התמיכה של בנק עין אריות דלאוור העמק הייתה רבה ערך עבור עבודה זו. נוגדן חד שבטי עכבר העיקרי נגד ICP8 היה מתנה מסוג ד&quot;ר דוד Knipe (הספר לרפואת הארוורד). אנו מודים גם לד&quot;ר סטיבן ג&#39;נינגס (דרקסל מכללה לרפואה של אוניברסיטה) ופיטר ד&quot;ר Laibson (צוואות Eye Institute) לדיונים מועילים ואת המומחיות.

כל ריאגנטים והציוד נרכשו סטרילי או עוקרו לפני ההליך. מאמר זה מתאר את השלבים של הקמת מודל vivo לשעבר מתחיל בעין מראש enucleated. בניסויים שלנו, אנו משתמשים בעיניים שלמות טריות מ( 8-12 wks) ארנבות בקנים צעירות (PEL-freez ביולוגי, רוג&#39;רס, AR). בנוסף, אנו משתמשים בקרניות של אדם שנלקחו מבנק העין המקומי. אם ביצוע enucleation עצמך, לטפל כדי למנוע ניזק לקרנית או גובל במהלך ההליך. פרוטוקולי enucleation ארנב ניתן למצוא במקום אחר 2. חלק 1: כריתתן Corneoscleral <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרטב את הרצועה צרה של גזה עם PBS ולעטוף איתו את גלגל העין כדי להקל מחזיק אותו במהלך ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באזמל חד לעשות חתך משיק בלובן העין, במרחק של כ 0.5 סנטימטרים מימבוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים חדים להרחיב את החתך ולחלוטין בלו גכפתור orneoscleral. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכפתור corneoscleral מבודד, להקניט את הקשתית תוך החזקת חישוק scleral עם מלקחיים. למנוע ניזק האנדותל או הפעלת לחץ מוגזם על הקרנית. </li></ol> חלק 2: מבוא של קרנית לתרבות Organotypic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרניות Explanted מתורבתות במדיום החיוני המינימאלי (MEM) בתוספת חומצות האמין שאינם חיוניות (1X), L-גלוטמין (2 מ&quot;מ), פניצילין (200 U / ml) וסטרפטומיצין (200 מיקרוגרם / מ&quot;ל). סוכן נגד פטריות, כגון amphotericin, ניתן גם להוסיף במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון agarose 1% במדיום התרבות ולשמור אותו מוכן בשעת 55 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף היטב את הקרנית ב PBS המכיל פניצילין סטרילי (200 U / ml) וסטרפטומיצין (200 מיקרוגרם / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את צד אפיתל הקרני לתוך היטב של צלחת מקום סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף הבינוני agarose המכיל לקעירות האנדותל של הקרנית מספיק כדילמלא אותו לחלוטין. אפשר ~ 1 דקות לagarose כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הקרנית עם התמיכה בצד אפיתל ג&#39;ל פיגום לתוך צלחת תרבית רקמה 35 מ&quot;מ ולהוסיף התרבות הבינונית שיכסו את פני שטח האפיתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרנית עלולה להיות מתורבתת בדרך זו ליותר משבוע, עם שינויים בינוניים כל 48 שעות. </li></ol> חלק 3: זיהום בHSV-1 וטיפול בתרופות ניסיוניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של מדיום המכיל את הכמות הרצויה של וירוס לתוך צלחת תרבית רקמת 35 מ&quot;מ. אנחנו בדרך כלל להדביק עם 1x10 4 pfu של הזן KOS HSV-1 לקרנית. כייל המניות שלנו נקבעים על ידי ביצוע מבחנים פלאק על CV-1 monolayers. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הקרנית ביחד עם צד אפיתל agarose הפיגום לתוך מדיום וירוס המכיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הקרנית לרקמות תרבות חממה להדביק לשעה 1 עם נדנדה לסירוגין כל 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השעה 1, לשאוב וירוסי contaiנינג הבינוני ולשטוף 2-3 פעמים עם PBS להסיר כל חלקיקים נגיפיים שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הקרנית חזרה למקומה הקודם ולהוסיף מדיום התרבות טרי כדי לכסות את פני השטח האפיתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפולים ניסיוניים עשויים להיות נכתבו לפני או אחרי הזיהום, בהתאם לאופי של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיום תרבות משתנה כל שעה 48. </li></ol> חלק 4: אוסף דוגמאות <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני לניתוח assay פלאק. מערבב היטב הבינוני ולהשתמש בו באופן מיידי לבדיקת שלט או חנות ב-80 ° C לשימוש מאוחר יותר אם איסוף דגימות בנקודתי זמן שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דנ&quot;א, רנ&quot;א, חלבונים, או תאי האפיתל מקרנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את agarose הפיגום ולשטוף היטב עם קרנית PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו הטבעת של רקמת scleral מהקרנית על מנת להבטיח שחומר אפיתל קרני רק תיאסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Uלשיר אזמל, לגרד מתאי האפיתל של הקרנית למאגר המתאים, תלוי בסוג של חומר להיות מבודדים. לבידוד של DNA ו-RNA, אנו משתמשים בערכת הדם ורקמות DNeasy וקיט RNeasy מיני, בהתאמה (Qiagen, Hilden, גרמניה). לאוסף של lysates חלבון, אנו משתמשים במאגר Laemmli. לניתוח cytometry זרימה של תאי אפיתל קרניים, אנחנו מראש דגירת הקרניות בכמות קטנה של טריפסין כדי לשחרר את התאים, ואחר כך לשלוף אותם לטריפסין עם אזמל. מאחר שמגרד את האפיתל של הקרנית אינו מניב כמויות שווות של רקמה, חשוב לכלול פקדים מתאימים בעת ניתוח הדגימות. אנו משתמשים rRNA 18S כתעתיק התייחסות בqRT-PCRs, GAPDH כגן התייחסות בqPCRs, וnucleolin כבקרת טעינה לכתמים מערביים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות רקמה לאימונוהיסטוכימיה או immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את agarose הפיגום ולשטוף את התירסEA גם עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם למטרת הניסוי שלך, השתמש בקרנית לעשות בלוק פרפין רקמה או גוש רקמה קפוא, כפי שמוצג בסרטון. אנו עוקבים אחר נהלים סטנדרטיים בעת הכנת חלקי רקמת קרנית. </li></ol></li></ol> נציג תוצאות רוב השיטות הזמינות ללימוד תאים בתרבית רקמה ניתן להתאים בקלות לשימוש בקרניות נגועות בvivo לשעבר HSV-1. מוצג כאן הם תוצאות יציגות לכמה מהטכניקות הישימות ללימוד זיהום HSV-1 הנפוצות ביותר - qPCR (1D איור), qRT-PCR (האיור 1B), מערבי כתם (האיור 1F), assay פלאק (התרשים 1C), ו הרקמה immunofluorescence (האיור 1E). <img src="/files/ftp_upload/3631/3631fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1. הניתוח של קרניות נגועות HSV-1 לשעבר vאיבו. (א) ייצוג סכמטי של מודל vivo לשעבר של הזיהום חריף בקרנית אפיתל HSV-1. (BF) ניתוח של קרניות הנגועות בשיטה שתוארה במאמר זה וידאו. קרניות ארנב Explanted היו נגועות ב1x10 4 / קרנית pfu של הזן KOS HSV-1 ותרבית בנוכחות (Paa) או העדרה (מוק) של חומצת phosphonoacetic (400 מיקרוגרם / מ&quot;ל), מעכב ידוע של שכפול HSV. (ב) RNA סה&quot;כ נאסף בנקודתי הזמן המצוין, ושעתוק נגיפי הוערך על ידי qRT-PCR עם פריימרים לפולימרז HSV-1. Primers נגד 18S rRNA שמש כנקודת התייחסות. n = 3. ברי שגיאה מצביעים ± SEM. (ג&#39;) הבינוניים תרבות נאסף בגיל 48 HPI, וייצור חלקיקים מדבק הוערך על ידי assay פלאק על משטחי CV-1. (ד &#39;) ה-DNA סה&quot;כ נאספה בגיל 48 HPI, ושכפול הגנום נגיפי הוערך ב assay qPCR עם פריימרים לגנום HSV-1. יחסי הציבורimers נגד GAPDH שמשו כנקודת התייחסות. n = 3. ברי שגיאה מצביעים ± SEM. (E) מוק הקרניות שטופלו היו פלאש קפוא ב 48 HPI, נותח, ונותחו על ידי immunofluorescence העקיף לנוכחות של חלבון נגיפי מוקדם (ICP8) בתוך האפיתל הנגוע. גרעיני counterstained עם Hochst 33258. (F) lysates החלבון נאספו בגיל 48 HPI, והביטוי של חלבון נגיפי (ICP0) הוערך על ידי כתם מערבי. BCA assay שמש כדי להבטיח טעינה שווה של דגימות. HPI = שעתי זיהום הודעה.

<ol>
	<li>Kaye, S., Choudhary, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+keratitis.">Herpes simplex keratitis.</a> Prog. Retin. Eye Res. 25, 355-380 (2006).</li><li>Holmberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+of+exotic+pets.">Enucleation of exotic pets.</a> Journal of Exotic Pet Medicine. 16, 88-94 (2007).</li><li>Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+herpes+simplex+virus+keratitis:+the+pathogenesis+revisited.">Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited.</a> Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).</li><li>Foreman, D. M., Pancholi, S., Jarvis-Evans, J., McLeod, D., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+organ+culture+model+for+assessing+the+effects+of+growth+factors+on+corneal+re-epithelialization.">A simple organ culture model for assessing the effects of growth factors on corneal re-epithelialization.</a> Exp. Eye Res. 62, 555-564 (1996).</li><li>Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+organ+culture+model+for+assessing+epithelial+responses+to+surfactants.">Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants.</a> Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).</li><li>Klausner, E. A., Peer, D., Chapman, R. L., Multack, R. F., Andurkar, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+gene+therapy.">Corneal gene therapy.</a> J. Control Release. 124, 107-133 (2007).</li><li>Halford, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICP0+antagonizes+Stat+1-dependent+repression+of+herpes+simplex+virus:+implications+for+the+regulation+of+viral+latency.">ICP0 antagonizes Stat 1-dependent repression of herpes simplex virus: implications for the regulation of viral latency.</a> Virol. J. 3, 44 (2006).</li><li>Bhattacharjee, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+treatment+of+ocular+HSK+with+a+human+apolipoprotein+E+mimetic+peptide+in+a+mouse+eye+model.">Effective treatment of ocular HSK with a human apolipoprotein E mimetic peptide in a mouse eye model.</a> Invest Ophthalmol Vis. Sci. 49, 4263-4268 (2008).</li><li>Novitskaya, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Difficulties+imaging+herpes+simplex+keratitis+with+fluorescein+isothiocynate-labeled+anti-HSV-1+antibodies+in+an+ex+vivo+model.">Difficulties imaging herpes simplex keratitis with fluorescein isothiocynate-labeled anti-HSV-1 antibodies in an ex vivo model.</a> Cornea. 28, 421-425 (2009).</li><li>Sharma, A., Shimeld, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+immunofluorescence+to+diagnose+herpes+simplex+virus+keratitis+in+mice.">In vivo immunofluorescence to diagnose herpes simplex virus keratitis in mice.</a> Br. J. Ophthalmol. 81, 785-788 (1997).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

במאמר זה יתאר וידאו שיטה ללימוד הזיהום חריף בקרנית אפיתל HSV-1 במודל vivo לשעבר. המודל הזה הוא קרש קפיצה שימושית בין במבחנה במודלי vivo, משום שהיא מאפשרת לאימות פיזיולוגית מדויקת-תוצאות תרביות תאים, ובכך מגבילה את כמות הניסויים בבעלי חיים שהם צריכים לבצע. בנוסף, מ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריאגנטים / ספקים </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td></tr><tr><td> בינוני חיוני מינימאלי (MEM) </td><td> Mediatech </td><td> 10-010-CV </td></tr><tr><td> חומצות אמינו לא חיוניות (פתרון 100x) </td><td> Mediatech </td><td> 25-025-CI </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-CI </td></tr><tr><td> מלח נתרן G פניצילין </td><td> סיגמא </td><td> P3032 </td></tr><tr><td> מלח סולפט סטרפטומיצין </td><td> סיגמא </td><td> S9137 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td></tr><tr><td> נאגר מלוח פוספט (PBS) </td><td> הוכן במעבדה </td><td> N / </td></tr><tr><td> טריפסין EDTA (1x) &lt;/ Td&gt; <td> Mediatech </td><td> 25-053-CI </td></tr><tr><td> דם DNeasy &amp; קיט רקמות </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> ערכת המיני RNeasy </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Laemmli המאגר </td><td> הוכן במעבדה </td><td> N / </td></tr><tr><td> חיתוך טמפרטורה אופטימלי מתחם (אוקטובר) </td><td> רקמה-Tek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> עיני ארנב שלמות (צעיר) </td><td> PEL-freez </td><td> 41211-2 </td></tr><tr><td> קרניות עיני אדם ושלם </td><td> בנק עיניים מקומי </td><td> N / </td></tr><tr><td> צלחת פורצלן ובכן ספוט 12 </td><td> אספקת מעבדת אבוגדרו </td><td> 1877 </td></tr><tr><td> תבשיל תרבית רקמה 35 מ&quot;מ </td><td> בז </td><td> 353001 </td></tr><tr><td> 6 ובכןפלייט תא התרבות </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> Cryomold ביניים </td><td> רקמה-Tek </td><td> 4566 </td></tr></tbody></table>

ex vivo organotypic corneal model of acute epithelial herpes simplex virus type i infection

keratitis הרפס הוא האחת הפתולוגיות החמורות ביותר הקשורות לוירוסים מסוג 1 (HSV-1) הרפס סימפלקס. keratitis הרפס הוא כיום הגורם המוביל לשניהם נגזרו קרנית וזיהום הקשור בעיוורון בעולם המפותח. מצגת טיפוסית של הרפס קרטיטיס כוללת דלקת של האפיתל של הקרנית ולפעמים עמוקים יותר סטרומה ואנדותל בקרנית, מה שמוביל למחל קרנית קבועות כגון צלקות, דלילים, ואטימות 1. זיהום קרני HSV-1 הוא למד באופן מסורתי בשני סוגים של מודלי ניסויים. במבחנת מודל, שבי monolayers תרבית של תאי אפיתל קרניים נגוע בצלחת פטרי, מציע פשטות רמה גבוהה של replicability, ניסויים מהירים, ועלויות נמוכות יחסית. מצד השני, in vivo מודל, שבי חיות כמו ארנבים או עכברים מחוסנות באופן ישיר בקרנית, מציע פיסיולוגי מתוחכם ביותרמערכת, אבל יש עלויות גבוהות יותר, ניסויים ארוכים יותר, טיפול בבעלי חיים הכרחיים, ובמידה רבה יותר של השתנות. במאמר זה וידאו, אנו מספקים הדגמה מפורטת של דגם חדש vivo לשעבר של זיהום HSV-1 אפיתל קרני, המשלב את היתרונות של שניהם במבחנה במודלי vivo. מודל vivo לשעבר מנצל קרניות שלמות שמרו organotypically בתרבות ונגועה בHSV-1. השימוש במודל vivo לשעבר מאפשר למסקנות מאוד מבוססות מבחינה פיזיולוגית, ובכל זאת היא לא זולה ודורשת מחויבות זמן דומים לזה של מודל במבחנה.

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection at JoVE.com

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

במאמר זה יתאר וידאו השימוש חדש<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; מודל של הרפס סימפלקס סוג וירוס האקוטי אני זיהום האפיתל של קרנית.

דגם גופיים Organotypic הקרני של הרפס סימפלקס סוג אפיתל החריף וירוס אני זיהום

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1).  Herpes keratitis is currently the leading ...

ex-vivo-organotypic-corneal-model-acute-epithelial-herpes-simplex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

12.6K Views.  Drexel University College of Medicine. במאמר זה יתאר וידאו השימוש חדש Vivo לשעבר מודל של הרפס סימפלקס סוג וירוס האקוטי אני זיהום האפיתל של קרנית.

Video: Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

תרבות Organotypic בהיפוקמפוס Slice דגם לבחינת פגיעה עצבית

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

אקס culturing vivo של שלם, פיתוח המוח תסיסנית

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets containing specific growth factors that trigger blood vessel growth throughout the naturally avascular cornea, angiogenesis can be measured and quantified. In this assay the angiogenic response is generated over the course of several days, depending on the type and dose of growth factor used. The induction of neovascularization is commonly triggered by either basic fibroblast growth factor (bFGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). By combining these growth factors with sucralfate and hydron (poly-HEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate))) and casting the mixture into pellets, they can be surgically implanted in the mouse eye. These uniform pellets slowly-release the growth factors over five or six days (bFGF or VEGF respectively) enabling sufficient angiogenic response required for vessel area quantification using a slit lamp. This assay can be used for different applications, including the evaluation of angiogenic modulator drugs or treatments as well as comparison between different genetic backgrounds affecting angiogenesis. A skilled investigator after practicing this assay can implant a pellet in less than 5 min per eye.

The protocol describes the corneal micropocket assay as developed in mice.

קרנית Micropocket Assay: דגם של אנגיוגנזה בעין העכבר

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

בו זמנית<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; In vivo</emמערכת electroretinogram&gt;

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

תצפית של תנועת ריסי תאי אפיתל דמית העין מקלעת<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenetic Dissection של מעגלי פחד פרוסות המוח

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Optimized Management of Endovascular Treatment for Acute Ischemic Stroke

This manuscript describes a streamlined protocol for the management of patients with acute ischemic stroke, which aims at the minimization of time from hospital admission to reperfusion. Rapid restoration of cerebral blood flow is essential for the outcomes of patients with acute ischemic stroke. Endovascular treatment (EVT) has become the standard of care to accomplish this in patients with acute stroke due to large vessel occlusion (LVO). To achieve reperfusion of ischemic brain regions as fast as possible, all in-hospital time delays have to be carefully avoided. Therefore, management of patients with acute ischemic stroke was optimized with an interdisciplinary standard operating procedure (SOP). Stroke neurologists, diagnostic as well as interventional neuroradiologists, and anesthesiologists streamlined all necessary processes from patient admission and diagnosis to EVT of eligible patients. Target times for every step were established. Actually achieved times were prospectively recorded along with clinical data and imaging scores for all endovascularly treated stroke patients. These data were regularly analyzed and discussed in interdisciplinary team meetings. Potential issues were evaluated and all staff involved was trained to adhere to the SOP. This streamlined patient management approach and enhanced interdisciplinary collaboration reduced time from patient admission to reperfusion significantly and was accompanied by a beneficial effect on clinical outcomes.

The outcome of patients with acute ischemic stroke depends on swift restoration of cerebral blood flow. This protocol aims at optimizing the management of such patients by minimizing peri-procedural timings and rendering the time from hospital admission to reperfusion as short as possible.

ניהול מיטבי של טיפול Endovascular שבץ איסכמי אקוטי

This manuscript describes a streamlined protocol for the management of patients with acute ischemic stroke, which aims at the minimization of time from ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של זיהום וירוס כלבת ברקמת המוח נקי ממס

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. Establishment of the EcoHIV infected rat model for studies of drug abuse and neurocognitive disorders, would be beneficial in the study of neuroHIV and HIV-1 associated neurocognitive disorders (HAND). In the present study, we demonstrate the successful creation of a rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV). First, the lentiviral construct of EcoHIV was packaged in cultured 293 FT cells for 48 hours. Then, the conditional medium was concentrated and titered. Next, we performed bilateral stereotaxic injections of the EcoHIV-EGFP into F344/N rat brain tissue. One week after infection, EGFP fluorescence signals were detected in the infected brain tissue, indicating that EcoHIV successfully induces an active HIV infection in rats. In addition, immunostaining for the microglial cell marker, Iba1, was performed. The results indicated that microglia were the predominant cell type harboring EcoHIV. Furthermore, EcoHIV rats exhibited alterations in temporal processing, a potential underlying neurobehavioral mechanism of HAND as well as synaptic dysfunction eight weeks after infection. Collectively, the present study extends the EcoHIV model of HIV-1 infection to the rat offering a valuable biological system to study HIV-1 viral reservoirs in the brain as well as HAND and associated comorbidities such as drug abuse.

Here, we present a protocol to establish a new rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV), which is critical for enhancing our understanding of HIV-1 viral reservoirs in the brain and offering a system to study HIV-associated neurocognitive disorders and associated comorbidities (i.e., drug abuse).

מודל עכברוש של זיהום מוחי EcoHIV

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...