אנו מודים סנדרה ברגן לקבלת תמיכה טכנית מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי מחלקת המחקר חלבון (PRD, TP A1.2 (RC ו-TS), ואת מחקר RUB Fond, Rektoratsprogramme -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) נוגדנים חד שבטיים 39.4D5 ו F55A10 התקבלו ללימודי התפתחותית Hybridoma בנק (DSHB, איווה העיר, IA).

עבור ריאגנטים מיוחד: לראות Tab. 1. כל ריאגנטים אחרים הרשומים הם באיכות תרבות כיתה התא המתקבל סיגמא אולדריץ&#39;. 1. PORN-H/laminin ציפוי של כלים / coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עבודה של 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​Poly-DL-ornithine hydrobromide (פורנו-H) ב 150 pH borate חיץ mM 8.35. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון המניות של פורנו 50 / 1 חוצץ מ&quot;ג borate מ&quot;ל ניתן להכין מראש ומאוחסנים ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר coverslips זכוכית ידי בוערים באתנול 100% ולתת להם אוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את פני השטח עם פתרון פורנו-H מספיק לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת לשטוף שלוש פעמים במים מעוקרים אוויר יבש coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עבודה של 2.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​laminin HBSS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquots ניתן לאחסן ב -20 ° C. הפשירי ב 4 ° C מיד לפני השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את פני השטח של פורנו-H מצופה coverslips עם פתרון laminin ולתת להם לדגור במשך שעות לפחות 2 בטמפרטורת החדר עד לשימוש. </li></ol> 2. ציפוי לקטינים הצלחת טיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסה של 10 mM טריס במים מעוקרים, pH 9.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לקטינים (לפתור את לקטינים (Sigma L9640) אבקת HBSS) לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל את פני השטח של צלחת 10 ס&quot;מ עם תא תרבות מ&quot;ל 8 של הפתרון לקטינים ולתת לו דגירה של לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את צלחת שלוש פעמים עם HBSS ולאחסן HBSS עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן KCl 30mm, 0.8% (w / v) NaCl depolarisation-פתרון. לעקר על ידי סינון לאחסן בטמפרטורת החדר (RT). </li></ol> 3. Motoneuron בינוני תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוס הפשירי סרום לילה ב 4 ° C ו להשבית ב 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, Aliquot לתוך 5 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 ° C. Aliquot הפשירי ישירות לפני השימוש ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות B27-תוספת של 1 aliqouts מ&quot;ל ב -20 ° C. הפשירי תוסף B27 ב RT מיד לפני השימוש. הימנע מחזורים להקפיא להפשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Glutamax Aliquot לתוך 0.5 aliquots מ&quot;ל ולאחסן ב -20 ° C ולהשתמש בו ב 1:100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​CNTF במים מעוקרים BSA עם 0.1%. חנות ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 46 מ&quot;ל neurobasal בינוני עם 2.5 מ&quot;ל סרום סוס, 1 מ&quot;ל B27-תוספת ו 0.5 מ&quot;ל glutamax ישירות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף CNTF לריכוז סופי של המדיום ng / ml 10 מראש חם בינוני עד 37 ° C. </li></ol> 4. חוט השדרה לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן עכבר E12.5 בהריון להסיר את העוברים בזהירות. הוסף מספיק RT HBSS כדי לכסות לחלוטין את העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הראש והזנב המקום הצד האחורי עובר עם גפיים רכובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את העובר עם מלקחיים ולהסיר את העור החיצונית עם מלקחיים אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את עמוד השדרה על ידי פירסינג מלקחיים תחתיה והרימו אותו במסור כמו תנועות משני צידי עמוד השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את חוט השדרה מבודד לצלחת חדשה עם HBSS לפתוח את הערוץ המרכזי של חוט השדרה בצד הגבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים את הגרעינים השורש הגבי על ידי הסרת קרומי המוח מצרף של חוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף החלקים המותני של מיתרי השדרה של עד 6 עוברים לכל צלחת לקטינים בצינור תגובה Eppendorf מלא 1 HBSS מ&quot;ל ולאחסן על הקרח עד ההכנה נעשית. </li></ol> 5. העשרה של motoneurons ידי טיהור לקטינים מבוססי הערה: לפני שמתחילים את הצעדים הבאים, האחרונה כאן להכין prewarm הבינוני (ראה שלב 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון טריפסין על ידי פתירת 1 גרם טריפסין ב HBSS 100 מ&quot;ל, חנות ב -20 ° C ו להפשיר ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 1g מעכבי טריפסין עם 98 HBSS מ&quot;ל ו 2 מ&quot;ל של 1 M HEPES pH 7.4, 1 aliquots מ&quot;ל צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הצינור עם מיתרי השדרה כדי ברדס תרבית תאים ובזהירות להסיר 700 μl של HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 7.5 פתרון טריפסין μl ומערבבים על ידי צינור היפוך בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע trypsination דקות 8 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את התגובה על ידי הוספת 30 μl מעכב טריפסין ו פיפטה מעלה ומטה (triturate) בזהירות 10-15 פעמים עם קצה 1000 פיפטה μl עד אגרגטים התא לא יותר גלויים. חזור על טחינה דקה עם פיפטה 20-200 μl וקצה המקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה הפתרון הנייד לתוך צלחת HBSS המלא לקטינים ולפזר את התאים על ידי בעדינות לסובב את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הצלחת לקטינים עבור 60 דקות ב RT על משטח הרטט חופשי. כיסוי זה, כדי למנוע זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את HBSS בעדינות ולשטוף את הצלחת בזהירות 4 פעמים עם טרום חימם HBSS להסיר שברי תאים תאים לא מחובר / פנויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר השלב האחרון כביסה, להוסיף 500 פתרון depolarisation μl הצלחת ולתת לו דגירה עבור 1min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקל על הניתוק של תאים מחויב לקטינים על ידי רעדהקשה על צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הצלחת עם בינוני 2 טרום חימם מ&quot;ל התרבות להעביר צינור 15 בז מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת מספר התאים עם תא ספירת neubauer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט התא על coverslips מצופה או צלחות laminin במספר מתאים בהתאם ליישום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חילופי בינוני ביום 1 ולאחר מכן בכל היום השני על ידי החלפת זהיר של 50% של המדיום הישן. השתמש תמיד מראש התחמם, המוכן טרי בינוני תרבות חדשה. </li></ol> 6. נציג תוצאות: Motoneurons עובריים ניתן להשיג מעוברים העכבר E12 ל E14. 2-3% מהאוכלוסייה תא הכולל של עמוד השדרה המותני מורכב motoneurons וכן הנוירונים השורש הגבי ganglionic הם p75 NTR חיובי וכן, חשוב להיפטר של תאים אלה לפני תחילת ההליך לקטינים מבוססי preplating ( לסקירה ראה איור 1 ואיור 2). שנית, קרומי המוח כוללות חלוקת תאים בתוקף כי יש לשלול גם כשהם לא ניתן להסיר כראוי על ידי הליך לקטינים מבוסס preplating (איור 2, איור 3). במקרים גרועים יותר, תאים אלה יכולים לגדול יותר הצלחות תרבות. התמונות נציג איור 3B ו 3D גם רושם על צפיפות התא התחתון לאחר שטיפה נהלים בוצעו (ראה שלב 5.9 של הפרוטוקול). תרבויות של motoneurons עכבר עובריים נשמרות בדרך כלל לתקופה של עד חמישה או שבעה ימים. במהלך פרק זמן זה התאים להקים neurites שלהם עד אורך מרבי (איור 4). אורכי Neurite מאוד תלוי המצע על צלחות 8. המצע הטיפוסי הוא laminin אשר מצופה על פורנו-H מנות תרבות מכוסה. Motoneurons יכול גם לגדול על מצעים אחרים או פחות מוגדר, כמו מטריצות תאיים שנוצר על ידי תמוגה מים 8. במקרים של אורך לא טובים ציפוי, neurite ו חרוט אזור הצמיחה ירד מוות של תאים בדרך כלל עליות. תמיכה Trophic ממלא תפקיד מכריע להישרדות של motoneurons עכבר עובריים בתרבות. ההישרדות של תאים מצופה בתחילה על ירידה seven היום ל -10% עד 20% ללא תמיכה trophic 6. נגזר המוח גורם neurotrophic (BDNF) גורם neurotrophic ריסי (CNTF) הם הגורמים הנפוצים ביותר, אבל אחרים יכולים לקדם את ההישרדות גם [גורם מעכבות לוקמיה (LIF), Cardiotrophin-1 (CT-1), גורם בסיסי הצמיחה פיברובלסטים (bFGF ), אינסולין גורם גדילה דמוי 1 (IGF-1) 9]. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig1.jpg" /> 1. תרשים זרימה תכנית להכנת motoneurons עכבר עובריים. ציור סכמטי ממחיש את השלבים השונים של בידוד תרבות motoneurons עכבר עובריים. קיצורים: SC: חוט השדרה; HBSS: פתרון הנקס מלח מאוזנת; MN: motoneuron. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig2.jpg" /> איור 2 בידוד בחלק המותני של עמוד השדרה של העכבר E12.5:.. E12.5 העובר העכבר. עבור לשלב הבא, הראש הזנב יוסרו הגוף ממוקם ב-הגבי עמדה: העובר במצב הגבי-up. מלקחיים על ימין ועל שמאל של חוט השדרה מתקנים את הגוף עובר על עמדתה. אחד מלקחיים משמש לאחר מכן לחתוך את העור כדי לחתוך מתחת לחוט השדרה השני משמש כדי לתקן את העובר בעמדה שלו C:. בחוט השדרה מבודד מעובר E12.5 העכבר. החלקים של חוט השדרה (הצווארי, החזי, המותני) מצוינים. חוט השדרה מוקף בקרום המוח וחלק הגרעינים השורש הגבי עדיין מייחסים להם D:. חוט השדרה הוא לחתוך longitudinally בצד הגב כדי לפתוח אותו לכיוון התעלה המרכזית E:. קרומי המוח בצד הגחון כעת נלקח מן חוט השדרה שטוח. הערה: בעוד המריא, החלק המותני מסומן על ידי חתך קטן. פריץ: רק את החלק המותני של עמוד השדרה הוא נלקח לאחר מכן עבור הליכים נוספים. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig3.jpg" /> איור 3 קביעת ובידוד של איילט חיובי תאים בחוט השדרה המותני של E12.5 עוברי עכבר:.. איילט-1 / 2 נוגדן תוויות עמודות motoneuron בתוך חוט השדרה המותני עובריים (אדום, חץ) ותוויות Hoechst כל גרעינים בתוך הקטע. הצלב קטע של חוט השדרה lumar E12.5. E12.5 עוברי עכברים היו טבילה-קבוע paraformaldehyde 4% עבור 6 שעות, שטף 3 פעמים עם פוספט שנאגרו מליחים שטופלו סוכרוז על פי נהלים קבועים. Cryosections של 20 מיקרומטר נלקחו עם cryostat לבין חלקים טופלו עבור מכתים immunhistochemical פי הנהלים תקן 11. כלי חלקים שכותרתו לאחר מכן עבור לוקליזציה של גרעין התא עם Hoechst. שים לבהנוירונים הם השורש הגבי ganglionic Islet-1/2-positive וכן וכי הליך זה אינו כולל הכנה חלקי רקמה ההליך בידוד B:. איילט-1 / 2 שכותרתו (אדום, חץ) תאים ניתק את חוט השדרה המותני מ E12. 5 עוברים, שמאל - ימין לפני - אחרי preplating לקטינים מבוססות. התאים היו counterstained עם Hoechst לדמיין כל גרעיני תאים C:. כימות של תאים Islet-1/2-positive לפני ואחרי preplating לקטינים מבוססי D:. Nkx6.1 motoneurons שכותרתו מ E12.5 עוברים לאחר יום אחד בתרבות. התאים היו counterstained עם Hoechst כדי cisualieze כל הגרעינים. שים לב, 90% של כל התאים הם Nkx6.1 חיובית. קיצורים: SC: חוט השדרה; MN: motoneuron; DRG: גנגליון השורש הגבי. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig4.jpg" /> איור 4 אפיון E12.5 motoneurons העכבר A ו-B:.. מועשר מבודד E12.5 עכבר motoneurons השדרה המותני להביע p75 NTR ב 0 ימים במבחנה (0div) וביום 2 במבחנה (2div). תאים תוקנו עם paraformaldehyde 4% ו מוכתם לאחר מכן עבור NTR p75 על פי נהלים קבועים. תאים היו counterstained באמצעות Hoechst לדמיין את כל הגרעינים C:. Motoneurons מועשר לאחר 5 ימים במבחנה (5div) על פורנו-H ו laminin כמו מצעים תרבות בנוכחות מוכתם CNTF עבור טובולין β-III. שים לב כי התאים גדלו החוצה neurites ארוך ולהציג את המורפולוגיה motoneuron טיפוסי עם אחד יותר (קנים) תהליך אחד או יותר תהליכים קצרים (אקסונים דנדריטים). קיצורים: MN: motoneuron; div: ימים במבחנה. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="3"> לאחר ניתוק ללא preplating לקטינים מבוססי </td></tr><tr><td> המספר הכולל של תאים / SC </td><td> Trypan כחול חיובי תאים [%] </td><td> Islet-1/2- תאים חיובי [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 995.0 </td><td> 13,1 </td><td> 9,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 889.4 </td><td> 8,0 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1.180.0 </td><td> 11,0 </td><td> 10,8 </td></tr><tr><td> ממוצע ± סטיית תקן </td><td> 1.021.0 ± 147.1 </td><td> 10,7 ± 2,6 </td><td> 10,1 ± 0,7 </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td> עם preplating לקטינים מבוססי </td></tr><tr><td> מספר תאים אחרי preplating / SC </td><td> Trypan כחול חיובי תאים [%] </td><td> Islet-1/2- תאים חיובי [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 189.6 </td><td> 9,9 </td><td> 70,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 168.8 </td><td> 3,7 </td><td> 76,1 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 125.0 </td><td> 0,0 </td><td> 72,5 </td></tr><tr><td> ממוצע ± סטיית תקן </td><td> 161.1 ± 33.0 </td><td> 4,5 ± 5,0 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. סיכום תוצאות של נהלים בידוד נציג motoneurons עכבר עובריים משלב E12.5. מ 3 הליכים שונים בידוד במיוחד למטרה זו ניתנות כמספרים מוחלט או מספרים אחוז ± SD. קיצור: SC: חוט השדרה; SD: סטיית התקן. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> איילט-1 / 2 תאים חיוביים עם [%] p75 פנורמי </td><td> איילט-1 / 2 תאים חיובי עם לקטינים מבוססי פנורמי [%] </td></tr><tr><td> 92,0 ± 3,5 1 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> טבלה 2. תוצאות השוואה בין לקטינים מבוסס p75 מבוססי 1 מספרים תא פנורמי motoneuron. ניתנים כמספרים אחוז ± SD.

<ol>
	<li>Vallstedt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+repressor+activity+assign+redundant+and+specific+roles+to+Nkx6+genes+in+motor+neuron+and+interneuron+specification.">Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification.</a> Neuron. 31, 743-755 (2001).</li><li>Tsuchida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes.">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79, 957-970 (1994).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+related+motor+neuron+pool+and+muscle+sensory+afferent+subtypes+defined+by+coordinate+ETS+gene+expression.">Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression.</a> Cell. 95, 393-407 (1998).</li><li>Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+for+survival+of+lesioned+motoneurons.">Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons.</a> Acta Neurochir. , 21-35 (2004).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery.">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li><li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entering+the+Portal:+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope.">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li><li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo.">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li><li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis.">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration.">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li><li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+accelerates,+but+is+not+required+for,+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP.">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

היתרון של טכניקה זו מבוססת לקטינים preplating היא שזה זול יותר מאשר הליך NTR מבוסס p75 פנורמי, ו לקטינים יציב יותר נוגדנים. העשרה המופיעים באיור. 2 ו Tab. 1 מראה כי הנוהל מאפשר טיהור של מספר דומה של תאים כי רוב של תאים אלה מבטאים את הסמן motoneuron איילט-1 / 2. השלב הקריטי ביותר הוא בידוד את ההליך על חוט השדרה המותני. הסרת קרומי המוח ואת DRGs (איור 2) הוא חיוני לתהליך טיהור הבאים על ידי preplating לקטינים מבוססות. אם זה כבר הצליח כראוי, כמעט כל התאים מבטאים את NTR p75 (לתמונה נציג איור. 3a). הסיבה להבדל בין הבעת איילט-1 / 2 ו - p75 NTR הוא קרוב לוודאי כי motoneurons המותני דיפרנציאלי להביע רמות גבוהים או נמוכים יותר של איילט-1 / 2 10. במקרה של רמות נמוכות של ביטוי איילט 1 / 2 זה אולי ברח תשומת הלב שלנו מכתים את immuncytochemical והספירה הבאים כפי שהיינו מחמירים ביחס תאים חיובי לעומת שלילי (Tab. 1). בנוסף, טבלה 1 מראה בבירור כי תאים מבודדים לשרוד את ההליך במצב בריא, כמו שיש רק מעטים trypan כחול התאים החיוביים מצביעים על כך התאים ניזוקו באופן בלתי הפיך. הליך זה alterative גם מאפשר בידוד של motoneurons מעוברים יחיד ולכן המלטות של גנוטיפ מעורבת מעכברים עובריים. לסיכום, זו חלופה להליך פנורמי עם הנוגדן NTR p75 יש 6 דומה אם לא זהה יכולות מבחינת טווחי יישום אפשרי מספק שיטה זולה ויעילה טיהור חלופיות motoneurons עכבר עובריים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Poly-DL-ornithine hydrobromide </td><td> סיגמא </td><td> P8638 </td><td></td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> זכוכית coverslips </td><td> Thermo </td><td></td><td> Ø 10 או 14mm </td></tr><tr><td> לקטינים </td><td> סיגמא </td><td> L5142 </td><td></td></tr><tr><td> תרבית תאים תבשיל </td><td> Nunc </td><td> 150350 </td><td> Nunclon משטח הדלתא </td></tr><tr><td> סוס בסרום </td><td> Linaris </td><td> SHD3250ZK </td><td> כל אצווה יש להיבדק על MN תרבות </td></tr><tr><td> B27 מוסף </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-038 </td><td></td></tr><tr><td> CNTF </td><td> סיגמא </td><td> N0513 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Applichem </td><td> A1391 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-041 </td><td></td></tr><tr><td> מצבטים </td><td></td><td></td><td> נירוסטה, גודל 4 או 5 </td></tr><tr><td> טריפסין </td><td> וורטינגטון </td><td> LS003707 </td><td></td></tr><tr><td> מעכבי טריפסין </td><td> סיגמא </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-איילט-1 </td><td> DSHB </td><td> 39.4D5 </td><td> תרבית תאים supernatant </td></tr><tr><td> Anti-Nkx6.1 </td><td> DSHB </td><td> F55A10 </td><td> תרבית תאים supernatant </td></tr><tr><td> Anti-p75 NTR </td><td> Abcam </td><td> Ab8874 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 3. טבלת ריאגנטים ספציפיים וציוד.

lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons

Motoneurons השדרה לפתח לקראת שלבי postmitotic דרך התפתחות מערכת העצבים העוברית המוקדמת, ולאחר מכן לצמוח מתוך דנדריטים ואקסונים. תאים Neuroepithelial של הצינור העצבי המבטאים Nkx6.1 הם תאים מבשר ייחודי motoneurons השדרה 1. למרות motoneurons postmitotic לנוע לעבר עמדתו הסופית שלהם להתארגן עמודות לאורך בדרכי השדרה 2,3. יותר מ -90% מכלל אלה motoneurons הבדיל ואת מיקומו לבטא את גורמי השעתוק איילט 1 / 2. הם innervate את שרירי הגפיים, כמו גם אלה של הגוף ואת האיברים הפנימיים. בין היתר, motoneurons בדרך כלל להביע את הקולטנים זיקה גבוהה עבור גורם נגזר neurotrophic במוח (BDNF) ו Neurotrophin-3 (NT-3), tropomyosin הקשורות קינאז B ו-C (TrkB, TrkC). הם אינם מבטאים את קינאז tropomyosin הקשורות (TrkA) 4. לצד שני קולטנים זיקה גבוהה, motoneurons מבטאים את הזיקה נמוך neurotrophin p75 NTR הקולטן. NTR p75 ניתן לאגד את כל neurotrophins עם זיקה דומה אך נמוך יותר מאשר לכל neurotrophins את הקולטנים זיקה גבוהה היה לאגד את neurotrophins בוגרת. בתוך חוט השדרה העוברי, NTR p75 מבוטא באופן בלעדי על ידי motoneurons השדרה 5. זה נעשה שימוש כדי לפתח טכניקות motoneuron בידוד לטהר את התאים מן הרוב המכריע של התאים סביב 6. Motoneurons בידוד בעזרת נוגדנים ספציפיים (panning) נגד דומיינים תאיים של NTR p75 יש התברר להיות שיטה יקר כמו כמות הנוגדנים משמש עבור ניסוי בודד היא גבוהה בשל גודל של צלחת המשמש פנורמי. חלופה הרבה יותר חסכוני הוא השימוש לקטינים. לקטינים הוכח באופן ספציפי להיקשר NTR p75 גם 7. השיטה הבאה מתארת ​​טכניקה חלופית באמצעות נבט חיטה agglutinin הליך preplating במקום נוגדן p75 NTR. לקטינים מהווה חלופה זולה מאוד נוגדן p75 NTR ואת הציונים טיהור באמצעות לקטינים דומים לזה של נוגדן p75 NTR. Motoneurons מן חוט השדרה העובר יכול להיות מבודד על ידי שיטה זו, לשרוד ולצמוח מתוך neurites.

Watch this Scientific Journal Video about Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons at JoVE.com

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

דרך אלטרנטיבית של בידוד motoneurons עכבר עובריים מן חוט השדרה מתואר. השיטה לוקחת בחשבון את העובדה לקטינים יכולים לאגד את הזיקה נמוך עצב p75NTR גורם הגדילה לקולטן. זה preplating לקטינים מבוססי מאפשרת טיהור דומה לזה עם נוגדן ספציפי נגד p75NTR.

לקטינים מבוססי בידוד תרבות Motoneurons עכבר עובריים

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

lectin-based-isolation-and-culture-of-mouse-embryonic-motoneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.8K Views.  Ruhr-University Bochum. דרך אלטרנטיבית של בידוד motoneurons עכבר עובריים מן חוט השדרה מתואר. השיטה לוקחת בחשבון את העובדה לקטינים יכולים לאגד את הזיקה נמוך עצב p75NTR גורם הגדילה לקולטן. זה preplating לקטינים מבוססי מאפשרת טיהור דומה לזה עם נוגדן ספציפי נגד p75NTR.

Video: Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

בידוד והתרבות של תאים עובריים עצביים עכברוש: ​​פרוטוקול מהיר

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissection, תרבות וניתוח של<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; רקמת רשתית עוברית

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

בידוד ותרבות של האסטרוציטים עכבר קליפתיים

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

בידוד, תרבות והטווח ארוך תחזוקה של יסודיים mesencephalic דופאמין נוירונים ממוח עוברי מכרסם

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...