وقد دعمت البحوث المقدمة هنا من قبل نهر تشارلز. الكتاب في غاية الامتنان للنماذج المهندسة وراثيا ومجموعة خدمات وموظفي الأجنة لرعاية الحيوان وحقن الهرمون.

1. الماوس الحيوانات المنوية الحفظ بالتبريد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل كل سطر لتكون cryopreserved ، وإعداد ما يلي قبل البداية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 جيدا طبق 4 - جيدا مع 240 لتر من اتفاق السلام الشامل طقم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 قش الحفظ بالتبريد الحيوانات المنوية على النحو التالي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط القش 0.25 مل إلى المحاقن 1 مل مع المكونات القطن الأقرب إلى المحقنة. في كل من القش ، وتحميل 8 سم (حوالي 160 ميكرولتر) متوسطة التلقيح الاصطناعي ، ثم 1 سم من الهواء. تسمية القش مع اسم الخط ليتم الحفاظ عليها. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن يكون LN 2 بعمق 15 سم مربع في الرغوة. إغلاق الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 الموت ببطء الفئران الذكور من كل سطر لتكون cryopreserved. وينبغي أن يكون بين الفئران من العمر 10 و 60 أسبوعا. إزالة epididymides two الذيلية مع الأسهر من كل الماوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع epididymides في المحتوية على اتفاق السلام الشامل أعدت مسبقا جيدا طبق 4 - جيدا (الخطوة 1.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تخفيضات في كل طولية 5-7 البربخ وبلطفالضغط على كل الأسهر لدفع الحيوانات المنوية خارج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهز الخليط اتفاق السلام الشامل والبربخ باليد برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-5 دقائق. هذا سيسمح الحيوانات المنوية تسبح بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام قش أعدت سابقا ، نضح 5 ملم (حوالي 10 ميكرولتر) من نطفة ثم تعليق. 1 سم من الهواء </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذه العملية مع ما يصل الى ما مجموعه 15 القش. تحميل وختم القش في غضون 10 دقائق للبقاء على قيد الحياة أفضل الحيوانات المنوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حرارة ختم كلا الجانبين من القش بعناية. وضع القش في علبة تجميد الحيوانات المنوية مع العمود الأول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق ماصة 1 مل تقديمها كجزء من مجموعة إلى علبة لتوسيع التعامل معها. ضع العلبة في LN 2 في المربع الرغوة من خلال ثقب في الغطاء. السماح بتعويم العلبة عموديا في LN 2 لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غمر العلبة في LN2. هو الآن cryopreserved الحيوانات المنوية ، ويمكن نقلها إلى التخزين الطويل الأجل 2 LN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا ينبغي أن تستخدم لاسطوانةالسطر التالي حتى يتم تسخين تصل إلى درجة حرارة الغرفة. </li></ol> 2. الماوس فرط الإباضة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عموما ، استخدام فئران شابة من خلفية نفس المانحين الحيوانات المنوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن تكون الفئران ~ 12 ز (3-4 اسابيع من العمر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحقن داخل الصفاق إجراء مع وحدة دولية من الحوامل 50-10 جونادوتروبين مصل الفرس (PMSG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر 46-48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحقن داخل الصفاق إجراء مع وحدة دولية من 5-10 موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (HCG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد البويضات 14-16 ساعة بعد الحقن قوات حرس السواحل الهايتية على النحو المبين أدناه. </li></ol> 3. الماوس الانتعاش الحيوانات المنوية والتلقيح الاصطناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التلقيح الاصطناعي ، لكل من القش لإذابة ، وإعداد ما يلي ويوازن ما لا يقل عن ساعة واحدة في حاضنة 37 2 درجة مئوية أكسيد الكربون. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبق حضانة الحيوانات المنوية : واحدة طبق بيتري 35 ملم ، مع انخفاض متوسط ​​90 ميكرولتر من العلاج الحيوانات المنوية (STM) مغطاة بالنفط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الطبق : لجمع البويضة من الحد الأقصى من 10 ثانيةuperovulated الإناث ، واحدة طبق بيتري 35 ملم مع 3 مل من المتوسط ​​التلقيح الاصطناعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أطفال الأنابيب جيدا : للحصول على كل مجموعة من 5 اناث superovulated لأطفال الأنابيب ، واحدة جيدا طبق 4 جيدا مع 500 ميكرولتر من المتوسط ​​IVF (إذا كنت تستخدم 10 superovulated الإناث ، على سبيل المثال ، سوف تحتاج 2 الآبار...) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأطباق : واحدة طبق بيتري 35 ملم مع 3 مل من البوتاسيوم المتوسط ​​البسيط الأمثل (KSOM) لغسل كل بئر من صحن IVF 4 - جيدا المستخدمة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطبق الثقافة : واحد 35 مم طبق بيتري مع 50 قطرات من ميكرولتر المتوسطة KSOM مغطاة بالنفط للثقافة الجنين من كل بئر من صحن التلقيح الاصطناعي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القش من مكان LN 2 و 37 درجة في حمام ماء C لمدة 2-3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القش من الحمام المائي ومسح لإزالة المياه الزائدة. جعل خفض الأولى بالقرب من عمود الجوية الأولى أقرب المكونات القطن. قطع القش في المدى المتوسط ​​ستكون هناك عمليات التلقيح الصناعي لا يزال عمود الهواء عمود مرئية قبل الحيوانات المنوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم قص نهاية القش في لياليecond الجوية العمود ، والحرص على تجنب قطع العمود الحيوانات المنوية. قطع بزاوية 45 -- وهذا سيجعل من الاسهل بكثير ان نضح الحيوانات المنوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح تعليق الحيوانات المنوية من نهاية القاصية من القش مع pipettor 200 ميكروليتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع تعليق الحيوانات المنوية في وسط انخفاض STM واحتضان الطبق عن 45-60 دقيقة في 37 ° C 5 ٪ CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال حضانة الحيوانات المنوية ، وتشريح ناقلة البيضات من الإناث superovulated في طبق القطع. استخدام إبرة ز 30 أو ملقط لتمزيق كل قناة البيض ، والإفراج عن المجمعات قزع - البويضة (COCs). وتجنب الدهون في الدم على المدى المتوسط ​​والتلقيح الاصطناعي وسائل الاعلام القذرة يجعل لاتخاذ خطوات اضافية الغسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد أن تم تمزيق كل ناقلة البيضات ، ونقل COCs الإناث في الفترة من 5 إلى كل الآبار التلقيح الاصطناعي. عدد COCs التي تنتجها فرط الإباضة هي السلالة التي تعتمد جدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الحيوانات المنوية من 10-15 ميكروليتر من هامش الانخفاض STM وتخصيبها one IVF جيدا ما يقرب من 14-16 ساعة بعد ينج قوات حرس السواحل الهايتيةection. كرر التسميد لاستخدامها بشكل جيد لكل منهما. وسوف يكون النهائي تركيز الحيوانات المنوية حوالي 1 مليون / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحيوانات المنوية والبويضات Coculture لمدة 4-6 ساعات في 37 درجة مئوية 5 ٪ CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأجنة مع الحد الأدنى من 2 مرات والثقافة KSOM في قطرات KSOM للتنمية في 37 درجة مئوية 5 ٪ CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم احتساب معدل التلقيح الاصطناعي عن اثنين من الأجنة مرحلة الخلية من أصل مجموع البويضات بعد استخدام الثقافة بين عشية وضحاها. </li></ol> 4. ممثل النتائج تم تجميد الحيوانات المنوية من 5 سلالات نهر تشارلز الماوس الفطرية. وتحسب نسب الحماية من خلال تقسيم الحيوانات المنوية المجمدة تقييم القيم التي الطازجة القيم تقييم الحيوانات المنوية. وكانت نسب الحماية من الحيوانات المنوية على الحركة 60.2 ٪ ، 81.3 ٪ ، 78.6 ٪ ، 66.5 ٪ ، 61.0 ٪ للC57BL/6NCrl ، 129S2/SvPasCrl ، FVB / NCrl ، DBA/2NCrl وBALB / cAnNCrl ، على التوالي. وكانت نسب الحماية للحركية السريعة التقدمية 47.3 ٪ ، 69.4 ٪ ، 57.0 ٪ ، 52.8 ٪ ، 54.1 ٪ في C57BL/6NCrl ، 129S2/SvPas<html> CRL ، FVB / NCrl ، DBA/2NCrl وBALB / cAnNCrl على التوالي (الشكل 1). كانت معدلات التلقيح الاصطناعي مع مجمدة إذابة الحيوانات المنوية بنسبة 55.7 ٪ ، 26.4 ٪ ، 87.3 ٪ ، 87.8 ٪ و 26.2 ٪ في C57BL/6NCrl ، 129S2/SvPasCrl ، FVB / NCrl ، DBA/2NCrl وBALB / cAnNCrl على التوالي (الشكل رقم 2) . على مدى فترة 1.5 سنة ، وأرشفة 49 خطوط الماوس المعدلة وراثيا من قبل الحفظ بالتبريد الحيوانات المنوية. وكانت هذه الخطوط في وقت لاحق استعادت بنجاح (حسب تعريف الصغار يعيشون ولد) من خلال التلقيح الاصطناعي في 4 سلالات الإناث (C57BL / 6 ، BALB / ج ، ديسيبل / 1 و129Sv) (الشكل 3). <img alt="الشكل 1." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig1.jpg" /> الشكل 1. نسب حماية الحيوانات المنوية على الحركة التقدمية والحركة السريعة في الفئران <img alt="الشكل 2." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig2.jpg" /> الشكل 2. إخصاب في المختبر مع الحيوانات المنوية المجمدة ، المذوبة في الفئران 3713fig3.jpg &quot;/&gt; الشكل 3. التخصيب في المختبر مع مجمدة إذابة الحيوانات المنوية في الفئران المعدلة وراثيا

<ol>
	<li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol.">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li><li>Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+normal+young+following+transfer+of+mouse+embryos+obtained+by+in+vitro+fertilization+using+cryopreserved+spermatozoa.">Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa.</a> Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+of+cryopreserved+mouse+spermatozoa+affected+by+temperature+of+collection+and+rate+of+thawing.">Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing.</a> Cryobiology. 35, 46-52 (1997).</li><li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa:+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks,+mutagenesis+screens,+and+mouse+backcrosses.">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm.">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li><li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL/6+mice.">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li><li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization.">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li><li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates.">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li><li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing.">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li><li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity.">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li><li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserving,+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation.">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li></ol>

الكتاب والعاملين في نهر تشارلز ، صانع هذه المجموعة.

منذ عام 1990 ، وقد ثبت تجميد الحيوانات المنوية باستخدام بروتوكول الأساسية رافينوز 18 ٪ و 3 ٪ الحليب الخالي من الدسم يمكن الاعتماد عليها في كثير من سلالات الفئران وجرى cryopreserved عدد كبير من خطوط الماوس 1،2،3،4،5،6،7. وقد ارتبطت الأسباب الرئيسية لتلف خلايا الحيوانات المنوية خلال عملية التجميد والذوبان مع تشكيل الجليد 8،9 و 10 أنواع الاكسجين التفاعلية. وقد تم التحقيق مع مكملات الزبالين الجذور الحرة ، مثل الأحماض الأمينية ، والحد من العوامل ، مثل monothioglycerol ، في المتوسط ​​، وتجميد ثبت أن زيادة كبيرة في معدل التلقيح الاصطناعي مع مجمدة إذابة الحيوانات المنوية في السلالات الفطرية بما في ذلك 6 / C57BL 11،6. في هذا البروتوكول ، وضعنا انا جديد • كرو عدة لحفظ بالبرودة الحيوانات المنوية الماوس عن طريق الاستفادة المثلى من اتفاقية السلام الشامل الأساسية مع المواد المضادة للاكسدة المتاحة تجاريا وحاصرات الجليد وعن طريق تعديل تجميد الحيوانات المنوية وإجراء عمليات التلقيح الصناعي. نسب الحماية من الحيوانات المنوية على الحركةشوهد (&gt; 60 ٪) والحركة التقدمية السريع (&gt; 45 ٪) لسلالات الحيوانات المنوية من خمس الماوس الفطرية المجمدة مع عدة أنا كرو •. وتحسنت بشكل ملحوظ في مرحلة الجنين 2 - الخلية معدل التنمية مع الحيوانات المنوية المجمدة ، المذوبة في سلالات الفأر 5 الفطرية مقارنة ذلك مع اتفاق السلام الشامل الأساسية 11،6. في استخدام عدة ، المستخدم بإنشاء تعليق الحيوانات المنوية التي تتركز في الفترة من 2 تجميد الحيوانات المنوية للذكور كل سطر. إلا بنسبة لا تتجاوز 15 قش تجميد عملية سريعة وسهلة وتشغل أقل مساحة التخزين لتخزين قصيرة أو طويلة الأجل. في معظم الأحيان ، يمكن استرداد الماوس عن طريق خطوط ذوبان فقط 1 أو 2 القش.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>
				Materials</th>
			<th>
				Supplier</th>
			<th>
				Catalogue number</th>
			<th>
				Comments</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPA</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Provided with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STM</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Provided with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF medium</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Provided with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 ml plastic straw</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Provided with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm freezing canister</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Provided with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cane and goblet</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Provided with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5310</td>
			<td>Should be embryo tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-106-D</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat sealer</td>
			<td>ABTEC</td>
			<td>TISH-200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well multidish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>73521-424</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Various</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&deg;C + 5% CO2 incubator</td>
			<td>Various</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2 storage system</td>
			<td>Various</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&deg;C water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG</td>
			<td>Intervet</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>EMDChemicals</td>
			<td>367222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc syringe w/ 26G 3/8 needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD309625</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5602</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gauge &frac12; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6802</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5135, RS-5110, RS-5005</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse sperm cryopreservation and recovery using the i&middot;cryo kit

وقد أنشئت الآلاف من السلالات الجديدة وراثيا (GM) من الفئران المعدلة منذ ظهور تكنولوجيات transgenesis وخروج المغلوب. العديد من هذه الحيوانات موجودة فقط في قيمة الحيوانات الحية ، مع عدم وجود خطة احتياطية في حال الطوارئ. الحفظ بالتبريد الأجنة يمكن أن توفر هذه النسخة الاحتياطية ، ولكن مكلفة ، يمكن أن تكون الإجراءات المطولة ، ويتطلب عادة عددا كبيرا من الحيوانات من أجل النجاح. منذ اكتشاف الحيوانات المنوية التي يمكن الماوس cryopreserved بنجاح مع وكيل واق من البرد الأساسية (CPA) ، ويتألف من 18 رافينوز ٪ و 3 ٪ الحليب الخالي من الدسم ، وأصبح الحفظ بالتبريد الحيوانات المنوية إجراء مقبولا وفعالا من حيث التكلفة لحفظها وتوزيعها واسترداد قيمة هذه السلالات . هنا علينا أن نظهر أنا وضعت حديثا مجموعة كرو • لحفظ بالبرودة الحيوانات المنوية الماوس. وتم تجميد الحيوانات المنوية من خمس سلالات شائعة الاستخدام من الفئران الفطرية باستخدام هذه المجموعة ، ثم تعافى. نسب أعلى للحماية من الحيوانات المنوية على الحركة (&gt;واعتبرت 60 ٪) والحركة التقدمية السريع (&gt; 45 ٪) بالمقارنة مع التحكم (الأساسية CPA) عن الحيوانات المنوية المجمدة مع هذه المجموعة في 5 السلالات الفطرية الماوس. وتحسنت اثنين الجنين مرحلة التطوير الخلية بعد التلقيح الاصطناعي مع الحيوانات المنوية المستردة باستمرار في جميع سلالات الفأر 5 فحصها. على مدى فترة 1.5 سنة ، وأرشفة 49 خطوط الماوس المعدلة وراثيا من قبل الحفظ بالتبريد الحيوانات المنوية مع عدة أنا • كرو واستردادها في وقت لاحق من خلال التلقيح الاصطناعي.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÂ·Cryo Kit at JoVE.com

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

نحن هنا لشرح أنني وضعت حديثا مجموعة كرو • لحفظ بالبرودة الحيوانات المنوية الماوس. وتحسن اثنين من الخلية في مرحلة تطور الجنين مع مجمدة إذابة الحيوانات المنوية باستمرار في سلالات الفأر 5 مع استخدام هذا الطقم. على مدى فترة 1.5 سنة ، وأرشفة 49 خطوط الماوس المعدلة وراثيا عن طريق الحفظ بالتبريد الحيوانات المنوية مع عدة كرو • أنا في وقت لاحق واستعاد بنجاح من خلال التلقيح الاصطناعي.

الماوس حفظ بالبرودة والانتعاش الحيوانات المنوية باستخدام · لقد كرو كيت

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

mouse-sperm-cryopreservation-and-recovery-using-the-icryo-kit

Research

JoVE Journal

Biology

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

39.4K Views.  Charles River. نحن هنا لشرح أنني وضعت حديثا مجموعة كرو • لحفظ بالبرودة الحيوانات المنوية الماوس. وتحسن اثنين من الخلية في مرحلة تطور الجنين مع مجمدة إذابة الحيوانات المنوية باستمرار في سلالات الفأر 5 مع استخدام هذا الطقم. على مدى فترة 1.5 سنة ، وأرشفة 49 خطوط الماوس المعدلة وراثي...

Video: Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial culture is a quick way for clone verification or DNA isolation, followed by further enzymatic reactions (polymerase chain reaction and restriction enzyme digestion). Here, we video-recorded the general procedures of miniprep through the QIAGEN's QIAprep 8 Miniprep Kit, aiming to introducing this highly efficient technique to the general beginners for molecular biology techniques. The whole procedure is based on alkaline lysis of E. coli cells followed by adsorption of DNA onto silica in the presence of high salt. It consists of three steps: 1) preparation and clearing of a bacterial lysate, 2) adsorption of DNA onto the QIAprep membrane, 3) washing and elution of plasmid DNA. All steps are performed without the use of phenol, chloroform, CsCl, ethidium bromide, and without alcohol precipitation. It usually takes less than 2 hours to finish the entire procedure.

تنقية DNA البلازميد من المستعمرات البكتيرية باستخدام Miniprep Qiagen كيت

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

المناعية : أقسام البارافين باستخدام ABC Vectastain مجموعة من مختبرات المتجهات

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

استخراج خلايا الحمض النووي الريبي من Neuroprecursor باستخدام بيو راد إجمالي RNA كيت

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is determined. Conventional preparation of tissues for PCR-ready DNA often take several hours to days, depending on the tissue sample. The genotype of the sample may thus be delayed for several days, which is not an option for many different types of experiments. Here we demonstrate the complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. First, we demonstrate the fifteen-minute extraction of DNA from the tissue sample. Then, we demonstrate the real time read-out of the PCR amplification of the sample, which allows for the identification of a positive sample as it is being amplified. Together, the rapid extraction and real-time readout allow for a prompt identification of genotype of a variety different types of tissues through the reliable method of PCR.

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma&#039;s Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

The complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, is done in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

التنميط الجيني السريع من الأنسجة باستخدام الماوس سيغما استخراج - N - PCR الأمبير الأنسجة كيت

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

جمع والحفظ بالتبريد من البويضات والأجنة الهامستر ماوس

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

أسلوب الإنتاجية العالية للحصول على الحيوانات المنوية الحفظ بالتبريد واسماك الزرد في المختبر التسميد

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

الحفظ بالتبريد من أجنة الفئران التي التزجيج جلايكول الإثيلين ، واستنادا

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems for sperm analysis were developed to measure several parameters and one of the most commonly measured is the sperm motility.
Initially, this computer technology was designed for mammalian species, although it can also be used for fish sperm analysis. Fish have specific features that can affect sperm assessment such as a short motility time after activation and, in some cases, adaptation to lower temperatures. Thus, it is necessary to modify both software and hardware components to make motility analysis more efficient for fish sperm analysis. For mammalian sperm, the heating plate is used to maintain optimal temperatures of spermatozoa. However, for some fish species, it is advantageous to use a lower temperature to prolong the duration of motility, since the sperm remain active for less than 2 min. Therefore, cooling devices are necessary to refrigerate samples at constant temperature over the time of analysis, including on the optical microscope. This protocol describes the analysis of fish sperm motility using software for sperm analysis and new cooling devices to optimize the results.

The present protocol describes a procedure of fish sperm assessment using computer-assisted sperm analysis and cooling devices. The software gives a rapid, accurate and quantitative analysis of fish sperm quality based on spermatozoa motility, which can be a useful tool in aquaculture to improve reproduction success.

تقييم الحيوانات المنوية الأسماك باستخدام برامج وأجهزة التبريد

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

جمع الحيوانات المنوية فرق الجودة باستخدام الكثافة المتدرجة الطرد المركزي

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is a newly isolated filamentous cyanobacterium. This paper describes how new filamentous cyanobacteria can be isolated from marine rockpools. It also describes how DNA can be extracted from filaments and how the genomes can be sequenced. Although transformation is established for many single-celled species, it is less frequently reported for filamentous cyanobacteria. A simplified method for the natural transformation of P. lacuna is described here. P. lacuna is the only member of the order Oscillatoriales for which natural transformation is established. This paper also shows how natural transformation is used to express superfolder green fluorescent protein (sfGFP). An endogenous cpcB promoter induced approximately 5 times stronger expression than cpc560, A2813, or psbA2 promoters from Synechocystis sp. PCC6803. Further, a method for the cryopreservation of P. lacuna and Synechocystis sp. CPP 6803 was established, and methods for assessing motility in a liquid medium and on agar and plastic surfaces are described.

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Phormidium lacuna is a filamentous cyanobacterium that was isolated from marine rockpools. This article describes the isolation of filaments from natural sources, DNA extraction, genome sequencing, natural transformation, expression of sfGFP, cryoconservation, and motility methods.

التحول الطبيعي، والتعبير عن البروتين، والحفظ بالتبريد لثغرة البكتيريا الزرقاء الخيطية الفيرميديوم

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...