המחקר המוצג כאן נתמכה על ידי צ&#39;ארלס ריבר. המחברים מודים ביותר של מודלים מהונדסים גנטית וקבוצת שירותים וצוות אמבריולוגיה לטיפול בבעלי חיים הזרקת ההורמון.

1. הזרע עכבר cryopreservation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל שורה להיות cryopreserved, להכין את הדברים הבאים לפני תחילת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 גם מנה 4-היטב עם l 240 של ערכת רו&quot;ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 cryopreservation זרע בקש כדלקמן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את קשיות 0.25 מ&quot;ל ל 1 מזרקים מ&quot;ל עם פקק הכותנה הקרובים המזרק. ב קש כל העומס 8 ס&quot;מ (כ 160 μl) של המדיום IVF, אז 1 ס&quot;מ של אוויר. תווית קשיות עם השם של הקו להישמר. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LN 2 צריך להיות 15 ס&quot;מ עמוק בתיבה קצף. סגור את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים 2 עכברים זכרים מכל קו להיות cryopreserved. העכברים צריכים להיות בין 10 ל 60 שבועות. הסר את שני epididymides הזנב יחד עם הזרע הזרע של כל עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את epididymides לתוך מוכן בעבר רו&quot;ח המכילים גם מנה של 4 באר (שלב 1.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצץ אורך 5-7 ב יותרת האשך כל ובעדינותלסחוט כל הזרע הזרע כדי לדחוף את הזרע החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער את התערובת רו&quot;ח יותרת האשך ביד בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות. זה יאפשר הזרע לשחות החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קש מוכן קודם לכן, לשאוב 5 מ&quot;מ (כ 10 μl) ההשעיה הזרע ולאחר מכן 1 ס&quot;מ של אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך זה עם עד לסך של 15 קשיות. טען ולאטום קשיות בתוך 10 דקות להישרדות הזרע הטוב ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים חותם בשני הצדדים של הקשית בזהירות. מניחים את קשיות במכל הקפאת זרע עם הטור הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את פיפטה 1 מ&quot;ל המסופק כחלק של ערכת אל מיכל להאריך את הידית. מניחים את מיכל ב LN 2 בתיבה קצף דרך החור במכסה. אפשר את המכל לצוף אנכית ב LN 2 במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המכל על LN2. הזרע הוא cryopreserved כעת ניתן להעביר את האחסון לטווח ארוך 2 LN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המכל לא אמור לשמש עבורלשורה הבאה עד שהוא מחומם לטמפרטורת החדר. </li></ol> 2. עכבר superovulation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל, להשתמש נקבות עכברים צעירים בעלי רקע זהה תורמי זרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים צריך להיות ~ 12 גרם (3-4 שבועות של גיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע זריקה intraperitoneal עם 5-10 IU של סוסה בהריון גונדוטרופין בסרום (PMSG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן 46-48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע זריקה intraperitoneal עם 5-10 IU של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביציות קציר 14-16 שעות לאחר ההזרקה hCG כמתואר להלן. </li></ol> 3. הזרע עכבר התאוששות IVF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני IVF, קש עבור כל צורך להפשיר, להכין את הבאים לאזן לפחות שעה אחת 37 ° C-CO 2 באינקובטור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדגירה צלחת הזרע: האחת צלחת פטרי 35 מ&quot;מ, עם ירידה של 90 μl של המדיום זרע הטיפול (STM) מכוסה בשמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיתוך המנה: עבור אוסף הביצית מתוך מקסימום של 10 sהנקבות uperovulated, אחד 35 מ&quot;מ צלחת פטרי עם 3 מ&quot;ל של מדיום IVF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפריה חוץ גופית היטב: עבור כל קבוצה של 5 נשים superovulated עבור הפריה חוץ גופית, אחד טוב של תבשיל 4 היטב עם 500 μl של המדיום IVF (אם אתה משתמש ב 10 נקבות superovulated, למשל, תצטרך 2 בארות...) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביסה צלחת: אחד צלחת פטרי 35 מ&quot;מ עם 3 מ&quot;ל של אשלגן סימפלקס בינוני אופטימיזציה (KSOM) לרחצה גם כל מנה 4-IVF היטב בשימוש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת תרבות: אחד 35 מ&quot;מ צלחת פטרי עם 50 טיפות של μl בינוני KSOM מכוסה שמן לתרבות עובר מבאר כל המנה IVF. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת קש מ LN 2 ומניחים אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים למשך 2-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקש מן האמבט במים ולנגב כדי להסיר את עודפי המים. בצע את החיתוך הראשון קרוב בעמודה האווירית הראשונה הקרוב התקע כותנה. חותכים את קש במדיום IVF יש עדיין יהיה טור אוויר גלוי לפני הטור הזרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז לחתוך את קצה הקשית בשנות הטור econd האוויר, להיות זהיר, כדי למנוע קיצוץ טור הזרע. גזור בזווית של 45 - זה יעשה את זה הרבה יותר קל לשאוב את הזרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את ההשעיה זרע מהקצה הדיסטלי של קש עם pipettor 200 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ההשעיה הזרע במרכז טיפת STM ו דגירה את המנה עבור 45-60 דקות 37 ° C 5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה הזרע, לנתח את oviducts של הנקבות superovulated לתוך צלחת החיתוך. שימוש במחט 30 גרם או מלקחיים לקרוע כל oviduct, שחרור הביצית קומולוס-מתחמי (COCs). הימנע שומן ודם במדיום IVF כמזוהם התקשורת עושה צעדים כביסה נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל oviducts היו קרועים, העברת COCs מתוך 5 נקבות לכל בארות IVF. מספר COCs המיוצר על ידי superovulation הוא זן מאוד תלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 10-15 μl של זרע מהפריפריה הירידה STM ולדשן one IVF גם כ 14-16 שעות שלאחר inj hCGection. חזור על הפריה עבור כל שימוש היטב. ריכוז הזרע הסופי יהיה כ 1 מיליון / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coculture זרע וביציות של 4-6 שעות 37 ° C 5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העוברים עם מינימום של 2 פעמים KSOM ותרבות טיפות KSOM לפיתוח ב 37 ° C 5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיעור IVF חושבה כמו שני עוברים שלב התא מתוך סה&quot;כ ביציות שימוש לאחר תרבות לילה. </li></ol> 4. נציג תוצאות זרע מ -5 זנים צ&#39;ארלס ריבר עכבר מולדת היה קפוא. יחסי להגנת הם מחושב על ידי חלוקת קפואים הערכה ערכים זרע ידי ערכים הערכה זרע טרי. יחסי הגנה על תנועתיות הזרע היו 60.2%, 81.3%, 78.6%, 66.5%, 61.0% עבור C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl ו BALB / cAnNCrl, בהתאמה. יחסי הגנה תנועתיות פרוגרסיבית מהיר היו 47.3%, 69.4%, 57.0%, 52.8%, 54.1% ב C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas<html> CRL, FVB / NCrl, DBA/2NCrl ו BALB / cAnNCrl, בהתאמה (איור 1). שיעורי הפריה חוץ גופית עם זרע קפוא מופשר היו 55.7%, 26.4%, 87.3%, 87.8% ו 26.2% ב C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl ו BALB / cAnNCrl, בהתאמה (איור 2) . במשך 1.5 שנים, 49 קווי GM עכבר היו בארכיון cryopreservation על ידי הזרע. קווים אלה היו לאחר מכן התאושש בהצלחה (כפי שהוגדר על ידי חיים גורי נולד) על ידי הפריה חוץ גופית ב 4 זנים נקביים (C57BL / 6, BALB / C, DBA / 1 ו 129Sv) (איור 3). <img alt="באיור 1." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig1.jpg" /> באיור 1. יחסי הגנה על תנועתיות הזרע ואת תנועתיות פרוגרסיבית מהיר ב עכברים <img alt="באיור 2." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig2.jpg" /> 2. איור הפריה חוץ גופית עם זרע קפוא, מופשר של עכברים 3713fig3.jpg &quot;/&gt; באיור 3. הפריה חוץ גופית עם זרע קפוא, מופשר ב עכברים GM

<ol>
	<li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol.">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li><li>Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+normal+young+following+transfer+of+mouse+embryos+obtained+by+in+vitro+fertilization+using+cryopreserved+spermatozoa.">Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa.</a> Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+of+cryopreserved+mouse+spermatozoa+affected+by+temperature+of+collection+and+rate+of+thawing.">Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing.</a> Cryobiology. 35, 46-52 (1997).</li><li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa:+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks,+mutagenesis+screens,+and+mouse+backcrosses.">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm.">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li><li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL/6+mice.">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li><li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization.">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li><li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates.">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li><li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing.">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li><li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity.">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li><li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserving,+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation.">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li></ol>

המחברים הם עובדים של צ&#39;ארלס ריבר, יצרנית ערכת הזה.

מאז שנת 1990, הקפאת הזרע בסיסי באמצעות פרוטוקול raffinose 18% ו 3% חלב רזה הוכח אמין זנים רבים של עכברים מספר רב של קווי העכבר כבר cryopreserved 1,2,3,4,5,6,7. הגורמים העיקריים לנזק לתאי זרע במהלך הקפאת תהליך ההפשרה קושרו עם היווצרות קרח 8,9 ו - 10 מינים חמצן תגובתי. תוספת של נוגדי רדיקלים חופשיים, כגון חומצות אמינו, וסוכני צמצום, כגון monothioglycerol, במדיום הקפאת נחקר והוכח באופן משמעותי להגדיל את שיעור הפריה חוץ גופית עם זרע קפוא מופשר של זנים טהורים כולל C57BL / 6 11,6. בפרוטוקול הנוכחי, פיתחנו חדש אני cryo • ערכת cryopreservation זרע העכבר על ידי אופטימיזציה של רו&quot;ח בסיסית עם נוגדי חמצון זמינים מסחרית חוסמי קרח על ידי שינוי הקפאת זרע הליך ההפריה החוץ גופית. הגנה יחסי של תנועתיות הזרע(&gt; 60%) ו תנועתיות פרוגרסיבית מהירה (&gt; 45%) נצפו במשך הזרע של חמישה זנים טהורים עכבר קפוא עם • אני cryo הערכה. 2 תאים העובר בשלב התפתחות שיעור עם זרע קפוא מופשר ב 5 זנים טהורים העכבר היה שיפור ניכר בהשוואה לזו עם בסיסי רו&quot;ח 11,6. במהלך השימוש בערכה, המשתמש יוצר ההשעיה זרע מרוכז על ידי הקפאת זרע של 2 גברים על כל שורה. על ידי הקפאה רק 15 קשיות התהליך הוא מהיר, קל תופסת פחות מקום אחסון לאחסון קצר או לטווח ארוך. רוב הפעמים, קווי העכבר ניתן לשחזר על ידי הפשרת רק 1 או 2 קשיות.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>
				Materials</th>
			<th>
				Supplier</th>
			<th>
				Catalogue number</th>
			<th>
				Comments</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPA</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Provided with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STM</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Provided with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF medium</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Provided with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 ml plastic straw</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Provided with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm freezing canister</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Provided with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cane and goblet</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Provided with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5310</td>
			<td>Should be embryo tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-106-D</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat sealer</td>
			<td>ABTEC</td>
			<td>TISH-200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well multidish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>73521-424</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Various</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&deg;C + 5% CO2 incubator</td>
			<td>Various</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2 storage system</td>
			<td>Various</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&deg;C water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>EMDChemicals</td>
			<td>367222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc syringe w/ 26G 3/8 needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD309625</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5602</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gauge &frac12; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6802</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5135, RS-5110, RS-5005</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse sperm cryopreservation and recovery using the i&middot;cryo kit

אלפי החדשה שונה גנטית (GM) זנים של עכברים שנוצרו מאז כניסתו של טכנולוגיות transgenesis ו בנוקאאוט. רבים מהם בעלי ערך קיים רק בבעלי חיים, בלי תוכנית גיבוי למקרה חירום. Cryopreservation של עוברים יכולים לספק גיבוי זה, אבל הוא יקר, יכול להיות תהליך ארוך, ובדרך כלל דורש מספר רב של בעלי חיים להצלחה. מאז גילויו כי זרע העכבר ניתן cryopreserved בהצלחה עם סוכן cryoprotective בסיסי (רו&quot;ח) המורכב raffinose 18% ו 3% חלב רזה, cryopreservation הזרע הפך הליך מקובל וחסכוני עבור אחסון, הפצה ההתאוששות של אלו זנים בעלי ערך . כאן אנו מדגימים פיתח אני • ערכת cryo עבור cryopreservation זרע העכבר. הזרע של חמישה זנים נפוץ בשימוש של עכברים טבועה הוקפאו באמצעות ערכת התאושש לאחר מכן. הגנה יחס גבוה של תנועתיות הזרע (&gt;60%) ו תנועתיות פרוגרסיבית מהירה (&gt; 45%) לעומת לשלוט (בסיסי רו&quot;ח) נראו עבור זרע קפוא עם ערכת זה 5 זנים עכבר מולדת. בשלב שני התא עובר התפתחות לאחר הפריה חוץ גופית עם הזרע התאוששה היה שיפור עקבי בכל 5 זנים העכבר נבדק. במשך 1.5 שנים, 49 קווי GM עכבר היו בארכיון ידי cryopreservation זרע עם • אני cryo ערכת והתאושש מאוחר יותר על ידי הפריה חוץ גופית.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÂ·Cryo Kit at JoVE.com

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

כאן אנו מדגימים את החדש שפותח אני • ערכת cryo עבור cryopreservation זרע העכבר. שני תאים בשלב התפתחות העובר עם זרע קפוא מופשר השתפר באופן עקבי 5 זנים עכבר עם השימוש בערכה זו. במשך 1.5 שנים, 49 קווי עכבר מהונדסים גנטית היו בארכיון ידי cryopreservation זרע עם • אני cryo ערכה ולאחר מכן התאושש בהצלחה על ידי הפריה חוץ גופית.

הזרע עכבר cryopreservation ושחזור באמצעות · אני cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

mouse-sperm-cryopreservation-and-recovery-using-the-icryo-kit

Research

JoVE Journal

Biology

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

39.4K Views.  Charles River. כאן אנו מדגימים את החדש שפותח אני • ערכת cryo עבור cryopreservation זרע העכבר. שני תאים בשלב התפתחות העובר עם זרע קפוא מופשר השתפר באופן עקבי 5 זנים עכבר עם השימוש בערכה זו. במשך 1.5 שנים, 49 קווי עכבר מהונדסים גנטית היו בארכיון ידי cryopreservation זרע עם • אני cryo ערכה ולאחר מכן התאוש...

Video: Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial culture is a quick way for clone verification or DNA isolation, followed by further enzymatic reactions (polymerase chain reaction and restriction enzyme digestion). Here, we video-recorded the general procedures of miniprep through the QIAGEN's QIAprep 8 Miniprep Kit, aiming to introducing this highly efficient technique to the general beginners for molecular biology techniques. The whole procedure is based on alkaline lysis of E. coli cells followed by adsorption of DNA onto silica in the presence of high salt. It consists of three steps: 1) preparation and clearing of a bacterial lysate, 2) adsorption of DNA onto the QIAprep membrane, 3) washing and elution of plasmid DNA. All steps are performed without the use of phenol, chloroform, CsCl, ethidium bromide, and without alcohol precipitation. It usually takes less than 2 hours to finish the entire procedure.

טיהור פלסמיד דנ&quot;א מ מושבות חיידקים באמצעות Miniprep Qiagen Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

אימונוהיסטוכימיה: מדורים פרפין שימוש ABC Vectastain קיט מ וקטור Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

הפקת RNA מן התאים Neuroprecursor שימוש Bio-Rad סך RNA Kit

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is determined. Conventional preparation of tissues for PCR-ready DNA often take several hours to days, depending on the tissue sample. The genotype of the sample may thus be delayed for several days, which is not an option for many different types of experiments. Here we demonstrate the complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. First, we demonstrate the fifteen-minute extraction of DNA from the tissue sample. Then, we demonstrate the real time read-out of the PCR amplification of the sample, which allows for the identification of a positive sample as it is being amplified. Together, the rapid extraction and real-time readout allow for a prompt identification of genotype of a variety different types of tissues through the reliable method of PCR.

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma&#039;s Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

The complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, is done in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

Genotyping מהיר של רקמות באמצעות עכבר חלץ-N-Amp רקמות סיגמא של ערכת ה-PCR

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

איסוף cryopreservation של ביציות ועוברים אוגר עכבר

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

Cryopreservation של עוברי עכברים ידי Vitrification אתילן גליקול מבוסס

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems for sperm analysis were developed to measure several parameters and one of the most commonly measured is the sperm motility.
Initially, this computer technology was designed for mammalian species, although it can also be used for fish sperm analysis. Fish have specific features that can affect sperm assessment such as a short motility time after activation and, in some cases, adaptation to lower temperatures. Thus, it is necessary to modify both software and hardware components to make motility analysis more efficient for fish sperm analysis. For mammalian sperm, the heating plate is used to maintain optimal temperatures of spermatozoa. However, for some fish species, it is advantageous to use a lower temperature to prolong the duration of motility, since the sperm remain active for less than 2 min. Therefore, cooling devices are necessary to refrigerate samples at constant temperature over the time of analysis, including on the optical microscope. This protocol describes the analysis of fish sperm motility using software for sperm analysis and new cooling devices to optimize the results.

The present protocol describes a procedure of fish sperm assessment using computer-assisted sperm analysis and cooling devices. The software gives a rapid, accurate and quantitative analysis of fish sperm quality based on spermatozoa motility, which can be a useful tool in aquaculture to improve reproduction success.

הערכת זרע דגים באמצעות תוכנה, התקני קירור

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

אוסף זרע באיכות דיפרנציאלית בעזרת צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is a newly isolated filamentous cyanobacterium. This paper describes how new filamentous cyanobacteria can be isolated from marine rockpools. It also describes how DNA can be extracted from filaments and how the genomes can be sequenced. Although transformation is established for many single-celled species, it is less frequently reported for filamentous cyanobacteria. A simplified method for the natural transformation of P. lacuna is described here. P. lacuna is the only member of the order Oscillatoriales for which natural transformation is established. This paper also shows how natural transformation is used to express superfolder green fluorescent protein (sfGFP). An endogenous cpcB promoter induced approximately 5 times stronger expression than cpc560, A2813, or psbA2 promoters from Synechocystis sp. PCC6803. Further, a method for the cryopreservation of P. lacuna and Synechocystis sp. CPP 6803 was established, and methods for assessing motility in a liquid medium and on agar and plastic surfaces are described.

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Phormidium lacuna is a filamentous cyanobacterium that was isolated from marine rockpools. This article describes the isolation of filaments from natural sources, DNA extraction, genome sequencing, natural transformation, expression of sfGFP, cryoconservation, and motility methods.

טרנספורמציה טבעית, ביטוי חלבונים ושימור קריו-קונסרבציה של הציאנובקטריום הנימה פורמידיום לקונה

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...