorylates+alpha+synuclein+at+serine+129:+Parkinson+disease+implications.">Lrrk2 phosphorylates alpha synuclein at serine 129: Parkinson disease implications.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 387, 149-152 (2009).</li><li>Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+4E-BP+by+LRRK2+affects+the+maintenance+of+dopaminergic+neurons+in+Drosophila.">Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila.</a> Embo. J. 27, 2432-2443 (2008).</li><li>Greggio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson+disease-associated+leucine-rich+repeat+kinase+2+(LRRK2)+is+a+dimer+that+undergoes+intramolecular+autophosphorylation.">The Parkinson disease-associated leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a dimer that undergoes intramolecular autophosphorylation.</a> J. Biol. Chem. 283, 16906-16914 (2008).</li><li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome.">The protein kinase complement of the human genome.</a> Science. 298, 1912-1934 (2002).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מאמר זה מתאר את פרוטוקול הבסיסי assaying פעילות קינאז של LRRK2 שימוש במערכת במבחנה. ב את האינטרסים של קוצר, זה הוגבל תבנית של שעה סיום נקודת באמצעות מצע כללי, אבל כללי הפרוטוקול חל על מגוון רחב של מצעים פוטנציאליים מקובל ניתוחים מתוחכמים יותר לבחון את הקינטיקה של פעילות קינאז של LRRK2 . זה מדגיש את אחד היתרונות העיקריים של שימוש במערכת חוץ גופית כדי לבחון את התנהגות קינאז של חלבונים כגון זה: כי יש שליטה מלאה על הריכוזים של האנזים ואת המצע, ניתן להפיק נתונים הקינטית לחשב K מ &#39; ו-V max ערכי התגובה. עבור הערכות הקינטית מפורט יותר או להעריך את ההשפעה של מעכבי המשוערת, מערכת תפוקה גבוהה יותר (כמו זו הניתנת באמצעות המצע LRRKtide, זמינים Invitrogen) הוא alternati מעולהיש לפנות המתואר כאן. חשוב, עם זאת, להכיר בכך מודל רדוקציוניסט מערכת שמספקת ב מבחני חוץ גופית kinase הוא רק אחד הכלים לבחון את הביולוגיה של קינאז והיחסים שלה עם מצעים פוטנציאליים. מנתוני מבחני כגון זה יש להשתמש בשילוב עם גישות אחרות כדי לקבל תמונה מקיפה של כמה קינאז מתנהג במבחנה בהקשר הסלולר. לדוגמה, מצע המשוערת phosphorylated במבחנה ניתן לנתח על ידי ספקטרומטריית מסה לזהות phosphosites ייתכן כי לאחר מכן ניתן לטפל על ידי mutagenesis ממוקד (למשל. סרין או תראונין המרת acceptor פוספט שאריות במעלה-phosphorylatable שאריות כמו אלאנין) כדי לבחון את תפקודי ההשלכות של vivo לשעבר זרחון. שיקול מרכזי בפרשנות נתונים ממערכת חוץ גופית ב assay כגון זה הסבירות either סוג I או מסוג II (חיובי או שלילי שקר שקר) שגיאות. אופי הרדוקציוניסטית של מערכת זו למרבה הצער נפטר אותו שניהם - במקרה של לשעבר, בעל המצע המשוערת מטוהרים מטוהרים קינאז בסמיכות מלאכותי בריכוז גבוה (לעומת הסביבה התאית) יכול לגרום לאירועים זירחון artefactual. לעומת זאת, קינאזות רבים לתפקד כחלק ממכלול בהקשר של התא, דורשים שיתוף הגורמים זירחון של מצע מסוים להתרחש. כפי שצוין לעיל, תוצאה חיובית של זירחון של מצע המשוערת שימוש במערכת assay במבחנה אז צריך להיבדק במערכת התאית כדי לאמת את התוצאה, וגם תוצאה שלילית יש לפרש בזהירות. לאור זאת, חשוב היכן ניתן לקבל בקרות חיוביות ושליליות כדי לאפשר מחקר השוואתי של פעילות קינאז העניין שלך. בחירה קפדנית של contro חיוביתאני בעל פעילות ידועה כלפי חלבון העניין שלך, יחד עם שליטה שלילית כי סביר phosphorylate המצע המשוערת שלך, הוא יקר מאוד. אחת לשלוט מועמד LRRK2 הוא קולטן אינטראקציה kinase 3, שבה יש רצף העיקרי קשור קשר הדוק לתחום קינאז של LRRK2 אבל יש מבנה שונה מאוד תחום הכולל 18. זה זמין כמו חלבון רקומביננטי מ Invitrogen והוא משמש כביקורת רגילה במעבדה שלנו. ראוי גם לציין כי טופס זמינים מסחרית של LRRK2 חסרה את N-הסופית של החלבון ואת מתויג גלוטתיון-s-transferase ואת זה צריך להילקח בחשבון כגורם פוטנציאלי בלבול בעת ביצוע מבחני קינאז עם חלבון זה, כמו לא ידוע מה התפקיד של N-מסוף LRRK2 עשוי לשחק בתפקוד התקין של חלבון זה. אם, למשל, את החלק של N-מסוף LRRK2 כי הוא נעדר החלבון משמש פרוטוקול זההוא קריטי עבור גיוס של מצע מסוים לתחום קינאז של LRRK2 אז זו תהיה השפעה גדולה על זירחון הנצפה אמר המצע של מערכת חוץ גופית שתוארו לעיל. למרות אזהרות אלה, לעומת זאת, ייחסו חשיבות הביולוגיה של LRRK2 במחקר פרקינסון מדגיש את התועלת של פרוטוקול זה ככלי בעל ערך חוקרת את ההתנהגות של חלבון זה במסגרת חוץ גופית.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערה </td></tr><tr><td> LRRK2 בר סוג </td><td> Invitrogen </td><td> PV4873 </td><td></td></tr><tr><td> LRRK2 G2019S </td><td> Invitrogen </td><td> PV4881 </td><td></td></tr><tr><td> LRRK2 D1994A </td><td> Invitrogen </td><td> PV6051 </td><td></td></tr><tr><td> קינאז חיץ </td><td> Cell איתות </td><td> 9802S </td><td></td></tr><tr><td> MBP </td><td> סיגמא </td><td> M1891 </td><td></td></tr><tr><td> 32P g-ATP </td><td> פרקין אלמר </td><td> BLU002X500UC </td><td> 500μCi, 30Ci / mMole </td></tr><tr><td> חיץ 4x LDS מדגם </td><td> Invitrogen </td><td> NP0007 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> סיגמא </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> חלבון תקני </td><td> Invitrogen </td><td> LC5800 </td><td></td></tr><tr><td> מגבים לרוץ חיץ </td><td> Invitrעוגן </td><td> NP0001 </td><td></td></tr><tr><td> Bis-טריס acrylamide ג&#39;ל </td><td> Invitrogen </td><td> NP0321 </td><td> 4-12% 1mm 10well </td></tr><tr><td> PVDF קרום </td><td> Millipore </td><td> IPVH00010 </td><td></td></tr><tr><td> העברת חיץ </td><td> Invitrogen </td><td> NP0006 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1. ריאגנטים מזוקקים ו-de מיוננים מים ששימשה את כל הצעדים דילול <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> סוג ציוד </td><td> חברה </td><td> הערה </td></tr><tr><td> מונה גייגר </td><td> מיני מכשירים </td><td></td></tr><tr><td> טנק SDS PAGE </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> העברת טנק </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> מחממים אבני (2) </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> זרחן מסך </td><td> GE </td><td> רנטגן הסרט ניתן להחליף </td></tr><tr><td> זרחן imager </td><td> GE </td><td></td></tr><tr><td> חשיפה קלטת </td><td> GE </td><td></td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> מיגון פרספקס </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1.5ml צינורות </td><td> VWR </td><td> בורג בראש עם טבעת O </td></tr></tbody></table> טבלה 2. ציוד

assaying the kinase activity of lrrk2 in vitro

קינאז leucine חזור ריץ&#39; 2 (LRRK2) הוא חבר 2527 חומצת אמינו המשפחה Roco של חלבונים, בעלת מבנה מורכב, multidomain כולל תחום GTPase (המכונה ROC, עבור ראס של חלבונים מורכבים) ואת תחום kinase 1. הגילוי בשנת 2004 של מוטציות הגורמות LRRK2 מחלת הפרקינסון (PD) הביא LRRK2 להיות המוקד של נפח עצום של מחקר על תפקוד תקין שלה ואיך החלבון משתבש במצב מחלה 2,3. חקירה ראשונית לתוך הפונקציה של LRRK2 התמקדה הפעילות האנזימטית שלו 4-6. למרות תמונה ברורה טרם לצוץ של שינוי עקבי אלה עקב מוטציות, נתונים ממספר קבוצות הדגיש את החשיבות של פעילות קינאז של LRRK2 מוות של תאים המקושרים מוטציות 7,8. פרסומים אחרונים מדווחים מעכבי מיקוד פעילות קינאז של LRRK2, מתן כלי ניסיוני מפתח 9-11. לאור נתונים אלה,סביר להניח כי המאפיינים האנזימטית של LRRK2 להרשות לנו חלון חשוב לתוך הביולוגיה של חלבון זה, אף אם הם מטרות תרופה פוטנציאל פרקינסון פתוח לדיון. מספר גישות שונות שימשו assay פעילות קינאז של LRRK2. בתחילה, מבחני בוצעו באמצעות חלבון מתויג epitope overexpressed שורות תאים יונקים immunoprecipitated, עם מבחני שבוצעו באמצעות חלבון משותקת על חרוזים agarose 4,5,7. לאחר מכן, מטוהרים שברי רקומביננטי של LRRK2 בתמיסה יש גם שימש, למשל קטע GST מתויג מטוהרים מתאי חרקים המכיל שאריות 970-2527 של LRRK2 12. לאחרונה, דיווחו דניאלס et al. בידודה של LRRK2 באורך מלא בתמיסה של האדם תאים עובריים כליה, אך חלבון זה אינו זמין נרחב 13. לעומת זאת, היתוך GST חתוכים בצורת LRRK2 הוא availabl מסחריתדואר (מ Invitrogen, ראה טבלה 1 לפרטים נוספים), והיא מספקת כלי נוח עבור הוכחת assay לפעילות LRRK2 קינאז. יציאות שונות על פעילות קינאז LRRK2 דווחו. Autophosphorylation של LRRK2 עצמו, זירחון של חלבון המיאלין הבסיסי (MBP) בתור מצע קינאז זירחון גנריים של מצע מלאכותי - LRRKtide המכונה, בהתבסס על זירחון של תראונין 558 ב Moesin - כל שימשו, כפי שיש בסדרה של מצעים פיזיולוגיים המשוערת כולל α-synuclein, Moesin ו 4-EBP 14-17. מעמדו של החלבונים האלה כמו מצעים עבור LRRK2 עדיין לא ברור, וככזה פרוטוקול המתואר להלן יתמקד באמצעות MBP כמו מצע גנריות, וציין את תוכנית השירות של מערכת זו על פעילות קינאז LRRK2 assay כנגד מגוון רחב של מצעים פוטנציאליים.

Watch this Scientific Journal Video about Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro at JoVE.com

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

קינאז leucine חזור ריץ&#39; 2 הוא קינאז multidomain גדול, מוטציות שהן הגורם הגנטי השכיח ביותר של מחלת פרקינסון. ניתוח של פעילות קינאז של החלבון הזה הוכיחה להיות כלי חיוני בהבנת הביולוגיה תפקוד של חלבון זה. במאמר זה,<em&gt; במבחנה</em&gt; Assaying פעילות קינאז של LRRK2 ומבחר מוטנטים שלה מתואר, המספקת מערכת הניסוי לבחון זירחון של מצעים המשוערת וכשל פוטנציאלי של LRRK2 במחלה.

Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

assaying-the-kinase-activity-of-lrrk2-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

22.5K Views.  UCL Institute of Neurology. קינאז leucine חזור ריץ' 2 הוא קינאז multidomain גדול, מוטציות שהן הגורם הגנטי השכיח ביותר של מחלת פרקינסון. ניתוח של פעילות קינאז של החלבון הזה הוכיחה להיות כלי חיוני בהבנת הביולוגיה תפקוד של חלבון זה. במאמר זה, במבחנה Assaying פעילות קינאז של LRRK2 ומבחר מוטנטים שלה מת...

Video: Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals. Here, we describe an in vitro assay, "the reorientation assay", that has been used extensively to study the effect of extrinsic and intrinsic signals on the orientation of commissural axons2. This assay was developed by numerous people in the laboratories of Jane Dodd, Thomas Jessell and Andrew Lumsden (see acknowledgements for more details) and versions of this assay were used to demonstrate the reorientation activities of key axon guidance molecules, including the BMP chemorepellent in the roof plate3,4 and the chemoattractive activities of Netrin15 and Sonic Hedgehog (Shh)6 in the floor plate in the spinal cord.
Explants comprising 2-3 segments of the dorsal two-thirds of spinal cord are dissected from embryonic day (E) 11 rats and cultured in three dimensional collagen gels7. E11 dorsal spinal explants contain newly born commissural neurons, which can be identified by their axonal expression of the glycoprotein, Tag18. Over the course of 30-40 hours in culture, the commissural axon trajectory is recapitulated in these dorsal explants with a time course similar to that seen in vivo. This axonal trajectory can be challenged by placing either test tissues or a COS cell aggregate expressing a candidate signaling molecule in contact with one of the lateral edges of the dorsal explant. Commissural axons extending in the vicinity of the appended tissue will grow under the influence of both the endogenous roof plate and signals from the ectopic lateral tissue. The degree to which commissural axons are reoriented under these circumstances can be quantified. Using this assay, it is possible both to examine the sufficiency of a particular signal to reorient commissural axons3,4 as well the necessity for this signal to direct the commissural trajectory9.

This assay assesses the ability of a signaling molecule, here Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP7), to reorient commissural axons. An explant of embryonic dorsal spinal cord is cultured adjacent to an aggregate of COS cells secreting the candidate growth factors. Reoriented commissural axons growing within the explant are visualized by immunohistochemistry.

Assaying את היכולת של מולקולות איתות Diffusible כדי כיוון מחדש עובריים האקסונים Commissural השדרה

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

זיהוי ישיר של פעילות Acetate יוצרי של קינאז Acetate אנזימים

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם<em&gt; במבחנה</em

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

מנסה לאמוד השפלה proteasomal במערכת תא ללא בצמחים

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

מדידה של הזחל פעילות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; צג פעילות

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.