המחברים מבקשים להודות סאלי רוברטס (אוניברסיטת בירמינגהם, בירמינגהם בבריטניה) מתנה סוג של נוגדנים E1E4. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המכון הלאומי לסרטן (4R00CA137160-03).

1. לקראת תרבויות רפסודות Organotypic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרפסודה רשתות מתכת הרבה 1 להיות מטופלים עם חומצה גופרתית כרום כדי להסיר שאריות שעלולה להפריע לתהליך הבידול. רשתות מתכת לטבול בכוס כוס המכילה חומצה גופרתית למשך שעה אחת, ואז שטף ברציפות לילה עם מי ברז. לאחר לילה לשטוף, רשתות הרפסודה יש ​​לשטוף במשך 3-5 שעות במים מזוקקים פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לספק תמיכה רפסודות את, לכופף משלושה צדדים של הרפסודה על 0.5 ס&quot;מ במרחק שווה זה מזה. רשתות המתכת אמור להיות autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין את החיץ הכינון מחדש 10X ידי הוספת 2.2 גרם ו -4.8 NaHCO3 Hepes גרם. להמיס 100 מ&quot;ל של NaOH M 0.05. סנן לעקר ולאחסן ב 5 מ&quot;ל ב -20 aliquots ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן DMEM 10X בלי סודה לשתייה. סנן לעקר ולאחסן ב 5 מ&quot;ל ב -20 aliquots ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן גורם אפידרמיס העכבר גידול: ממיסים 100 מ&quot;ג של EGF ו 10 מ&quot;ג של BSA כל 10 מ&quot;ל deionized DDH 2 0. שלב EGF ו BSA ומוסיפים 80 מ&quot;ל של deionized DDH 2 0 עבור נפח כולל של 100 מ&quot;ל. סנן-לעקר, aliquot (5 מ&quot;ל) ו חנות -20 ° C. עבור ליטר אחד של המדיום E להוסיף 5 מ&quot;ל של EGF 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(ריכוז סופי 5 ng / ml). </li></ol> 2. הכנת ג&#39;ל קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת ג&#39;ל קולגן נדרש כל רפסודה. קולגן יש לשמור על הקרח כדי למנוע לחיזוק. כל ג&#39;ל קולגן דורשת 3 מ&quot;ל של תערובת קולגן המכיל: 2.4 מ&quot;ל של סוג עכברוש זנב קר קולגן אני (הריכוז הסופי 3-4 מ&quot;ג / מ&quot;ל), 0.3 חיץ מ&quot;ל הכינון מחדש 10X, 0.3 מ&quot;ל DMEM 10X and1-2 X 10 6 העכבר 3T3 J2 fibroblasts כתאים מזין. פתרונות ריכוז גבוה של קולגן זנב חולדה, לדלל חומצה אצטית 0.02 מ &#39;כדי להשיג את הריכוז בעבודה נכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר ג&#39;ל קולגן (רפסודות) תצטרך ולאחר מכן לחשב שילוב אב בסכום של קולגן, reconstit 10Xמאגר ution, DMEM 10X ו J2 fibroblasts הנדרש. כלול מספיק לערבב כל אב ג&#39;ל נוספות 3-4 בשל צמיגות של קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין ג&#39;ל קולגן, trypsinize את J2 fibroblasts ולנטרל עם המדיום. מערבבים את כל fibroblasts ומכניסים בקבוקון 50 מ&quot;ל חרוטית. לספור את התאים כדי לקבוע את מספר רפסודות שניתן לעשות. שוב, 1-2x10 6 fibroblasts נדרשים לכל ג&#39;ל קולגן ולכן לכל רפסודה. לסובב את התאים במהירות נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate בינוני של פיברובלסטים גלולה ו resuspend בסכום המתאים של חיץ הכינון מחדש 10X, 10X ו DMEM קולגן עבור מספר רפסודות מחושבים. הוסף קולגן האחרון למנוע את הג&#39;ל לחיזוק מהר מדי. לאחר קולגן נוסף, מערבבים במהירות, אך בעדינות כדי למנוע את כניסתה של בועות לתוך הג&#39;ל. ג &#39;ל צריך להיות צבע כתום אדמדם, מעיד על ה-pH הנכון. אם התערובת ג&#39;ל צהוב מדי, מוסיפים כמה טיפות של פילטר עיקור 1NNaOH ומערבבים בעדינות כדי לקבל את הצבע הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של קולגן: תערובת פיברובלסטים כדי הבארות של המנה תרבות 6 היטב. תערובת קולגן יש pipetted לאט בצד גם כדי למנוע כל יצירת בועות. מניחים את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס רקמת התרבות החממה ולאפשר לגבש במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 30 דקות, להוסיף 3 מ&quot;ל של מדיום E עם EGF לחלק העליון של ג&#39;ל קולגן הקרושה ולהחזיר את הצלחת אל האינקובטור. ג&#39;ל יש לשמור על 37 מעלות צלזיוס לפחות יום אחד, אבל להשתמש בתוך ארבעה ימים. תוצאות אופטימליות מתרחשים לאחר שני ימי דגירה. </li></ol> 3. קרטינוציטים הכנת התמיינות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרטינוציטים מעבר נמוכים יש גדל בכ 70% confluency. הרפסודה כל דורש 1-2x10 6 קרטינוציטים. Trypsinize את קרטינוציטים ולנטרל עם המדיום E עם EGF. לספור את התאים כדי לקבוע את מספר רפסודות שניתן לעשות. לסובב את התאים ב SPE נמוכהאד. Resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של מדיום E עם EGF עבור כל תרבות רפסודה מחושב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate בינוני מן ג&#39;ל קולגן על ידי צלחת הטיה 6 היטב. הוסף 2 מ&quot;ל של מדיום E טרי עם EGF כדי ג&#39;ל זה. עבור כל ג&#39;ל, בזהירות להוסיף 1 מ&quot;ל של קרטינוציטים resuspended ל 2 מ&quot;ל של מדיום E הנוכחי כבר טוב. בעדינות pipet את קרטינוציטים בתוספת 2 מ&quot;ל של התקשורת ולאחר מכן אפשר נפתח חכם נפילה לאחור על ג&#39;ל. רעד או נדנדה צלחת עלול לגרום חלוקה לא שווה של תאים בצד אחד של ג&#39;ל קולגן. מניחים את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים צריך להיות מבוגר כדי confluency, החלפת בינוני E מדי יום. התאים confluent כאשר השינויים בינוני עד שיום אחד צהוב לאחר השינוי במדיום. זה בדרך כלל לוקח 2-4 ימים. אם המדיום לא השתנה מיום ליום 4, המשך לשלב הבא. </li></ol> 4. מה שהופך את התרבויות הרפסודה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מלקחיים סטריליות להציב רשת סטרילית רפסודה מתכת, כפוף הצדדים את, לתוך צלחת 10 ס&quot;מ. Aspirate בינוני של ג&#39;ל קולגן. כדי לשחרר את הג&#39;ל מצידי גם, עבור סביב היקף של ג&#39;ל עם מרית סטרילי באמצעות תנועה למעלה ולמטה. כדי להסיר את ג&#39;ל קולגן, להטות את הצלחת מעט להרים את ידי הצבת מתחת מרית. הנח את ג&#39;ל קולגן על רשת מתכת מבלי ליצור בועות בין הרשת לבין ג&#39;ל. שני ג&#39;לים ניתן למקם על רשת כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להפוך את ממשק אוויר נוזלי, מוסיפים בינוני דואר ללא EGF לאט אל החלק התחתון של המנה כל כך את הרשת רפסודה נוגע לתקשורת אבל ג&#39;ל קולגן הוא לא. התקשורת לא צריכה לבוא דרך החורים ברשת. הוסף בינוני לאט, כדי למנוע יצירת בועות תחת הרשת, זה ימנע בידול אחיד. דגירה על רפסודות על 37 מעלות צלזיוס, לשנות את המדיום פעם ביומיים שמירה על ממשק אוויר נוזלי. למסוק את רפסודות לאחר 14 יום. </li></ol> 5. נציג תוצאות כאשר לאהוא פרוטוקול מבוצע כהלכה עם קרטינוציטים ראשוניים, הליך זה יביא האפיתל היטב מובחן שבו שכבות שונות של עור ניכרים. זה יושג באמצעות בדיקה היסטולוגית של מכתים קטעי תרבויות רפסודות עבור hematoxylin ו eosin (H &amp; E), כפי שמוצג באיור 1 ב. צביעת H &amp; E שימושית גם לבחון את המורפולוגיה של רפסודות ועל ההשפעה של וירוסים או תרכובות אנטי על היכולת של התאים לרבד ולהבחין. לדוגמה, רפסודות עשויות-HPV הנציח קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה (HFK-31) הם בעיקר בהשוואה עבה יותר כדי רפסודות עשויות רגילים קרטינוציטים העורלה האדם (HFK), המשקף שיעור מוגבר של שגשוג היכולת של חלבונים-HPV לשמור על התאים המבדילים פעיל במחזור התא (איור 1 ב) 10. התוצאה היא שימור של גרעיני ברחבי האפיתל, ואילו קרטינוציטים רגילים יציאה מחזור התא על בידול, והתוצאה היא התמוטטות שלגרעיני המעטפה. כדי לבחון מקרוב יותר בידול, אימונוהיסטוכימיה ניתן לבצע כדי לבדוק סמנים ספציפיים, כולל בידול cytokeratins, כמו גם involucrin ו filaggrin. Cytokeratins שונים באים לידי ביטוי בשלבים מסוימים של בידול 7. כפי שניתן לראות בתרשים 2, cytokeratin 10 (K10) לא באה לידי ביטוי ברובד הבסיסי, והוא נמצא רק בשכבות suprabasal המורכבות של תאים בהדרגה המבדילים. ב-HPV רפסודות חיוביים, ביטוי של K10 מתעכב בהשוואה לזו של קרטינוציטים רגילים, שוב המשקפות את השפעת חלבונים-HPV על בידול keratinocyte. אימונוהיסטוכימיה יכול לשמש גם כדי לבחון את פרופיל הביטוי של גנים נגיפיים. שמוצג באיור 3 הוא מכתים נציג לבחון את הביטוי של חלבון E1 HPV ^ E4, שהוא חלבון ז&quot;ל אשר הביטוי מוגבל בשכבות העליונות של האפיתל. כצפוי, לא מכתים הוא ציין בתרבויות רפסודות מן הומא רגילעכ קרטינוציטים העורלה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig1.jpg" /> איור 1. מתאר) של שיטה להכנת תרבויות רפסודות organotypic קרטינוציטים מן ראשוניים או שורות תאים אפיתל. ב) Hematoxylin ו eosin מכתים של תרבויות רפסודות organotypic שנוצר קרטינוציטים העורלה האדם ביציבות שמירה על HPV-31 (HFK-31) episomes, או רגילים קרטינוציטים העורלה האדם (HFK). שכבות אפיתל בודדים מזוהים, כמו גם התוספת קולגן. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig2.jpg" /> איור 2. Cytokeratin 10 (K10) הביטוי מוגבל שכבות suprabasal של האפיתל. אימונוהיסטוכימיה בוצעה על חתכים של תרבויות רפסודות organotypic שנוצר HFK-31 תאים, כמו גם HFKs רגיל באמצעות נוגדנים ל-K10. ה-DNA התאי היה counterstained עם DAPI. תמונות נתפסו באמצעות confמיקרוסקופ פלואורסצנטי ocal. החצים מצביעים על שכבת הבסיס של האפיתל. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig3.jpg" /> איור 3. E1 HPV ^ E4 חלבון המיוצר בשלב מאוחר היצרני של מחזור החיים של נגיפי. אימונוהיסטוכימיה בוצעה על חתכים של תרבויות רפסודות organotypic שנוצר HFK-31 תאים, כמו גם HFKs רגיל באמצעות נוגדנים E1E4. ה-DNA התאי היה counterstained עם DAPI. תמונות נתפסו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. החצים מצביעים על שכבת הבסיס של האפיתל.

<ol>
	<li>Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+raft+cultures+for+investigations+of+virus+growth,+pathogenesis+and+efficacy+of+antiviral+agents.">Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents.</a> Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).</li><li>Asselineau, D., Prunieras, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+'simplified'+skin:+control+of+fabrication.">Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication.</a> The British Journal of Dermatology. 111, 219-222 (1984).</li><li>Bodily, J., Alam, S., Chen, H., Meyers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Organotypic epithelial raft cultures and the study of the natural history of human papillomavirus. , (2006).</li><li>Cheng, S., Schmidt-Grimminger, D. C., Murant, T., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+up-regulation+of+the+human+papillomavirus+E7+gene+reactivates+cellular+DNA+replication+in+suprabasal+differentiated+keratinocytes.">Differentiation-dependent up-regulation of the human papillomavirus E7 gene reactivates cellular DNA replication in suprabasal differentiated keratinocytes.</a> Genes &#38; Development. 9, 2335-2349 (1995).</li><li>Dollard, S. C., Wilson, J. L., Demeter, L. M., Bonnez, W. R., Reichman, C., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+papillomavirus+and+modulation+of+the+infectious+program+in+epithelial+raft+cultures.+OFF.">Production of human papillomavirus and modulation of the infectious program in epithelial raft cultures. OFF.</a> Genes &#38; Development. 6, 1131-1142 (1992).</li><li>Frattini, M. G., Lim, H. B., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+synthesis+of+oncogenic+human+papillomaviruses+requires+episomal+genomes+for+differentiation-dependent+late+expression.">In vitro synthesis of oncogenic human papillomaviruses requires episomal genomes for differentiation-dependent late expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 3062-3067 (1996).</li><li>Kopan, R., Traska, G., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+as+important+regulators+of+terminal+differentiation:+examining+keratin+expression+in+individual+epidermal+cells+at+various+stages+of+keratinization.">Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization.</a> The Journal of Cell Biology. 105, 427-440 (1997).</li><li>Longworth, M. S., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+human+papillomaviruses+in+differentiating+epithelia.">Pathogenesis of human papillomaviruses in differentiating epithelia.</a> Microbiology and Molecular Biology Review. 68, 362-372 (2004).</li><li>Meyers, C., Frattini, M. G., Hudson, J. B., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+human+papillomavirus+from+a+continuous+cell+line+upon+epithelial+differentiation.">Biosynthesis of human papillomavirus from a continuous cell line upon epithelial differentiation.</a> Science. 257, 971-973 (1992).</li><li>Wilson, R., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Differentiation of HPV-Containing Cells Using Organotypic Raft Culture or Methylcellulose. , 119-119 (2006).</li><li>zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillomavirus+infections--a+major+cause+of+human+cancers.">Papillomavirus infections--a major cause of human cancers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1288, F55-F78 (1996).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

המתואר כאן שיטה, שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד בידול אפיתל בכלל, אבל יכול גם להיות מותאם בקלות ללמוד הפתוגנזה ויראלי, כמו גם את היעילות של הרפוי פוטנציאליים. וירוסים רבים למקד לתאי האפיתל או כאתר העיקרי של זיהום, כמו במקרה של HPV, או בשלב מסוים במחזור החיים ויראלי, כמו herpesvir...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> זנב עכברוש קולגן סוג 1 (4-5mg/ml) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> DMEM ללא NaHC0 3 </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-061 </td></tr><tr><td> NaHC0 3 </td><td> סיגמא </td><td> S5761 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Calbiochem </td><td> 391338 </td></tr><tr><td> נירוסטה רשתות מתכת </td><td> וויליאמס עוז ושות </td><td> CR-03063-040-100-S </td></tr><tr><td> E בינוני 11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> עוריות Growth Factor </td><td> BD Biosciences </td><td> 354010 </td></tr></tbody></table>

generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes

פיתוח organotypic תרבויות רפסודות אפיתל סיפקה לחוקרים עם ויעיל במערכת במבחנה כי משחזר בנאמנות בידול אפיתל. ישנם שימושים רבים עבור מערכת זו. למשל, היכולת לגדול תלת ממדי תרבויות רפסודות organotypic של קרטינוציטים הייתה ציון דרך חשוב במחקר של וירוס הפפילומה האנושי (HPV) 1. מחזור החיים של HPV הוא קשור קשר הדוק בידול של האפיתל הקשקשי 2. Organotypic תרבויות רפסודות אפיתל כפי שתואר כאן לשחזר את כל מחזור החיים וירוס הפפילומה, כולל ייצור וירוס 3,4,5. בנוסף, אלה תרבויות רפסודות התערוכה נגעים שומות דומות לאלה שנצפו על זיהום vivo עם HPV. לכן מערכת זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד סרטן תאים אפיתל, כמו גם את ההשפעה של תרופות על התמיינות תאים אפיתל בכלל. פותח במקור על ידי Asselineau ו Prunieras <sלמעלה&gt; 6 ו שונה על ידי Kopan et al. 7, התרבות organotypic אפיתל מערכת רפסודה התבגר לתוך המודל, בכלל התרבות קל יחסית, הכוללת את הצמיחה של תאים על קולגן המתחבר שמרו על הממשק אוויר נוזלי (איור 1 א). במשך 10-14 ימים, התאים לרבד להבדיל, ויצרו אפיתל בעובי מלא שמייצר בידול ספציפיים cytokeratins. רפסודות שנקטפו ניתן לבדוק בהיסטולוגיה, כמו גם על ידי שיטות מולקולריות ביוכימיים סטנדרטיים. במאמר זה, אנו מתארים שיטה לייצור של תרבויות הרפסודה של קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה. באותה טכניקה ניתן להשתמש שהוקמו שורות תאים אפיתל, והוא יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם רקמות אפיתל מ ביופסיות נורמלי או חולה 8. וירוסים רבים היעד או אפיתל עורית או הרירית כחלק ממעגל החיים שלהם replicative. בשנים האחרונות, את הכדאיות של שימוש כת רפסודה organotypicures כשיטה של לימוד וירוסים המארחות אינטראקציות סלולריים הוכח על herpesviruses כמה, כמו גם adenoviruses, parvoviruses ו poxviruses 9. תרבויות רפסודות Organotypic ולכן יכול להיות מותאם לבחון הפתוגנזה ויראלי, הם האמצעי היחיד לבחון סוכני נגיפים חדשים עבור אותם וירוסים שאינם לעיבוד של שורות תאים קבע.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes at JoVE.com

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

<em&gt; במבחנה</em&gt; שיטת לחקות<em&gt; In vivo</em&gt; בידול האפיתל המתואר. וירוסים רבים למקד לתאי האפיתל במסגרת מחזור החיים הנגיפי שלהם, שיטה זו מספקת אמצעי לבחינת וירוס: אינטראקציות מארחים יותר מקרוב דומה לזו המתרחשת<em&gt; In vivo</em&gt;. טכניקה זו ניתן להשתמש עם קרטינוציטים ראשוניים, שורות תאים שהוקמו, כמו גם נורמלי או חולה רקמות ביופסיה.

הדור של תרבויות רפסודות Organotypic של קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

generation-organotypic-raft-cultures-from-primary-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.0K Views.  University of North Carolina-Chapel Hill.  במבחנה שיטת לחקות In vivo בידול האפיתל המתואר. וירוסים רבים למקד לתאי האפיתל במסגרת מחזור החיים הנגיפי שלהם, שיטה זו מספקת אמצעי לבחינת וירוס: אינטראקציות מארחים יותר מקרוב דומה לזו המתרחשת In vivo. טכניקה זו ניתן להשתמש עם קרטינוציטים ראשוני?...

Video: Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

שיטה פשוטה ויעילה על מנת לבודד המקרופאגים מתרבויות ראשי מעורבות של תאים בכבד למבוגרים

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&amp;#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

בידוד ראשי microglia מ מעורבים בתרביות תאים גליה של רקמת מוח החולדה ילודים

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

דור של רקומביננטי אדם IgG נוגדנים חד שבטיים מתאים הממוינים B הונצחו

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell repertoire. In vitro models to study T lineage commitment and development have provided valuable insights into this process. However, these systems lack the complete three-dimensional thymic milieu necessary for T cell development and, therefore, are incomplete approximations of in vivo thymic selection. Some of the challenges related to modeling T cell development can be overcome by using in situ models that provide an intact thymic microenvironment that fully supports thymic selection of developing T cells. Thymic slice organotypic cultures complement existing in situ techniques. Thymic slices preserve the integrity of the thymic cortical and medullary regions and provide a platform to study development of overlaid thymocytes of a defined developmental stage or of endogenous T cells within a mature thymic microenvironment. Given the ability to generate ~20 slices per mouse, thymic slices present a unique advantage in terms of scalability for high throughput experiments. Further, the relative ease in generating thymic slices and potential to overlay different thymic subsets or other cell populations from diverse genetic backgrounds enhances the versatility of this method. Here we describe a protocol for the preparation of thymic slices, isolation and overlay of thymocytes, and dissociation of thymic slices for flow cytometric analysis. This system can also be adapted to study non-conventional T cell development as well as visualize thymocyte migration, thymocyte-stromal cell interactions, and TCR signals associated with thymic selection by two-photon microscopy.

We describe the preparation of thymic slices that, in combination with flow cytometry, can be used to model positive and negative selection of developing T cells. Thymic slices can also be adapted for the in situ analysis of thymocyte migration, localization, and signaling via immunofluorescence and two-photon microscopy.

הכנה ויישומים של תרבויות Organotypic הרתי Slice

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

אינדוקציה של תגובה דלקתית בתרבויות Hepatocyte הראשי מעכברים

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

RNA הקטן Transfection ב ראשוני האדם TH17 תאים על ידי הדור הבא Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...