This study was supported by the Swiss National Foundation (n&#176; 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)

טיפול בבעלי חיים היה בהתאם להנחיות שאושרו על ידי הרשויות שוויצריים המקומיות (AMT für Landwirtschaft und Natur des Kantons ברן, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, NRS אישור. 52/11 ו35 / 14). הנחיות אלה הן בהסכם עם הדירקטיבה האירופית הקהילה 2010/63 / האיחוד האירופי. הערה: עבודה בזרימה למינרית עם מכשירים ופתרונות סטרילי לכל השלבים 1 - 5, כולל תת-שלבים. 1. הכנת MEAs הערה: MEAs מורכב ממצע זכוכית, אלקטרודות מתכת-מפוברק מיקרו ושכבת בידוד פולימר SU-8 (ראה גם Tscherter et al 3.). לצורך מחקר זה, MEAs זמין מסחרי נצטוו עם פריסת מערך אלקטרודות מותאמת אישית (איור 1 וארוחת בוקר). 68 אלקטרודות מסודרות ברשת מלבנית שמחולקת לשני אזורים על ידי חריץ רחב 300 מיקרומטר חופשי של אלקטרודות, חשמלמוביל iCal ובידוד. כל אלקטרודה היא 40 x 40 מיקרומטר בגודל והם במרווחים על ידי 200 מיקרומטר ממרכז למרכז. ארבע אלקטרודות קרקע גדולות מוצבות מסביב אתר ההקלטה. הם שונים מMEAs הסטנדרטי זמין מסחרי האחר בגודלם (21 מ&quot;מ x 21 מ&quot;מ) ואין להם תא הקלטה קבוע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לMEAs שטיפת חיטוי באתנול 100% (2x), 70% אתנול (1x) ומים מזוקקים (2x) לפחות 30 שניות כל אחד. בואו יבש. שים 10 - 12 MEAs בצלחת פטרי זכוכית נקייה (150 מ&quot;מ x 25 מ&quot;מ) ולסגור את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MEAs החיטוי במשך 20 דקות ב 120 מעלות צלזיוס. אחסן בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון הציפוי (ראה רשימת חומרים) לMEAs וaliquots החנות ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים את כל MEA בצלחת פטרי בודד סטרילי (35 מ&quot;מ x 10 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה מקוררת לשים 150 פתרון ציפוי μl מצונן על גבי אלקטרודות ולסגור את המכסה של צלחת פטרי. לאחר כ -10 דקות, לבדוק בועות אוויר על גביאלקטרודות ועדינות להסיר אותם עם מרית גומי מכוסה במידת צורך. בואו שאר עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאריות פתרון ציפוי לשאוב, לשטוף 1x עם המדיום מותאם לטרום לידתי ונוירונים עובריים ו2x עם מים מזוקקים, סטרילי. אם MEAs אינו משמש עד למחרת, לשמור אותם במים מזוקקים, סטרילי על 37 מעלות צלזיוס בחממת O / N. אחרת, בואו ישירות יבש ב RT. </li></ol> 2. מצרכים דרושים להכנת והצמיחה של תרבויות Organotypic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון לשטוף ללא סידן (ראה רשימת חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש פלזמה עוף בפתרון לשטוף (1: 1, ללחוץ בעדינות, למנוע היווצרות של בועות), צנטריפוגות ב -3,000 XG במשך כ 20 דקות ולמזוג את התוכן ברור לתוך צינור סטרילי. Aliquot 200 μl לcryotubes ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש תרומבין מפלסמת שור בהתאם (200 U / ml) וסטרילי-מסנן (פילטר 0.2 מיקרומטר הנקבובית). Aliquot 200 μl לcrytotubes ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך 30 תרבויות להכין של מדיום מזין 100 מיליליטר (ראה רשימת חומרים). </li></ol> Dissection רקמות 3. חוט השדרה הערה: תשואות נוהל, בהתאם למספר העוברים, פרוסות חוט השדרה לכ -25 - שיתוף תרבויות 35 ומוכן בתוך הזרימה למינרית בתנאים סטריליים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מנה קטלנית של (0.4 מיליליטר) pentobarbital לבעלי חי אם על ידי זריקה תוך שרירית. לאשר הרדמה עמוקה על ידי בדיקת רפלקס נסיגת דוושה. לספק עוברי עכברים E14 בניתוח קיסרי והקרבה על ידי עריפת ראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את גופותיהם של העוברים בצלחת פטרי מלאים בתמיסה סטרילית, מצוננת, לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע קיצוץ רוחבי מלא אחד עם אזמל מעל hindlimbs ועוד אחד מעל forelimbs ולהסיר את האיברים מן הגוף. בשלב הבא, לעשות חתך במישור הפרונטלי להפריד קרביים מהחתיכה מכילה שיתוף השדרה בחזרהRD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחיתוך, להעביר את החתיכות בחזרה מכילות את חוט השדרה אחד בכל פעם על דיסק התקנה ולחתוך בעובי של 225-250 מיקרומטר עם מסוק רקמות. לשים טיפה של פתרון לשטוף ברקמה הקצוצה ולהעביר פרוסות עם מרית ב -35 מ&quot;מ צלחות פטרי x 10 מ&quot;מ מלא פתרון סטרילי, צונן, לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל פרוסה בנפרד, לנתח חוט השדרה מנותר רקמה. השאר גרעיני שורש הגבי מצורפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו פרוסות לנוח במשך שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 4. הרכבה פרוסות רקמת חוט השדרה על MEAs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחמם בינוני מזין סטרילי בחממה (37 ° C, קל פתח מכסה לחמצון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MEA עמדה עם פינצטה סטרילי עם טיפים מכוסים גומי ב RT בצלחת פטרי תחת מיקרוסקופ סטריאו עם מערך אלקטרודות בפוקוס. מרכז אגל 6 μl של פלזמה עוף במערך אלקטרודות הנקי, ללא אבק, וסטרילי. בעזרת מרית קטנה, בזהירות להחליקשני חלקי חוט השדרה עם צדדים הגחון מול זה לתוך אגל הפלזמה. אל תיגעו באלקטרודות עם המרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 μl של תרומבין סביב אגל הפלזמה עוף. באמצעות קצה פיפטה תרומבין, לערבב בזהירות ולהפיץ את תערובת הפלזמה / תרומבין העוף סביב שתי פרוסות. שוב, אין לגעת במערך אלקטרודות השביר ישירות. רק לפני הקרישה, לשאוב פלזמה עודפת / תרומבין עוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את צלחת פטרי כדי לשמור על לחות גבוהה ואילו ההרכבה MEA / התרבות יושבת במשך כשעה 1 בתא humidified בתוך החממה על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף 10 μl של מדיום מזין לתא התרבות, מכסה את צלחת פטרי והחזרתי לתוך החממה במשך כ -30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל הרכבה MEA / תרבות עם טיפים לתוך צינור רולר סטרילי, מכוסה גומי, להוסיף 3 מיליליטר של מדיום מזין וסוגרת היטב את המכסה. מניחים את צינור רולר בתוף מסתובב בהרי 1 - סל&quot;ד 2 בחממה ב5% CO <sub&gt; 2 אווירה המכיל על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות מחצית בינונית התזונתי לאחר 7 ימים במבחנה (DIV) ולאחר מכן 1 - 2 פעמים בשבוע. </li></ol> 5. פצעים מכניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח ההרכבה MEA / התרבות עם טיפים סטריליים, מכוסה גומי מצינור רולר והמקום בצלחת פטרי ללא מדיום תזונתי תחת מיקרוסקופ סטריאו עם הרקמה בפוקוס. מבחינה ויזואלית לוודא ששתי פרוסות הם התמזגו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את MEA / התרבות יציבה הרכבה על ידי הצבת פינצטה עם עצות מכוסות גומי על MEA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח להב סכין מנתחים בחריץ של MEA הקרוב לפרוסות הרקמה. החזק את האזמל ולא אופקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את האזמל לטפל עד אבל בואו להב סכין המנתחים להישאר בחריץ של MEA באופן כזה ש&quot; הלחמניות &quot;להב מבסיס ועד לקצה ובכך חוצות את הרקמה המכסה את החריץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל חיבורי רקמות שייר חמורים עם קצה מחט 25 G אם necessארי. עובד רק באזור בתוך החריץ ולא לגעת בקצות המכרז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים MEA / ההרכבה התרבות בחזרה לתוך צינור רולר. לספק 3 מיליליטר של מדיום תזונתי טרי לתרבויות ולמקם אותם בחזרה לתוך תוף רולר בחממה. </li></ol> 6. אלקטרו הקלטות של פעילות ספונטנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחקור התחדשות תפקודית בין שתי פרוסות חוט השדרה לאחר המספר הנבחר של DIV, הר ההרכבה MEA / התרבות בתא הקלטה על מיקרוסקופ ולהחיל כ -500 פתרון תאי μl (ראה רשימת חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 10 דקות לפני ההקלטה הראשונה כדי לאפשר למערכת כדי לייצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2x השיא בסיסי פעילות ספונטנית כ -10 דקות מכל אלקטרודה גילוי-פעילות של MEA ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח תנאים תאיים יציבים, להחליף פתרון תאי לאחר כל פגישת הקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לdisinhibit הרשת, להחיל שיתוף פתרון תאיntaining סטריכנין (1 מיקרומטר) וgabazine (10 מיקרומטר). חכה לפחות 2 דקות לפני תחילת ההקלטה. </li></ol> ניתוח 7. נתונים הערה: זיהוי של פוטנציאל הפעולה נרשם extracellularly להשתמש לכל אלקטרודה גלאי המבוסס על סטיות תקן ומאבחן שלאחר מכן. הליך זה מתואר בפירוט ובאח Tscherter אל. 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את הפעילות העצבית המזוהה של כל אלקטרודה בעלילה סריקה על פי נהלים קבועים 3 (איור 1F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע ולהציג את פעילות הרשת הכוללת לכל פרוסה על ידי סיכום מספר האירועים בערוצים לפי בתוך חלון הזזה של 10 אלפיות שני, עברו על ידי צעדי msec 1 (איור 1G ותראה Tscherter et al. 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי בכל התפרצויות בודדות פרוסה (אשכולות של פעילות המופיעים בכמה אלקטרודות). לכן, נקבע סף שיא פעילות מינימאלי בסך פעילות הרשת המתאימה ולהגדיר כל התחלה פרצה וסופו של דבר פרץ. לדוגמא, סף מתאים הוא 25% של משרעת הפרץ הממוצעת והתחלה פרץ יכולה להיות מוגדרת על ידי להיות האירוע הראשון בחלון של אלפיות שני לפחות 5, סוף פרץ זמן על ידי כך את האירוע האחרון בחלון של זמן ב לפחות 25 אלפיות שני (ראה היידמן et al. 10). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת התחדשות פונקציונלית לחשב את אחוז הפרצים המסונכרנים בין שתי הפרוסות. כדי לעשות זאת, לחשב את זמן האחזור בין פרץ בפרוסה אחת והפרץ בפרוסה אחרת הבא. הערה: צמד פרץ מכונה &quot;מסונכרן&quot; כאשר ההשהיה קטנה יותר מאורך הפרץ הממוצע. במיוחד בשיתוף תרבויות עם הרבה פעילות, קיימת האפשרות ששני הצדדים במקרה ליזום פרץ בחלון ההשהיה שנבחר. עובדה זו צריכה להילקח בחשבון בכימות של אחוז סאיפרצי nchronized. לתיאור מפורט של החישובים לראות אל היידמן et. 10. </li></ol> 8. קיבוע של התרבויות ואימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל הצעדים שכוללים שטיפה או דגירה לוודא לשים תרבויות על שולחן הטיה כדי להבטיח דיפוזיה הנכונה של הפתרון דרך הרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר פגישת ההקלטה סיימה לקחת את ההרכבה MEA / התרבות מההתקנה, לשים אותו בצלחת פטרי (35 מ&quot;מ x 10 מ&quot;מ) ולהוסיף על 2 מיליליטר של פתרון תאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפריד את הפרוסות משכבות התאים המקיפות שנוצרו במהלך הזמן במבחנה, לקחת קצה פיפטה 10 μl ומקיף את הפרוסות. שים לב שלא לפגוע בתרבויות. ניתן להשמיט את הצעד הזה אבל ההטבעה מאוחר יותר היא קלה יותר כאשר הוא מבוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחט מזרק אל מתכתיים דקה (ראה חומרי רשימה) בשילוב עם מזרק 1 מיליליטר המלא בsoluti תאיעל לפוצץ בעדינות התרבות את MEA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקצה של פיפטה פסטר ולהתאים את הנורה הגומי בקצה הפרוס. השתמש בסוף חזרה להעברת התרבות למקבע (paraformaldehyde 4% עם מלח פוספט (PBS, 0.1 מ &#39;)). אל תשתמש בקצה הסטנדרטי של פיפטה פסטר להעברה כי הוא קטן מדי והתרבויות יהיו מקופלות וכנראה פגום. תקן עבור 1 - 2 שעות על 4 מעלות צלזיוס. יש לשטוף את MEA עם מים מזוקקים ולהסיר שאריות רקמה בקץ אצבעות, אבל לא לשרוט עם הציפורניים. MEAs חנות במים מזוקקים ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את התרבויות 3x ב PBS במשך לפחות 10 דקות כל אחד. אחסן בPBS על 4 מעלות צלזיוס או ישירות להתחיל עם ההליך מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התרבויות לפחות 90 דקות בפתרון חסימה (5% סרום עז, 1% אלבומין בסרום שור, חומר ניקוי של 0.3% בPBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הנוגדן הראשון המדולל בפתרון חסימת דגירה במשך 3 לילות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף בPBS בl30 דקות מזרח כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הנוגדן השני מדולל PBS לשעה 2 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף בPBS לפחות 30 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הפרוסות עם פיפטה פסטר עם קצה שהוסר על שקופית אובייקט. הסר PBS העודף ולהטביע עם ההרכבה בינונית. </li></ol>

<ol>
	<li>Avossa, D., Rosato&#8211;Siri, M., Mazzarol, F., Ballerini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+circuits+formation:+a+study+of+developmentally+regulated+markers+in+organotypic+cultures+of+embryonic+mouse+spinal+cord.">Spinal circuits formation: a study of developmentally regulated markers in organotypic cultures of embryonic mouse spinal cord.</a> Neuroscience. 122 (2), 391-405 (2003).</li><li>Cifra, A., Mazzone, G. L., Nani, F., Nistri, A., Mladinic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+developmental+profile+of+neurons+and+glia+in+motor+nuclei+of+the+brainstem+and+spinal+cord,+and+its+comparison+with+organotypic+slice+cultures.">Postnatal developmental profile of neurons and glia in motor nuclei of the brainstem and spinal cord, and its comparison with organotypic slice cultures.</a> Dev Neurobiol. 72 (8), 1140-1160 (2012).</li><li>Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+characterization+of+rhythmic+activity+in+rat+spinal+cord+slice+cultures.">Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).</li><li>Czarnecki, A., Magloire, V., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+oscillations+of+spiking+activity+in+organotypic+spinal+cord+slice+cultures.">Local oscillations of spiking activity in organotypic spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 27 (8), 2076-2088 (2008).</li><li>Kirkby, L. A., Sack, G. S., Firl, A., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+correlated+spontaneous+activity+in+the+assembly+of+neural+circuits.">A role for correlated spontaneous activity in the assembly of neural circuits.</a> Neuron. 80 (5), 1129-1144 (2013).</li><li>Ballerini, L., Galante, M., Grandolfo, M., Nistri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rhythmic+patterns+of+activity+by+ventral+interneurones+in+rat+organotypic+spinal+slice+culture.">Generation of rhythmic patterns of activity by ventral interneurones in rat organotypic spinal slice culture.</a> J. Physiol. (Lond.). 517 ((Pt 2)), 459-475 (1999).</li><li>Hanson, M. G., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+patterns+of+spontaneous+activity+are+required+for+correct+motor+axon+guidance+and+the+expression+of+specific+guidance+molecules).">Normal patterns of spontaneous activity are required for correct motor axon guidance and the expression of specific guidance molecules).</a> Neuron. 43 (5), 687-701 (2004).</li><li>Courtine, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+supraspinal+control+of+stepping+via+indirect+propriospinal+relay+connections+after+spinal+cord+injury.">Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury.</a> Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).</li><li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model.">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur. J. Neurosci. 27 (10), 2483-2492 (2008).</li><li>Heidemann, M., Streit, J., Tscherter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+intraspinal+connections+in+a+new+in+vitro+model.">Functional regeneration of intraspinal connections in a new in vitro model.</a> Neuroscience. 262, 40-52 (2014).</li><li>Nishimaru, H., Restrepo, C. E., Ryge, J., Yanagawa, Y., Kiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+motor+neurons+corelease+glutamate+and+acetylcholine+at+central+synapses.">Mammalian motor neurons corelease glutamate and acetylcholine at central synapses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (14), 5245-5249 (2005).</li><li>Tsuji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibition+induces+selective+motor+neuron+death+in+organotypic+slice+cultures.">Proteasome inhibition induces selective motor neuron death in organotypic slice cultures.</a> J. Neurosci. Res. 82 (4), 443-451 (2005).</li><li>Magloire, V., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+activity+and+positive+feedback+in+motor+circuits+in+organotypic+spinal+cord+slice+cultures.">Intrinsic activity and positive feedback in motor circuits in organotypic spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 30 (8), 1487-1497 (2009).</li><li>Bahrami, F., Janahmadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+supplements+affect+electrophysiological+properties+and+excitability+of+rat+hippocampal+pyramidal+neurons+in+primary+culture.">Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture.</a> Iran. Biomed J. 17 (2), 101-106 (2013).</li><li>Mentis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncholinergic+excitatory+actions+of+motoneurons+in+the+neonatal+mammalian+spinal+cord.">Noncholinergic excitatory actions of motoneurons in the neonatal mammalian spinal cord.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.. 20 (102), 7344-7349 (2005).</li><li>Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+are+rich+in+non&#8211;phosphorylated+neurofilaments:+Cross&#8211;+species+comparison+and+alterations+in+ALS.">Motor neurons are rich in non&#8211;phosphorylated neurofilaments: Cross&#8211; species comparison and alterations in ALS.</a> Brain Res. 861 (45&#8211;58), (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כמה גורמים בהליך שהוצג הם יסוד להישג של ניסויים מדויקים ושחזור. כל הצעדים במהלך תקופת ההכנה של MEAs, הפתרונות והייצור של התרבויות הפרוסה מבוצעים בתנאים סטריליים בזרימה למינרית. אנטיביוטיקה אינה חלה על המדיום מזין, כי הם יכולים להשפיע על הפעילות הספונטנית 14. במהלך ציפוי MEA, החלק החשוב ביותר הוא לוודא כי פתרון ג&#39;ל מטריקס נשאר קר בכל העת. הפשירי אותו במקרר ולשמור אותו על קרח לכל התהליך כדי להבטיח טמפרטורה מקסימלי קרובה ל 0 מעלות צלזיוס. במהלך תקופת ההכנה של הבידוד מהיר פרוסות וחתך, כמו גם תשומת הלב משלם לטמפרטורה נמוכה על ידי שימוש במאגרי נתיחה קרים קרח מגדיל את אחוז התרבויות הבריאים. יתר על כן, הקרישה / תרומבין הפלזמה היא אחד השלבים הקריטיים ביותר. ראשית, ודא שהפלזמה היא mixe כראויד עם תרומבין. שנית, להקדיש תשומת לב מיוחדת להסרת כמה שיותר שאריות ככל האפשר כדי להבטיח מצורף תקינה של פרוסות לMEAs. שלב זה הוא מאוד רגיש לזמן; אם מסגרת הזמן קצרה מדי, יותר מדי מתערובת הפלזמה / תרומבין מוסר. אם מסגרת הזמן ארוכה מדי, קרישה כבר קרה, מעלה את הסיכון להסרת פרוסות יחד עם הפלזמה / תרומבין השייר. אם נגעים מכאניים מתוכננים, חשוב להשתמש MEAs עם עיצוב מדויק. האזור שבו הנגע מיועד צריך להיות חופשי של אלקטרודות, חוטים ובידוד. אחרת, החשמל של MEA הולך להיות פגום ולכן, יכולות להתבצע ללא הקלטות יותר. עוד צעד מכריע נוגע לגודל הנגע. זה כבר הראה בעבר כי חיבור מחדש שתי פרוסות צעירות לאחר הנגע לוקח בערך יומיים 10. לכל הניסויים, כלל אצבע ששמש betwe החללen פרוסות לאחר נגע לא צריך להיות גדול יותר מאשר הרוחב של חריץ MEA (300 מיקרומטר). גודל נגע גדול יותר עלול לגרום למסגרת זמן ארוכה יותר לחיבור מחדש או, אם הנגע הוא גדול מדי, אין חיבור מחדש בכל. כדי להוסיף הערות, ניסויים לשעבר חשפו כי הצבה ראשונית של שתי פרוסות רחוקות מתוצאות 1 מ&quot;מ בשיעור חיבור נמוך מאוד. לפני תחילת ההקלטות, זמן הסתגלות של לפחות 10 דקות לRT, במקום 37 מעלות צלזיוס של החממה, ולפתרון תאי, במקום בינוני התזונה מומלצת. תצפית קרובה של דפוס הפעילות בדקות אלה ראשוניים מבטיחה כי הנתונים שנמדדו מייצגים את דפוס התפוצצות התרבות כראוי לאחר ההקלטה החלה. לצורך זיהוי של הפעילות, רכישת נתונים ועיבוד נוסף, חומרת תוצרת בית (הקלטה קאמרית, חיבורים למגברים והמגברים), התוכניות במעבדהVIEW, C ++ וIgorPro משמשים. הגדרות MEA מסחריות וחבילות תוכנה אחרות מתאימות, כמו גם לפעולות אלה. הנה, ראו האותות על ידי אלקטרודות מוגברות 1,001 פעמים, ולאחר מכן דיגיטציה בשיעור של 6 קילו-הרץ. המודל שהוצג יכול להיות כלי מועיל לבחון קשרי propriospinal כי in vivo, הם קשים ללמוד בלי ההפרעות של עולה ויורדים שטחי סיבים. שיתוף culturing של שתי פרוסות חוט השדרה יכול לעקוף באלגנטיות נושא זה. התרבויות לספק מייקרו-סביבה שיכולה להיות מבוקר היטב ובקלות מניפולציות. מצד השני, קלט supraspinal והחושי הוא כמובן חסר. בנוסף, בתהליך של הכנת התרבות מייצג מצב של נזק במערכת העצבים המרכזית. תאי גלייה כמו האסטרוציטים ומיקרוגלים ידועים להגיב לנגעים עם התפשטות מוגברת ולכן, הרקמה היא ארגון מחדש במידה מסוימת. הנוגע למצב שהוצגl היווצרות צלקת גליה לאחר ביצוע נגעים מכאניים לא נצפה. הסבר אחד יכול להיות שמנגנוני הסתגלות של האסטרוציטים כבר מופעלים בתהליך ההכנה וכי נגעים של התרבויות לא לגרום לתגובה נוספת. כמו כן, אין ראיות למעורבותם של המעכבים הקשורים המיאלין, למשל., Nogo-, בפוטנציאל ההתחדשות הנמוך של תרבויות lesioned בזקנה. עם זאת, זה הראה כי טיפול במעכבים phosphodiesterase 4 Rolipram, מתחיל מייד לאחר ביצוע נגעים בהתחדשות תפקודית 23 DIV עליות בין הפרוסות 10. תוצאות אלו מראות כי התאוששות תפקודית יכולה להיות מוגברת בתרבויות עתיקות. ניכר, כאשר סופר את מספר אקסונים חוצים את אתר הנגע, אין הבדל בין תרבויות lesioned בגיל צעיר ותרבויות lesioned בזקנה התגלה. ממצאים אלה מראים כי חוסר התחדשות axonal הוא לא הסיבה העיקרית ואו האובדן של התאוששות לאחר נגעים מאוחר בתרבות ולכן מדגיש את הצורך במודל המאפשר ניתוח פונקציונלי של התחדשות. היווצרות Synaptic ופלסטיות הסינפטית יכולים לשחק תפקיד מרכזי בתהליך ההתאוששות 10. מנגנונים אלה צברו הרבה תשומת לב בשנים האחרונות וזה בימינו מקובל שיש להם השפעה משמעותית על התוצאה לאחר פגיעה בחוט השדרה. לכן, מודל המספק תנאים יציבים לחקור תהליכים אלה בבידוד ובפירוט רב בהחלט יכול לעזור להשיג תובנה על התחדשות פונקציונלית בחוט השדרה.

תרבויות פרוסה Organotypic של מערכת העצבים המרכזית (CNS) נעשו שימוש נרחב ללמוד תופעות פיסיולוגיות ופתולוגיים שונות להגיע מפיתוח עצבי לניוון של מערכת עצבים. בהשוואה לתרביות תאים ניתק, פרוסות organotypic מציעות את היתרון של יותר מורכבות עם cytoarchitecture שלם ומעגלים הסינפטי מקומיים. במקביל, הרקמות ניתן לנתח באופן מבודד ללא הצורך לסבך את המורכבות של כל בהקשר vivo. יתר על כן, גישה קלה וחזרה לתאים של בחירה היא מוצדק, הסביבה תאית ניתן לשלוט באופן מדויק, ובדרך כלל, במבחנה דגמים פחות יקרים מאשר עמיתיהם בvivo. בשנים האחרונות, מחקרים שונים המוצגים דמיון בולט בין הפרופילים ההתפתחותי של תרבויות לטווח ארוכות לעומת בעלי החיים המקבילים החיים 1,2. הוכח כי מעגלים עצביים של מערכת העצבים המרכזית Regio השוניםNS להביע פעילות רשת ספונטנית במהלך פיתוח ושפרוסות organotypic חלקית לשמור תופעה זו 3 -7. הכנות חוט השדרה מבודדות כבר בשימוש במיוחד כדי לחקור דור קצב 6 והיווצרות של מעגלים עצביים 1. דרך כדי להקליט את הפעילות הספונטנית של פרוסות organotypic היא תרבותם על גבי מערכים רב-אלקטרודה (MEAs). מכשירים אלה מכילים אלקטרודות מרובות שיכול לפקח על הפוטנציאל תאי שנוצר על ידי פוטנציאל פעולה ממספר רב של תאים בו זמנית (הקלטה רבת-יחידה). הרזולוציה הגבוהה הזמנית של הקלטות MEA ניתן להשתמש כדי לשחזר את דינמיקת הפעילות המדויקת בתוך מעגל עצבי נתון. בנוסף, בניגוד לתיקון-מהדקת את הטכניקה הוא לא פולשנית, המאפשר מדידות ארוכת טווח ותוצאות בעובדה שתאי עצב אינם מושפעים בהתנהגות שלהם. Fאו מטרתו של מחקר זה, השילוב של שיתוף תרבויות חוט השדרה organotypic והקלטות מרובות אתרים שימש לחקור התחדשות פונקציונלית בתוך חוט השדרה. מאז חוליות גבוהות מבוגרות יש פוטנציאל להתאושש מנזק של חוט השדרה מוגבלת, אסטרטגיות שונות נחקרו לקידום התחדשות לאחר פגיעה בחוט השדרה. עד כה, בדרכי corticospinal יש בדרך כלל היו מערכת המודל של בחירה לחקירות כאלה. ניסויים אלה הם בדרך כלל זמן רב, יקר ודורשים קבוצות בעלי חיים גדולות בשל שונות גבוהות בתוך קבוצות יחידה. יתר על כן, ראיות מצביעות על כך שקשרי propriospinal (נוירונים שכלואים לגמרי בתוך חוט השדרה) יכולים לשחק תפקיד מרכזי בתהליך ההתאוששות הבא נגעים בחוט השדרה 8. סיבים אלו הם קשים ללמוד in vivo ללא ההתערבות של עולה ויורדים שטחי סיבים. Bonnici ו -9 Kapfhammer משמשים חוט השדרה אורךתרבויות פרוסה של עכברים לאחר לידה כגישה חלופית. לאחר ביצוע נגעים מכאניים הם ניתחו חצי כמותית התחדשות מורפולוגי של אקסונים בין מגזרי חוט השדרה. הם נצפו אקסונים אף פחות אך לא חוצים את אתר הנגע בתרבויות לחתוך בגיל בוגר. לעומת זאת, תרבויות שlesioned בשלב צעיר מוצגות כמות גבוהה של התחדשות axonal 5 - 7 ימים לאחר הפגיעה. עם זאת, הוכחה לקשרים פונקציונליים לא הוצגה. לכן, הפיתוח של נציג במודל חוץ גופית של סיבי propriospinal המאפשר החקירה של התחדשות פונקציונלית יכול להיות כלי רב ערך ללהרחיב את הידע שלנו על תהליכי התחדשות בחוט השדרה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Planar multielectrode array</td>
			<td>Qwane Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>custom-made according to the design of our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>80 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-070</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled, sterile water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve growth factor-7S [5ng/mL]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0513</td>
			<td>200 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>reconstituted in wash solution with 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix gel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356230</td>
			<td>Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium optimized for prenatal and embryonic neurons</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[mg/L]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2-6H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 anhydrous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular solution (pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[mM]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent: Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3%, harmful if swallowed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td align="right">5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2366</td>
			<td>Lyophilized, reconstitute with wash solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gabazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SR-95531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mecamylamine hydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2843</td>
			<td>toxic if swallowed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>harmful, 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI-31</td>
			<td>Covance</td>
			<td>SMI-31P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI-32</td>
			<td>Covance</td>
			<td>SMI-32R-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0532</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1123740001</td>
			<td>irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flat tube 10 (= roller tube)</td>
			<td>Techno Plastic Products AG</td>
			<td>91243</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating functional regeneration in organotypic spinal cord co-cultures grown on multi-electrode arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

כדי לחקור את הפוטנציאל להחלמה תפקודית של שיתוף התרבויות נגזרות מחוט השדרה של עוברי עכברים E14, נגעים בוצעו בחלון של 8 זמן לDIV 28. 2 עד 3 שבועות מאוחר יותר, הפעילות העצבית הספונטנית נרשמה עם MEAs (איור 1 C &amp; D). פוטנציאל הפעולה נרשם extracellularly זוהו מחובר לכל אלקטרודה בודדת (איור 1E). מנתונים אלה חלקות סריקה נוצרו (איור 1F), ואחריו חלקות פעילות רשת כדי להמחיש את הפעילות הכוללת בנפרד לכל צד (איור 1G). בכל פרוסה הפעילות הספונטנית בדרך כלל מאורגנת בצרורות. אם הפרוסות מחוברות תפקודי, התפרצויות אלה יכולים להפיץ מפרוסה אחת לשנייה. לפיכך, הסכום של התפרצויות מסונכרנות בין שתי הפרוסות היה מחושב למדוד התחדשות פונקציונלית כמותית. לתיאור מפורט של איך int השינויo החלקות השונות מתבצע וכיצד הנוסחא לחישוב אחוז הפעילות מסונכרנת נגזרה, אנא ראה et al היידמן. 10. בכל הניסויים, הפעילות נרשמה ראשונה בתנאים סטנדרטיים. בשלב שני, עיכוב סינפטי נחסם על ידי הוספת סטריכנין (1 מיקרומטר) וgabazine (10 מיקרומטר) לפתרון האמבטיה תאי. ביטול עכבות זה מוביל בדרך כלל לתבנית סדירה יותר פעילות עם פרצים ממושכים ומרווחים פרצו, המאפשרת הגדרה של התפרצויות ולכן קביעת סנכרון פרץ בין הפרוסות. תרבויות lesioned בגיל צעיר (7 - 9 DIV) מוצגות כמות גבוהה של פעילות מסונכרנת 2-3 שבועות לאחר נגע ואילו תרבויות lesioned בשלבים מאוחר יותר (&gt; DIV 19) הראה ירידה מובהקת ביכולת להתחדש (איור 2 - F). ממצאים אלה מצביעים על כך שיכולת ההתחדשותקשרים פונקציונליים בתרבויות פרוסה חוט השדרה יורדת מרמה גבוהה, המייצג את המדינה העוברית in vivo, לרמה נמוכה, המייצג את המדינה מפותחת נוסף בvivo, בתוך שלושה שבועות בתרבות. אילו סוגים של חיבורים למעשה מעורבים בסנכרון פרץ בין שתי פרוסות? מלבד קשרי propriospinal, הסיבים יכולים גם לנבוע מmotoneurons או נוירונים גנגליון השורש הגבי. זה כבר הראה בעבר כי תאי עצב גנגליון השורש הגבי אינם רלוונטיים לקישוריות הפונקציונלית בין חוט השדרה פרוס 10. עם זאת, המעורבות של motoneurons נותרה אפשרות. מאז motoneurons ידוע כדי ליצור קשרי כולינרגית לתאי עצב בחוט השדרה באמצעות קולטני ניקוטין 13, הפעילות של שיתוף תרבויות חוט השדרה נרשמה בשעת 8 DIV, תקופה שבה התרבויות מראות מאוד מסונכרנות פעילות 10, ואנטגוניסט ניקוטינית Mecamylamine (MEC, 100 מיקרומטר) התווסף לפתרון האמבטיה תאי. השתתפות של motoneurons בחיבור בין שתי הפרוסות תגרום לירידה באחוז של פעילות מסונכרנת. עם זאת, זה לא היה המקרה (MEC: 91.0 ± 4.5%, n = 7; שליטה: 93.6 ± 4.6%, n = 7, מבחן זוגות&gt; 0.05, Wilcoxon תאם עמ &#39;). תוצאות אלו מצביעות על כך שסינפסות כולינרגית אינה תורמת לחיבור הפונקציונלי בין פרוסות. עם זאת, מאז motoneurons יש גם הוכח כדי לשחרר גלוטמט בסינפסות בתוך 11 מערכת העצבים המרכזית, 15, ניסויים אלה לא לגמרי שוללים את מעורבותם. לזהות motoneurons stainings immunohistochemical נגד H neurofilament הלא פוספורילציה עם SMI-32 בוצעו. הם חשפו כמה גופי שכותרת גדולים תא אופייניים לmotoneurons, מפוזרים על פני פרוסות (איור 3 א). נוגדן SMI-32 דווח לתייג גופי התא של motoneuroNS 12 וממצא זה מחזיק נכון גם לתרבויות משמשות 13. כמו כן, stainings של גופים עצביים תא באופן כללי, למשל, נגד ב-III טובולין או NeuN כמו גם גופי תא גליה, למשל., האסטרוציטים עם נוגדני GFAP בקנה אחד עם דיווחים אחרים ולהתאים את התיאור המורפולוגי של סוגים אלה תא ( איור 3 ב &#39;- ד&#39;). עם זאת, התיוג של אקסונים עם נוגדן SMI-32 הוא נוגע (3E איור). בניגוד לציפיות, רשת עצומה של סיבים מופיעה בעת שימוש בנוגדן זה וזה נראה דומה לצביעת SMI-31 שתוויות H phosphorylated neurofilament (איור 3F). פרשנות אחת של תוצאה זו יכולה להיות שהרגולציה ההתפתחותי של זירחון neurofilament / dephosphorylation היא לא חזק כמו בתרבויות משמשות בהשוואה למצב בvivo. התרחשות מעורבת של neurofilaments פוספורילציה והלא פוספורילציה באותו האקסון יכולה Explעין ממצא זה. אפשרות נוספת היא שSMI-32 אקסונים שהכותרת נובעים מנוירונים הקרנה. צאנג ועמיתים 16 הראו למשל ש, נוירונים העמודה ועמודה תא intermediolateral של קלארק הם מוכתמים על ידי SMI-32 מלבד motoneurons. התפשטות neurite הבולטת של תאי עצב כזה יכול גם להסביר את השפע של SMI-32 סיבים חיוביים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig1.jpg" /> איור 1. תצוגה וניתוח של פעילות ספונטנית. () תרשים של MEA. אלקטרודות הפלטינה מכוסות מתוארות ב, חוטים השחורים השקופים באדום והחריץ באמצע MEA בצהוב. תקריב של מערך אלקטרודות ממוקם במרכז של MEA (B). התרשימים ניתנים באדיבות על ידי ד&quot;ר מ Heuschkel. תמונה בהירה שדה של cultur בן 8 DIV (C)דואר. פרוסות גדלו והתמזגו יחד הצדדים זה מול זה. בר הצהוב מייצג את חריץ electrode- וללא בידוד של MEA. בר ציר זמן בקנה מידה = 400 מיקרומטר (ד) של ניסויים. שתי פרוסות חוט השדרה של עוברי עכברים E14 ממוקמות ליד שני על MEAs. תוך כמה ימים, את הפרוסות לגדול ופתיל לאורך הצדדים זה מול זה. במסגרת של 8 זמן - DIV 28, מבוצעים נגעים מלאים דרך אתר ההיתוך. שבועות עד שלושה שבועות מאוחר יותר הפעילות הספונטנית נרשמת והתרבויות קבועות לstainings immunohistochemical. (ה) עקבות פעילות ספונטניות של כל אלקטרודה בודדת של תרבות בת 23 DIV. להדמיה ברורה יותר, רק כל זכר שני מודגם. עקבות כתומות מתארות פעילות שנרשמה מהפרוסה בצד ימין, עקבות כחולות מצד השמאל. רוב ההתפרצויות מסונכרנות בין שתיים. נקודות החצים כדי פרץ מתרחשות בפרוסה עזבה כי רק עמ &#39;artially מופץ לפרוסה תקין. הפעילות בפרוסה תקין זאת לא מגיעה לסף הנבחר של לפחות 25% מפעילות השיא מקסימאלי הממוצעת של הצד על פי ולכן, לא זוהתה כפרץ. הגדלה מהימין מתארת ​​זוג הפרץ המסונכרן האחרון. עלילה (F) סריקה של הפעילות מוצגת ב( E). (G) עלילת פעילות רשת עם פרצים מוגדרים (להלן ברים בסיס) של הפעילות מוצגת ב( E). מעובד מתוך היידמן et al. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig2.jpg" /> איור 2. מסונכרן לעומת פעילות לא מסונכרן. (A, B) חלקות סריקה של תרבויות lesioneד בגיל צעיר (ב7 - 9 DIV), מראה פעילות מסונכרנת בתנאים סטנדרטיים () ותחת ביטול עכבות (B). (C, D) מגרשי סריקה של תרבויות lesioned בזקנה (ב&gt; 19 DIV), מראים פעילות לא מסונכרנת בתנאים סטנדרטיים (C) ותחת ביטול עכבות (ד &#39;). (E, F) אחוז הממוצע של פעילות מסונכרנת זמם עבור כל יום נגע בודד שנרשם בתנאים סטנדרטיים (E) ותחת ביטול עכבות (F). הקלטות נלקחו 2 - 3 שבועות לאחר היום של נגע. מעובד מתוך היידמן et al. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig3.jpg" /> Figure 3. אימונוהיסטוכימיים אפיון. מכתים () של גופי תא motoneuronal עם SMI-32. תיוג טובולין β-III של גופי תא עצבי בוגרים והתהליכים שלהם (B). זיהוי (C) של האסטרוציטים עם GFAP. תיוג (D) של גוף תא עצבי בוגר עם NeuN. (ה) SMI-32 צביעה של ה neurofilament הלא פוספורילציה (F) neurofilament phosphorylated H זוהתה על ידי SMI-31. מעובד מתוך היידמן et al. 10. שימו לב שעם שניהם, SMI-31 וSMI-32, רשת גדולה של סיבים גלויים בתרבויות. ברים לספירה = 20 מיקרומטר, H &amp; F = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays at JoVE.com

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

כאן אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על פרוסות חוט השדרה בתרבית על מערכים רב-אלקטרודה ללמוד התחדשות פונקציונלית של קשרי propriospinal במבחנה.

חוקר התחדשות פונקציונלית בחוט השדרה שיתוף תרבויות Organotypic גדלו על מערכים רב-אלקטרודה

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

investigating-functional-regeneration-organotypic-spinal-cord-co

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.0K Views.  University of Bern.  כאן אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על פרוסות חוט השדרה בתרבית על מערכים רב-אלקטרודה ללמוד התחדשות פונקציונלית של קשרי propriospinal במבחנה. 

Video: Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multi-אלקטרודה מערך הקלטות של מפולות העצבית תרבויות Organotypic

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons. 
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.

We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.

ספירלת גנגליון Neuron explant תרבות Electrophysiology על מערכי אלקטרודה רבות

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

ההדרכה מבוססי פעילות על הליכון עם חוט השדרה נפגע Wistar חולדות

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...

Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and a lot of comparative data has been published in the literature. This includes a multitude of assessment methods to study functional recovery following nerve injury and repair. Besides evaluation of nerve regeneration by means of histology, electrophysiology, and other in vivo and in vitro assessment techniques, functional recovery is the most important criterion to determine the degree of neural regeneration. Automated gait analysis allows recording of a vast quantity of gait-related parameters such as Paw Print Area and Paw Swing Speed as well as measures of inter-limb coordination. Additionally, the method provides digital data of the rats&#8217; paws after neuronal damage and during nerve regeneration, adding to our understanding of how peripheral and central nervous injuries affect their locomotor behavior. Besides the predominantly used sciatic nerve injury model, other models of peripheral nerve injury such as the femoral nerve can be studied by means of this method. In addition to injuries of the peripheral nervous systems, lesions of the central nervous system, e.g., spinal cord contusion can be evaluated. Valid and reproducible data assessment is strongly dependent on meticulous adjustment of the hard- and software settings prior to data acquisition. Additionally, proper training of the experimental animals is of crucial importance. This work aims to illustrate the use of computerized automated gait analysis to assess functional recovery in different animal models of peripheral nerve injury as well as spinal cord contusion injury. It also emphasizes the method&#8217;s limitations, e.g., evaluation of nerve regeneration in rats with sciatic nerve neurotmesis due to limited functional recovery. Therefore, this protocol is thought to help researchers interested in peripheral and central nervous injuries to assess functional recovery in rodent models.

Automated gait analysis is a feasible tool to evaluate functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury and spinal cord contusion injury. While it requires only one setup to assess locomotor function in various experimental models, meticulous hard- and soft-ware adjustment and training of the animals is highly important.

ניתוח הליכה אוטומטי כדי להעריך התאוששות תפקודית מכרסמים עם פגיעה בעצב היקפי או חבלה בחוט השדרה

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and understanding the mechanisms of how a TBI alters brain function. The availability of multiple animal models of TBI is necessary to model the different aspects and severities of TBI seen in people. This manuscript describes the use of a midline closed head injury (CHI) to develop a mouse model of mild TBI. The model is considered mild because it does not produce structural brain lesions based on neuroimaging or gross neuronal loss. However, a single impact creates enough pathology that cognitive impairment is measurable at least 1 month after injury. A step-by-step protocol to induce a CHI in mice using a stereotaxically guided electromagnetic impactor is defined in the paper. The benefits of the mild midline CHI model include the reproducibility of the injury-induced changes with low mortality. The model has been temporally characterized up to 1 year after the injury for neuroimaging, neurochemical, neuropathological, and behavioral changes. The model is complementary to open skull models of controlled cortical impact using the same impactor device. Thus, labs can model both mild diffuse TBI and focal moderate-to-severe TBI with the same impactor.

The protocol describes mild traumatic brain injury in a mouse model. In particular, a step-by-step protocol to induce a mild midline closed head injury and the characterization of the animal model is fully explained.

מודל ראש סגור מבוקר אלקטרומגנטי של פגיעה מוחית טראומטית קלה בעכברים

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...

השתלה ארוכת טווח של תאי h-SC-NES בתרביות אורגנוטיפיות של חוט השדרה

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for Validating Cell Transplantation in Spinal Cord Injury

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches is based on stem cell transplantation to replace lost tissue and promote functional recovery. This approach should be further explored better in vitro and ex vivo for safety and efficacy before proceeding with more expensive and time-consuming animal testing. In this work, we show the establishment of a long-term platform based on mouse spinal cord (SC) organotypic slices transplanted with human neural stem cells to test cellular replacement therapies for SCIs.
Standard SC organotypic cultures are maintained for around 2 or 3 weeks in vitro. Here, we describe an optimized protocol for long-term maintenance (&#8805;30 days) for up to 90 days. The medium used for long-term culturing of SC slices was also optimized for transplanting neural stem cells into the organotypic model. Human SC-derived neuroepithelial stem (h-SC-NES) cells carrying a green fluorescent protein (GFP) reporter were transplanted into mouse SC slices. Thirty days after the transplant, cells still show GFP expression and a low apoptotic rate, suggesting that the optimized environment sustained their survival and integration inside the tissue. This protocol represents a robust reference for efficiently testing cell replacement therapies in the SC tissue. This platform will allow researchers to perform an ex vivo pre-screening of different cell transplantation therapies, helping them to choose the most appropriate strategy before proceeding with in vivo experiments.

מחבר זרקור: תרבית ארוכת טווח של פרוסות חוט השדרה לקידום טיפולים להתחדשות חוט השדרה

In this paper, we provide a reproducible method to generate and maintain long-term spinal cord organotypic slices transplanted with neural stem cells as an ex vivo model for testing cellular replacement therapies.

תרבית פרוסה אורגנוטיפית של חוט השדרה של עכבר לטווח ארוך כפלטפורמה לאימות השתלת תאים בפגיעה בחוט השדרה

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches ...