העבודה שלנו נתמך על ידי השוויצרי הקרן הלאומית למדע (SNF), יוזמת שווייץ Systems Biology (SystemsX.ch), ניוון שרירים האגודה ארה&quot;ב (MDA), את Francaise האגודה contre לס Myopathies (AFM), מיטוכונדריאלי הברית מחלות קרן (UMDF), Gebert-רוף קרן תכנית מחלות נדירות (פוי), החברה השוויצרית למחקר של מחלות שריר (SSEM / FSRMM), החיים השוויצרי &quot;Jubiläumsstiftung für und Volksgesundheit medizinische Forschung&quot;, מחקר רוש קרן האוניברסיטה באזל.

1. הכנת תרבית תאים ראשונית האדם שריר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים תא תרבויות האדם שריר על פי טכניקה explantation מחדש, explantation 4. ראשית, להסיר רקמת השריר הלא מהתאים. לאחר מכן, להטביע 1 3 מ&quot;מ explants שרירים מקרש של פלזמה, אשר מאפשר fibroblasts לצאת מן explants את. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Explants המוטבע מועברים על גבי צלחת פלזמה ג&#39;לטין מצופה ולתת להם לגדול במצע גידול רגיל (MEM השלימו עם המדיום 25% 199, 10% עוברית שור בסרום [FBS], 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אינסולין, 10 ng / ml גדילה אנושי גורם אפידרמיס [EGF], 12.5 ng / ml הגורם האנושי גידול פיברובלסטים [FGF]) בשכבה. התאים העולות explants בתנאים האלה לתאי שריר. תאים אלה ימשיכו לגדול בשכבה לאחר הסרת explants את. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים aneurally על 0.1 ג&#39;לטין מצופים צלחות% במצע הגידול הרגיל. התאים יכולים להיותבתרבית aneurally ו מוגבר לפי הצורך. עדיף להשתמש בתאי שריר במעבר בין 3 ל 8 כדי לבצע את שיתוף תרבויות. זה קריטי כדי innervate myotubes צעירים, לאחר מועד זה, שותף תרבויות יש סיכון גבוה של אי. יתר על כן, myotubes לא צריך להיות גדול מדי, סמיך מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לפני העצבוב מתוכנן, צלחת לתאי השריר על 35 מ&quot;מ תרבות מנות רקמות (או 6 צלחות גם) בצפיפות של 500,000 תאים לכל צלחת במצע גידול רגיל. בצפיפות זה, התאים נמצאים confluency הנכון כדי להפעיל את היתוך למחרת, ואת העצבוב לאחר יום לאחר מכן. שימוש באותם תנאים, myotubes הם בשלב הנכון העצבוב אופטימלית התכווצות סיב לאחר מכן ומכאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להחליף את מדיום הגידול הרגיל עם המדיום היתוך מורכב MEM השלימו עם המדיום 25% 199, 5% FBS, 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אינסולין 1% של פניצילין / סטרפטומיצין. </li></ol> 2. Isolati<html> על של Explants עובריים עכברוש טבורי עמוד השדרה ההליך כולו על מנת לבודד את explants בעמוד השדרה מתבצע תחת מיקרוסקופ דו עינית, על תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS, Gibco / Invitrogen נ&quot;צ 14170) המכיל 10% בסרום שור עוברית (FBS). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה חיוני כי עוברי עכברים הם בין ED 13 ו - 14 כשלב התפתחות שונה היה לסכן את כל התהליך. להקריב את האישה ההרה עם CO 2 ולאסוף את שרשרת העובר שלם בינוני HBSS. לבודד את כל העובר ואת לערוף להם המתת חסד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את חוט השדרה העובר משאר הגוף בריא ושלם ולהסיר השריר שמסביב רקמת חיבור. להיות זהירים מאוד כדי לשמור על הגב ganglions שורש (DRGs) המחוברים בחוט השדרה על מנת להבטיח עצבוב פונקציונלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל פרוסה חוט השדרה transversally באופן explant מכיל לפחות 2 DRG קשור אליו (explants של 1 מ&quot;מ 3). </li></ol><html> ove_title &quot;&gt; 3. העצבוב של אדם לתאי שריר עם עובריים Explants עכברוש חוט השדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני היתוך לתרבות תא שריר, משאיר שכבה דקה של המדיום על monolayer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את explants בזהירות על שכבת השריר התא, חמש explants במרווחים קבועים זה מזה בכל צלחת 35 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף לאט לאט, טיפה בינוני חכם, היתוך explant על כל אחד. יש צורך להוסיף בינונית לתאי השריר כדי לשרוד, אבל לא יותר מדי כדי לאפשר את explants לדבוק הראשון ליצור קשר עם התאים. אם המדיום הוא לא הוסיף כראוי (יותר מדי חזק או בינוני יותר מדי), explants את יצוף ויהיה אינם innervate לתאי השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר explants מתחילים לדבוק, למעלה בינוני היתוך 2 מ&quot;ל לכל צלחת 35 מ&quot;מ, ולשים את הכלים בזהירות רבה לתוך אינקובטור. </li></ol> 4. תחזוקה של עצבים שרירים Heterologous שיתופי תרבויות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את המדיום היתוך פעמיים בשבוע. </li></ol>_title &quot;&gt; 5. נציג תוצאות ברגע יומיים לאחר עצבוב, ניתן לראות את neurites העולה מתוך explant כל קשרים עם לתאי השריר, המיוצגים על ידי כפתור כמו מבנים (איור 1). כבר 4-6 ימים לאחר עצבוב, כמה סיבים בודדים יתחיל להתכווץ. הצירים להימשך חודשים רבים, שמר פשוט על ידי שינוי תרבות בינונית פעמיים בשבוע. אחרי בערך 2 שבועות, explant חוט השדרה עצמו מתנוון, אבל העצבוב נשמרת. זה נורמלי. שכבה דקה של מרכיב העצב נשאר על פני השטח של שכבת תא השריר. זו רשת העצבים מספיק כדי לשמור את הפונקציונליות של יחידת המנוע. אם explants צפים במדיום יום לאחר עצבוב, הם לעולם לא תדבק. זה קורה כאשר שכבת תא שריר הואלא confluent מספיק, או כאשר אמצעי נוסף גם פחות או יותר. לפעמים, את שומרת explant אבל לא neurites תצא. סביר להניח עקב חוסר של DRG המצורפת אליו. במקרה זה, כמו גם, עצבוב לא יוקם. לתפעל את הכלים בזהירות רבה בשבוע הראשון, כמו explants את עדיין יכולה לנתק בקלות. להחליף את המדיה היתוך, מוסיפים את הנוזל ירידה מבחינת במהירות מינימלית, כדי למנוע ניתוק התא. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3616/3616fig1.jpg" /> באיור 1. חוט השדרה, שרירים explants תא שיתוף תרבויות מיום 1 עד יום 15.

<ol>
	<li>Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+myotube+differentiation+in+vitro+in+different+culture+conditions.">Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions.</a> Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).</li><li>Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+muscle+cultured+in+monolayer+and+cocultured+with+fetal+rat+spinal+cord:+importance+of+dorsal+root+ganglia+for+achieving+successful+functional+innervation.">Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation.</a> J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).</li><li>Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+muscular+abnormalities+in+culture+in+spinal+muscular+atrophy.">Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy.</a> Lancet. 345, 694-695 (1995).</li><li>Askanas, V., Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+program+for+investigating+adult+human+skeletal+muscle+grown+aneurally+in+tissue+culture.">A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture.</a> Neurology. 25, 58-67 (1975).</li><li>Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+required+to+efficiently+innervate+human+muscle+cells+in+vitro.">Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro.</a> Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).</li><li>Lefebvre, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+spinal+muscular+atrophy-determining+gene.">Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene.</a> Cell. 80, 155-165 (1995).</li><li>Schrank, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+survival+motor+neuron+gene,+a+candidate+gene+for+human+spinal+muscular+atrophy,+leads+to+massive+cell+death+in+early+mouse+embryos.">Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).</li><li>Hsieh-Li, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+spinal+muscular+atrophy.">A mouse model for spinal muscular atrophy.</a> Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).</li><li>Monani, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+centromeric+survival+motor+neuron+gene+(SMN2)+rescues+embryonic+lethality+in+Smn(-/-)+mice+and+results+in+a+mouse+with+spinal+muscular+atrophy.">The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).</li><li>Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+mouse+models+to+understanding+the+pathogenesis+of+spinal+muscular+atrophy.">The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy.</a> Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).</li><li>Durbeej, M., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscular+dystrophies+involving+the+dystrophin-glycoprotein+complex:+an+overview+of+current+mouse+models.">Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models.</a> 12, 349-361 (2002).</li><li>Schnabel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience:+Standard+model.">Neuroscience: Standard model.</a> Nature. 454, 682-685 (2008).</li><li>Benatar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+translation:+treatment+trials+in+the+SOD1+mouse+and+in+human+ALS.">Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS.</a> Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).</li><li>Dorchies, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+innervation+and+differentiation+of+X-linked+myotubular+myopathy+muscle+cells+in+a+nerve-muscle+coculture+system.">Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system.</a> Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).</li><li>McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+innervation+of+cultured+human+muscle+overexpressing+betaAPP+experimentally+and+genetically:+relevance+to+inclusion-body+myopathies.">Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies.</a> Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

כלי במבחנה פיזיולוגי ללמוד התא תפקוד השרירים בהקשר רגיל וגם בזמן מחלה מעניין הגבוה ביותר myologists, כי התא תרבויות שרירים בדרך כלל לא לשחזר את החשיבות של מספר תאים ותא מסוג חיבורים. תוספת של מטוהרים הנוירונים המוטוריים לתאי השריר אינה מספיקה כדי להשיג את יחידת המנו?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 14170 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31095 </td></tr><tr><td> בינוני 199 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31153 </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> שיבוט עוברי Perbio </td><td> SH30066.03 </td></tr><tr><td> Insuline </td><td> סיגמא </td><td> I9278 </td></tr><tr><td> האדם EGF </td><td> סיגמא </td><td> E9644 </td></tr><tr><td> אדם FGF </td><td> סיGMA </td><td> F0291 </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין פתרון </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td></tr></tbody></table>

a functional motor unit in the culture dish: co-culture of spinal cord explants and muscle cells

אדם לתאי שריר ראשוניים בתרבית aneurally בשכבה כמעט באופן ספונטני, כי החוזה, בהעדר מרכיב העצב, התמיינות תאים מוגבל גירוי נוירון מוטורי חסר 1. מגבלות אלה לעכב את המחקר במבחנה ב neuromuscular של מחלות רבות בתאי שריר בתרבית. חשוב לציין, מגבלות הניסוי של תאים בתרבית monolayered שרירים ניתן להתגבר על ידי עצבוב התפקודי של myofibers עם explants בעמוד השדרה של שיתוף תרבויות. כאן, אנו מציגים את השלבים השונים הנדרשים על מנת להשיג העצבוב יעיל, תקין של אדם לתאי שריר ראשוניים, המוביל להשלים את התכווצות בידול וסיבים לפי השיטה שפותחה על ידי Askanas 2. כדי לעשות זאת, תא שריר שיתוף תרבותי עם explants בעמוד השדרה של עוברי עכברים בבית ED 13.5, עם הגרעינים השורש הגבי מחוברת עדיין את פרוסות בעמוד השדרה. אחרי כמה ימים, שרירים Fibers להתחיל להתכווץ בסופו של דבר בין מפוספס דרך העצבוב על ידי neurites תפקודית מקרין מן explants בעמוד השדרה כי בהתחברות לתאי השריר. מבנה זה יכול להישמר במשך חודשים רבים, פשוט על ידי דיאלוג על בסיס קבוע בינוני התרבות. יישומים של כלי זה הן רבות שלא יסולא בפז, שכן היא מייצגת מודל פונקציונלי ניתוח רב תחומי של פיתוח שרירים העצבוב האדם. למעשה, שלמה דה נובו ההתקנה צומת neuromuscular מתרחשת בצלחת התרבות, המאפשר מדידה קלה של פרמטרים רבים בכל שלב, בהקשר יסודי פיזיולוגית. רק כדי להזכיר כמה דוגמאות, גנומית ו / או מחקרים proteomic יכול להתבצע ישירות על שיתוף תרבויות. יתר על כן, תופעות לפני ואחרי סינפטי ניתן להעריך במיוחד ובנפרד בצומת neuromuscular, כי שני הרכיבים מגיעים מינים שונים,עכברוש האדם, בהתאמה. עצב, שריר שיתוף תרבות יכולה גם להתבצע עם אדם לתאי שריר מבודד לחולים הסובלים ממחלות שריר או neuromuscular 3, ולכן יכול לשמש ככלי מיון עבור תרופות המועמד. לבסוף, ציוד מיוחד, אך לא מתקן קבוע BSL2 צורך לשחזר יחידה תפקודית מוטורית בצלחת התרבות. שיטה זו ולכן הוא בעל ערך שריר הן, כמו גם בקהילות מחקר neuromuscular ללימודי פיזיולוגיות מכניסטית של הפונקציה neuromuscular, בהקשר הרגיל ומחלות.

Watch this Scientific Journal Video about A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells at JoVE.com

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

בתאי שריר בתרבית הם מודל לקוי לשחזר שרירים מעוצבבים<em&gt; In vivo</em&gt;. יחידת המנוע תפקודית ניתן לשחזר<em&gt; במבחנה</em&gt; על ידי עצבוב של האדם תאים הבדיל השריר העיקרי העובר באמצעות חולדה explants חוט השדרה. מאמר זה מתאר כיצד שיתוף תרבויות explants בעמוד השדרה ותאי שריר מבוססים.

יחידת מנוע פונקציונלית בצלחת תרבות: עמית תרבות Explants חוט השדרה לתאי השריר

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

a-functional-motor-unit-culture-dish-co-culture-spinal-cord-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K Views.  University of Basel. בתאי שריר בתרבית הם מודל לקוי לשחזר שרירים מעוצבבים In vivo. יחידת המנוע תפקודית ניתן לשחזר במבחנה על ידי עצבוב של האדם תאים הבדיל השריר העיקרי העובר באמצעות חולדה explants חוט השדרה. מאמר זה מתאר כיצד שיתוף תרבויות explants בעמוד השדרה ותאי שריר מבוססים.

Video: A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Dissection והתרבות של גנגליון צ&#39;יק Statoacoustic Explants ואת חוט השדרה ג&#39;ל קולגן עבור מבחני תוצאה Neurite

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

פרוטוקול עוף עובר חוט שדרת Slice תרבות

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena are not well understood yet. In particular, the role of innervation in tooth development and regeneration is neglected.
Several in vivo studies have provided important information about the patterns of innervation of dental tissues during development and repair processes of various animal models. However, most of these approaches are not optimal to highlight the molecular basis of the interactions between nerve fibres and target organs and tissues.
Co-cultures constitute a valuable method to investigate and manipulate the interactions between nerve fibres and teeth in a controlled and isolated environment. In the last decades, conventional co-cultures using the same culture medium have been performed for very short periods (e.g., two days) to investigate the attractive or repulsive effects of developing oral and dental tissues on sensory nerve fibres. However, extension of the culture period is required to investigate the effects of innervation on tooth morphogenesis and cytodifferentiation.
Microfluidics systems allow co-cultures of neurons and different cell types in their appropriate culture media. We have recently demonstrated that trigeminal ganglia (TG) and teeth are able to survive for a long period of time when co-cultured in microfluidic devices, and that they maintain in these conditions the same innervation pattern that they show in vivo.
On this basis, we describe how to isolate and co-culture developing trigeminal ganglia and tooth germs in a microfluidic co-culture system.This protocol describes a simple and flexible way to co-culture ganglia/nerves and target tissues and to study the roles of specific molecules on such interactions in a controlled and isolated environment.

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

ניתוח של פיתוח שיניים נבט עצבוב שימוש בהתקני Microfluidic משותף התרבות

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

כריתת למינציה ואת חוט השדרה חלון השרשה בעכבר

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

זיהוי סמני שטח תא של גזע עצבי ראשוני ובתאי מחולל מטבולית על ידי תיוג מטבולי של סילוגליקן

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. Injection directly into spinal cord tissue bypasses these barriers, providing access to cell bodies or synapses where molecules can be incorporated. Combining viral vector technology with this method allows for introduction of target genes into nervous tissue for the purpose of gene therapy or tract tracing. Here a virus engineered for highly efficient retrograde transport (HiRet) is introduced at the synapses of propriospinal interneurons (PNs) to encourage specific transport to neurons in the spinal cord and brainstem nuclei. Targeting PNs takes advantage of the numerous connections they receive from motor pathways such as the rubrospinal and reticulospinal tracts, as well as their interconnection with each other throughout spinal cord segments. Representative tracing using the HiRet vector with constitutively active green fluorescent protein (GFP) shows high fidelity details of cell bodies, axons and dendritic arbors in thoracic PNs and in reticulospinal neurons in the pontine reticular formation. HiRet incorporates well into brainstem pathways and PNs but shows age dependent integration into corticospinal tract neurons. In summary, spinal cord injection using viral vectors is a suitable method for introduction of proteins of interest into neurons of targeted tracts.

This protocol demonstrates injection of a retrogradely transportable viral vector into rat spinal cord tissue. The vector is taken up at the synapse and transported to the cell body of target neurons. This model is suitable for retrograde tracing of important spinal pathways or targeting cells for gene therapy applications.

הזרקה ישירה של וקטור Lentiviral מדגיש מספר מסלולים מוטוריים בחוט השדרה עכברוש

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

המרה של האדם המושרה Pluripotent תאי גזע (iPSCs) לתוך השדרה פונקציונלי והגולגולת נוירונים מוטוריים באמצעות שימוש בווקטורים הגולגולתית

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...