הפרויקט קיבל מימון העמותה עלות (מזון, חקלאות עלות פעולה FA1205: AQUAGAMETE, ותוכנית של האיחוד האירופי אופק 2020 מחקר וחדשנות תחת מארי Sklodowska-קירי פרויקט מראה מרהיב (GA לא 642893). ברצוננו להודות הצוות המדעי של PROiSER, במיוחד כדי שהתלמיד אלברטו וונדרל ברנאבאו עבור השתתפותו הפעילה הקלטת וידאו של פרויקט זה.

נהלים בנושאים בעלי חיים מעורבים היו אישור (2015/VSC אפונה 00064) הכיוון הכללי של תוצרת חקלאית, משק-החי-València דה Politècnica Universitat.
1. איסוף זרע צלופחים בוגרים האירופית בשבי
הערה: שימוש צלופח האירופית זכרים בהשתתפות טנקים עם מי ים ומערכת recirculation בטמפרטורה קבועה (20 ° C). פנקו עם הורמונים באמצעות הזרקה בקרום הבטן שבועי (גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG); לכל g IU 1.5 ממשקל הגוף דגים). ואקלום דגים בהדרגה החל מ 3 ימים במים מתוקים ואחריו החלפה עם מי ים (1/3 של המים הכולל במיכל) כל יומיים עד שהגיע עם מליחות של 37.0 גר'/mL.
<ol><li>עזים ומתנגד הצלופח 24 שעות לאחר הזרקת הורמון להשיג דגימות עם איכות זרע טובה יותר.<ol>
<li>להכין מראש ההרדמה: להוסיף 300 מ"ג בנזוקאין 100 מ של 70% אתנול. מערבבים היטב ולאחסן ב 4 º C.</li>
		<li>לדלל בנזוקאין בדלי גמיש עם 5 L של מערכת מים בכדי לקבל ריכוז סופי של 60 מ ג/ליטר, מערבבים היטב.</li>
		<li>להעביר את הדגים הדלי עם מערכת מים, בנזוקאין. המתן מספר דקות עד דגים תירגע.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנקות את אזור איברי המין עם מים ויבשה עם נייר סופג כדי למנוע זיהום של זרע דגימות צואה, שתן או מי-ים.</li>
	<li>החל לחץ עדין באזור הבטן, לאסוף דגימות זרע לתוך צינורות פלסטיק 15 מ"ל באמצעות את משאבת ואקום. נפח הזרע עד 6-7 מ ל, בהתאם הזכר.</li>
	<li>שמור דגימות זרע ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה עד תנועתיות ניתוח מבוצע.</li>
</ol>2. להכניס למקרר ו לדלל את דגימות זרע
<ol><li>הכינו מראש את הפתרון כיום. הערה: דגימות זרע צריך להיות מדולל בפתרון ה-extender ספציפיים עבור כל המינים.<ol>
<li>היכונו המדיום-מפעיל דגימות זרע צלופח (P1 בינוני). הוסף 0.42 גר' נתרן ביקרבונט, 1.828 גר' נתרן כלורי, g 0.127 של מגנזיום כלוריד, 0.56 g של אשלגן כלורי, 0.037 גרם סידן כלורי עד 250 מ"ל של מים מזוקקים. מערבבים היטב כדי להמיס. חנות ב 4 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הגדר את מגניבים הבלוק ב 4 ° C כדי לשמר דגימות בטמפרטורה קבועה. המתן עד מייצבת הטמפרטורה.</li>
	<li>לדלל את דגימות זרע באמצעות כיום פתרון ייחודיים לכל מין. הערה: יחס דילול מינים ספציפיים, חייב להיות מוגדר כדי לתקנן את הפרוטוקול. ראשית, מעריכים ריכוז הזרע מבוסס על ריכוז שהושג בניתוח קדם תנועתיות באמצעות תוכנה, כמוסבר בשלבים 3 ו- 4. ניתוח זה, זה גם אפשרי לבחור את דגימות זרע הטוב ביותר בהתאם לאחוז תנועתיות. אחרי זה, החוקר יכול להתחיל לאסוף נתונים עבור הניסוי באמצעות את הדוגמאות הטובות ביותר עם הריכוז הנכון.<ol>
<li>לדלל צלופח דגימות זרע במדיום P1 עם יחס של 1:50. כדי להכין µL 500 של זרע צלופח מדולל, להוסיף 50 µL של דגימת זרע טרי ו- 450 µL של P1. מערבבים היטב.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. להעריך את הפרמטרים תנועתיות הזרע
<ol><li>
הגדרת המודול תנועתיות של התוכנה
	<ol>
<li>הבמה קריר ב 4 ° C והמתן עד זה מייצבת.</li>
		<li>פתח את התוכנה ובחר מודול תנועתיות. צור שם משתמש וסיסמה במידת הצורך.</li>
		<li>בחר מאפיינים ובחר את הפרמטרים הרצויים לפני תחילת הניתוח זרע.<ol>
<li>לחץ על מינים | דגים.</li>
			<li>בחר את מסגרות לכל השני ואת מספר תמונות, בהתאם לתנאי הטכני הטוב ביותר עבור כל המינים. הגדר שתי האפשרויות-120 תמונות לשניה.</li>
			<li>לבחור הניגוד השלילי. . זה הכרחי עבור שחזור מדויק של ה-מסלולים spermatozoa16.</li>
			<li>בחר את המקביל קאמרית סופר ואת קנה המידה של מצלמת הוידאו. כיילו את מצלמת הווידאו עבור העדשה ההגדלה המשמשים את הניסוי. הגדר SpermTrack10 כמו חדר הספירה ואת סולם X 10. הערה: באופן כללי, לעומק של 10 מיקרומטר בתא הספירה ו עדשה ההגדלה של 10 X הם התנאים המומלצת מכיוון שהם מספקים יותר התמקדות של כל spermatozoa וללכוד את המספר הגבוה ביותר של תאים. עם זאת, מומלץ לבצע מחקר קודם של התנאים האופטימלי לניתוח תנועתיות של כל מין.</li>
			<li>להתאים את אזור החלקיקים ואת קישוריות עבור כל המינים. הגדר אזור המינימלי חלקיקים ב 2 מיקרומטר2 וקישוריות ל- 7 מיקרומטר. הערה: דגים, הערך המינימלי של חלקיקים באזור נעה בין 2-5 מיקרומטר וקישוריות תלוי את מהירות spermatozoa את קצב המסגרות.</li>
			<li>שמור את הסידור.</li>
		</ol>
</li>
		<li>בחר ללכוד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לנתח את הזרע צלופח האירופית עם תוכנה
	<ol>
<li>הכינו את הפתרון activator (מי ים מלאכותי) על-ידי הוספת 0.946 גר' מלח מסחרי 25 מ ל מים מזוקקים עם 2% BSA.</li>
		<li>לקחת 500 מ"ל של פתרון activator (מי ים מלאכותי) ומניחים על המקפצה קריר יותר. הערה: באופן כללי, דגים זרע מופעל על-ידי אירוע שוק אוסמוטי, למרות עבור מינים מסוימים ריכוז יון יכול גם להיות חשוב. מים מתוקים מינים, המדיום activator צריך להיות osmolality היפוטוניק, בעוד מינים ימיים המדיום צריך להיות hypertonic.</li>
		<li>להכניס לחדר הספירה מתחת לבמה קירור ולחכות עד מייצבת הטמפרטורה עד 4 ° C.</li>
		<li>מערבבים את activator ואת הזרע מדולל להפעיל spermatozoa ולהתחיל את תנועתיות ההקלטה בין 5-10 s לאחר ההפעלה.<ol>
<li>לקחת 4 µL activator פתרון ומקום בתא ספירה.</li>
			<li>Homogenize בעדינות את הזרע מדולל ע י ניעור של microcentrifuge 3 פעמים כדי למנוע נזק בתאים spermatozoa.</li>
			<li>לקחת 0.5 µL של זרע מדולל, מערבבים עם activator, שים את המכסה בתא הספירה במהירות. הערה: שלב זה לא אמור לקחת יותר מ 5 s כדי להתחיל את הניתוח בהקדם האפשרי.</li>
			<li>להתמקד על תאים spermatozoa ולמצוא את האזור החזותי הטוב ביותר, אשר מוגדר על ידי מספר נמוך של spermatozoa (150-200 תאים) כדי להימנע יירוט בין תאים (איור משלים 1A). בחר ללכוד וידאו כדי להשיג את המסילה spermatozoa, אשר מופרדים לפי מהירות.</li>
			<li>בחר ללכוד כדי לקבל 3 עד 7 שדות, המהווים מרווח הזמן האופטימלי כדי להשיג את השתנות התחתון בתוצאות, והמשך כמו קודם. סרטי הרשומה עד 120 s אחר-הפעלה על מנת למנוע עיבוי על השער של תא ספירה.</li>
			<li>בחר יציאה כדי לקבל מראה כללי של כל השדות.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. לקבל נתונים תנועתיות
<ol><li>בחר שדות | חלקית | שמור ובחרו שם קובץ. לחץ על שמור. הערה: הגיליון מספק ערכים אכזרי של נתונים חלקיים, תרשימים ותמונות של רצועות spermatozoa.</li>
	<li>בחר נתונים כלליים | שם הקובץ | להציל את. הערה: הנתונים מספקים קינטי ערכים בודדים spermatozoa של כל השדות.</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

התוכנה ניתוח זרע בשימוש פרוטוקול זה שימש על ידי חוקרים ברחבי העולם עבור מינים שונים, כולל דגים. עם זאת, דגים יש מספר תכונות ספציפיות יכול להשפיע על ההערכה זרע. דגים spermatozoa הראו מהירות גבוהה ברגע של ההפעלה אשר מסרב במהירות, מוביל זמן קצר של תנועתיות לאחר ההפעלה. חוץ מזה, הטמפרטורה של רבייה היא...

היעילות של רבייה תלויה באיכות של שתי גמטות (ביצים, זרע)1,2. . זה הגורם אשר תורם הפריה מוצלחת, ומאפשר התפתחות הצאצאים קיימא3,4 הערכת איכות תא רבייה נוח הוא הכלי הטוב ביותר עבור הגדרת את פוטנציאל הפוריות של הדגימה.
ערבוב זרע מן הזכרים מרובים הוא מנהג נפוץ בייצור של מינים ימיים מסחריים רבים4. עם זאת, ההשתנות זרע בין הזכרים יכול להוביל זרע תחרות, כתוצאה מכך, לא כל הגברים באותה מידה תורמים מאגר הגנים5. במובן זה, הערכת הנכונות לפלוט בודדים/spermatozoa תכונות, כגון תנועתיות, הוא היסוד המפלה מידע לגבי פוריות הגבר בודדים פוטנציאליים. התבוננות תנועתיות הזרע יכול להפיק נתונים לא מדויקים ולא סובייקטיבי כפי שהוא דורש זמן וניסיון, מה שמוביל חוסר עקביות של אי-תאימות של תוצאות6,7. עם זאת, ישנם טכניקות חדשניות, מהיר ולא כמותית רבות שיכול לספק2,4ניתוח איכות הזרע אמין.
ניתוח המחשב בסיוע זרע פותחה להציע נתונים מדויקים לגבי איכות הזרע8. טכנולוגיה זו כוללת הפיתוח של תוכנה הקשורים עם מיקרוסקופ לעומת זאת שלב המאפשר להערכת תנועתיות הזרע. עם זאת, גורם מגביל של תנועתיות פרמטר הוא קצב המסגרות של מצלמת הוידאו. Spermatozoa בודדים מסלולים מבוססים על spermatozoa ראש centroid המיקום במסגרות רצופים של הקלטות וידאו, אשר הוא מתואם עם התנועה השוטוניים דפוסי3,9,10, 11. הפרמטרים העיקריים קינטי נמדד הם מהירות הקו הישר (וי), מהירות לאכסדרות (צ'לו) נתיב ממוצע מהירות (ידינו). וי הוא המרחק בין נקודת המוצא מובילים שגבה את spermatozoa מחולק זמן. צ'לו היא המהירות האמיתית לאורך המסלול נלקחה על ידי spermatozoa. ידינו הוא המהירות לאורך נתיב מוחלקים נגזרת של המסלול. פרמטרים אלה מאפשרים פרטים קינטי נוספים, לרבות ליניאריות (לין), יושר (STR), התנודדות (WOB), מדידות מכות כמו משרעת של התנועה הראשי לרוחב (ALH) ו ביט-צלב תדר (BCF)4,10.
מערכת ניתוח זרע ששימש במקור עבור יונקים, אחת הדרישות של המערכת לפעול טמפרטורת הגוף של התורם (כ 37 מעלות צלזיוס). תוכנה זו יכולה לשמש גם זני דגים; למרות, יש צורך לבצע כמה עיבודים כדי להפחית את השגיאה של תוצאות ניתוח זרע. במינים מסוימים דג ', כגון סלמונאיים: צלופח8,12, ההפריה מתרחשת בטמפרטורה נמוכה (בסביבות 4 ° C)2,4. לפיכך, התקני קירור צריכה להיות מפותחת כדי להימנע תנאי עבודה לא נוח. בנוסף, דג spermatozoa immotile בנוזל הזרע, לדרוש מכת אוסמוטי להפעלת תנועתיות. מים מתוקים מינים, המדיום activator צריך להיות osmolality היפוטוניק, בעוד מינים ימיים המדיום צריך להיות hypertonic. עם זאת, עבור מינים מסוימים, כמו סלמונאיים:, ריכוז יון יכול גם להיות חשוב3,4,9. לאחר ההפעלה, דגים זרע מאופיין על ידי ירידה מהירה של תנועתיות (פחות מ- 2 דקות)13,14 ו בדחיסות גבוהה, להיות חיוני כדי לקבוע את קצב המסגרות אופטימלית להשיג נתונים אמינים15.
מטרות המחקר הן לעצב וליישם מערכות קירור עבור דגימות זרע של דג. בנוסף, פרוטוקול זה מגדיר כיצד לקבוע את המחירים מסגרת אופטימלית עבור הקמת פרוטוקולים סטנדרטיים בהתאם למין. השימוש בפרוטוקול זה פותח דלתות חדשות בהקשר של הערכת הזרע דגים, משתמש הצלופח אירופה כמודל.

<table><tbody><tr><td>Human Chorionic Gonadotropin</td><td>Argent Chemical Laboratories</td><td>hCG</td><td>Hormone</td></tr><tr><td>Benzocaine</td><td>Merck</td><td>E1501 Sigma</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>sodium bicarbonate</td><td>Merck</td><td>S5761 Sigma&amp;nbsp;</td><td>P1 medium</td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>Merck</td><td>1.06406 EMD Millipore</td><td>P1 medium</td></tr><tr><td>magnesium chloride</td><td>Merck</td><td>1374248 USP</td><td>P1 medium</td></tr><tr><td>potassium chloride</td><td>Merck</td><td>P3911-500G</td><td>P1 medium</td></tr><tr><td>calcium chloride</td><td>Merck</td><td>C7902-500G</td><td>P1 medium</td></tr><tr><td>commercial salt</td><td>Aqua Medic&amp;nbsp;</td><td>Meersalz</td><td>Activator solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>05470 Sigma</td><td>Activator solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon tubes 15 ml</td><td>Merck</td><td>T1943-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes support</td><td>Merck</td><td>R5651-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorfs</td><td>Merck</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet 20 &amp;micro;l</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAN&amp;reg; Classic</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet 10 &amp;micro;l</td><td>Merck</td><td>Z683787-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Tips for micropipets 20 &amp;micro;l</td><td>Merck</td><td>Z740030-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Tips for micropipets 10 &amp;micro;l</td><td>Merck</td><td>Z740028-2000EA</td><td></td></tr><tr><td>Spermtrack</td><td>PROiSER</td><td>Counting chamber</td><td></td></tr><tr><td>TruMorph</td><td>PROiSER</td><td>TruMorph</td><td></td></tr><tr><td>Microscope UB 200i Serie</td><td>PROiSER</td><td>Microscope</td><td></td></tr><tr><td>Cooler plate</td><td>PROiSER</td><td></td><td>Prototype</td></tr><tr><td>Cooler block</td><td>PROiSER</td><td></td><td>Prototype</td></tr><tr><td>ISAS v1</td><td>PROiSER</td><td>ISAS</td><td>Software</td></tr></tbody></table>

fish sperm assessment using software and cooling devices

להערכת איכות תא רבייה, ישנן טכניקות חדשניות, מהירה, כמותיים שיכול לספק נתונים שימושיים עבור חקלאות ימית. מערכות ממוחשבות לניתוח זרע פותחו כדי למדוד פרמטרים מספר, באחד נמדד בדרך כלל תנועתיות הזרע.
בתחילה, טכנולוגיית מחשב זה תוכנן עבור יונקים, למרות שזה יכול לשמש גם לצורך ניתוח זרע של דג. לדגים יש תכונות ספציפיות אשר יכולים להשפיע על זרע הערכה כגון זמן קצר תנועתיות לאחר ההפעלה ו, במקרים מסוימים, הסתגלות כדי להוריד את הטמפרטורה. לכן, זה הכרחי לשנות רכיבי תוכנה וחומרה לבצע ניתוח תנועתיות יעילה יותר לניתוח זרע של דג. לזרע יונקים, הצלחת חימום משמש כדי לשמור על טמפרטורות אופטימלית של spermatozoa. עם זאת, עבור כמה זני דגים, זה יתרון לשימוש בטמפרטורה נמוכה כדי להאריך את משך הזמן של תנועתיות, מאז הזרע להישאר פעיל למשך פחות מ 2 דקות. לכן, התקני הצינון יש צורך לקרר את דגימות בטמפרטורה קבועה על פני הזמן של ניתוח, כולל על המיקרוסקופ האופטי. פרוטוקול זה מתאר הניתוח של תנועתיות הזרע דגים באמצעות תוכנה לניתוח זרע וקירור חדש התקנים כדי למטב את התוצאות.

ניתוח של אפקט הזמן על תנועתיות הזרע
במקרה של הצלופח האירופית, האחוז של spermatozoa סטטי עלה מ 15 s ל 120 s לאחר ההפעלה (מ- 24.4% ל- 40.7%), ואת האחוז של ניידת spermatozoa מתקדמת ירד (מ 36.9% 20.9%) (איור 1A ו 1B). מבוסס על מהירות, spermatozoa תא...

Watch this Scientific Journal Video about Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices at JoVE.com

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

בפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך של דגים זרע הערכה באמצעות ניתוח המחשב בסיוע זרע, התקני קירור. התוכנה נותנת מהירה, מדויקת, ניתוח כמותי של איכות הזרע דגים בהתבסס על spermatozoa מורפולוגית, יכול להיות כלי שימושי חקלאות מים כדי לשפר את ההצלחה רבייה.

הערכת זרע דגים באמצעות תוכנה, התקני קירור

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

fish-sperm-assessment-using-software-and-cooling-devices

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K Views.  PROiSER R+D S.L.. בפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך של דגים זרע הערכה באמצעות ניתוח המחשב בסיוע זרע, התקני קירור. התוכנה נותנת מהירה, מדויקת, ניתוח כמותי של איכות הזרע דגים בהתבסס על spermatozoa מורפולוגית, יכול להיות כלי שימושי חקלאות מים כדי לשפר את ההצלחה רבייה.

Video: Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and maturation. As of yet, weekly injections of human chorionic gonadotropin (hCG) have proved to maturate males after just 5-6 weeks of treatment, producing high volumes of high-quality sperm during several weeks. In addition, sperm cryopreservation protocols using different extenders, cryoprotectants and cooling and thawing times have been previously described for European eel. Here, we show that Tanaka&#180;s extender solution can be directly used for fertilization or for cryopreservation, making unnecessary the usage of different types of solutions and dilutions. Furthermore, the use of methanol as a cryoprotectant makes this protocol easy to use as methanol has low toxicity and does not activate the sperm. The sperm does not need to be cryopreserved immediately after the addition of the cryoprotectant, and it can be used long after being thawed. Moreover, sperm motility is still high after thawing although it is lower than that of fresh sperm. The aim of this work is to show the best available protocol for European eel handling, maturation, and sperm cryopreservation.

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Protocols for European eel maturation and sperm cryopreservation have been improved over the last years. This article describes the best protocol available using human chorionic gonadotropin (hCG) for inducing maturation and methanol as cryoprotectant.

טיפול וצלופחים טיפול של זכר האירופית (אנגווילה אנגווילה) התבגרות הורמונלית, הקפאה קריוגנית זרע

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Developmental Biology

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, motility and progressive motility, and sperm morphology and viability. However, none of these assessments is good enough to predict the semen quality. Given that maintenance of sperm viability and fertilization potential depends on membrane integrity and intracellular functionality, evaluation of these parameters might enable a better prediction of sperm fertilization competence. Here, we describe three feasible methods to evaluate sperm quality using specific fluorescent probes combined with fluorescence microscopy or flow cytometry analyses. Analyses assessed plasma membrane integrity using 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and propidium iodide (PI), acrosomal membrane integrity using fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and mitochondrial membrane integrity using 5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1). Combinations of these methods are also presented. For instance, use of annexin V combined with PI fluorochromes enables assessing apoptosis and calculating the proportion of apoptotic sperm (apoptotic index). We believe that these methodologies, which are based on examining spermatozoon membranes, are very useful for the evaluation of sperm quality.

Here, we present methodologies to evaluate spermatozoan membrane integrity, a cellular feature associated with sperm fertilization competence. We describe three techniques for the fluorimetric assessment of sperm membranes: simultaneous staining with specific fluorescent probes, fluorescence microscopy, and advanced sperm-dedicated flow cytometry. Examples of combining the methodologies are also presented.

Fluorimetric טכניקות להערכה של ממברנות זרע

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

שני סוגים של מבחני עבור Chemoattraction גילוי זרע צפרדע

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods for safe storage of genetic resources beyond the common practices of keeping breeding colonies. The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Cryopreservation of early-stage germ cells by whole testes NIV offers possibilities for the storage of zebrafish genetic resources, especially since after transplantation they can mature into both male and female gametes. Testes were excised, pinned on an acupuncture needle, equilibrated in two cryoprotective media (equilibration solution containing 1.5 M methanol and 1.5 M propylene glycol; and vitrification solution containing 3 M dimethyl sulfoxide and 3 M propylene glycol) and plunged into liquid nitrogen. Samples were warmed in a series of three consequent warming solutions. The main advantages of this technique are (1) the lack of spermatozoa after digestion of warmed testes thus facilitating downstream manipulations; (2) ultra-rapid cooling enabling the optimal exposure of tissues to liquid nitrogen therefore maximizing the cooling and reducing the required concentration of cryoprotectants, thereby reducing their toxicity; (3) synchronous exposure of several testes to cryoprotectants and liquid nitrogen; and (4) repeatability demonstrated by obtaining viability of above 50% in five different zebrafish strains.

The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Additionally, the repeatability of the method in five different zebrafish strains was tested.

הקפאה קריוגנית של דג זברה Spermatogonia על ידי מחט האשכים כולו שקוע צינון אולטרה מהיר

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

אוסף זרע באיכות דיפרנציאלית בעזרת צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes are critical for the investigations of spindle assembly and chromosome segregation in male meiotic division. The mouse spermatocyte is an ideal model for mechanistic studies of meiosis, however, the effective methods for the analyses of spermatocytes are lacking. In this article, a practical and efficient method for the in vivo inhibition of kinesin-7 CENP-E in mouse spermatocytes is reported. A detailed procedure for testicular injection of a specific inhibitor GSK923295 through abdominal surgery in 3-week-old mice is presented. Furthermore, described here is a series of protocols for tissue collection and fixation, hematoxylin-eosin staining, immunofluorescence, flow cytometry and transmission electron microscopy. Here we present an in vivo inhibition model via abdominal surgery and testicular injection, that could be a powerful technique to study male meiosis. We also demonstrate that CENP-E inhibition results in chromosome misalignment and metaphase arrest in primary spermatocytes during meiosis I. Our in vivo inhibition method will facilitate mechanistic studies of meiosis, serve as a useful method for genetic modifications of male germ lines, and shed a light on future clinical applications.

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

This article reports an in vivo inhibition of CENP-E through abdominal surgery and testicular injection of GSK923295, a valuable model for male meiotic division. Using the immunofluorescence, flow cytometry and transmission electron microscopy assays, we show that CENP-E inhibition results in chromosome misalignment and genome instability in mouse spermatocytes.

הערכה תפקודית של קינזין-7 CENP-E בזרעונים באמצעות עיכוב Vivo , אימונופלואורסנציה וציטומטריית זרימה

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology research. Medaka is also used extensively to investigate vertebrate reproduction, which is an essential biological function as it allows a species to perpetuate. Sperm quality is an important indicator of male fertility and, thus, reproduction success. Techniques for extracting sperm and sperm analysis are well documented for many species, including teleost fish. Collecting sperm is relatively simple in larger fish but can be more complicated in small model fish as they produce less sperm and are more delicate. This article, therefore, describes two methods of sperm collection in the small model fish, Japanese medaka: testes dissection and abdominal massage. This paper demonstrates that both approaches are feasible for medaka and shows that abdominal massage can be performed a repeated number of times as the fish quickly recover from the procedure. This article also describes a protocol for computer-assisted sperm analysis in medaka to objectively assess several important indicators of medaka sperm quality (motility, progressivity, duration of motility, relative concentration). These procedures, specified for this useful small teleost model, will greatly enhance understanding of the environmental, physiological, and genetic factors influencing fertility in vertebrate males.

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

This article describes two quick and efficient methods for collecting sperm from the small model fish medaka (Oryzias latipes), as well as a protocol for reliably assessing sperm quality using computer-assisted sperm analysis (CASA).

איסוף זרע וניתוח זרע בעזרת מחשב במודל הטלוסט מדאקה היפנית (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology ...

U-Shaped Horizontal Swimming Technique for Preparing High-Quality Sperm with Low DNA Fragmentation Index

Human semen is a complex mixture comprising progressively motile spermatozoa, non-progressively motile spermatozoa, immotile spermatozoa, cell debris, and viscous seminal plasma. High-quality sperm refers to progressively motile spermatozoa with normal morphology, which often exhibit a lower DNA fragmentation index (DFI) and higher fertilization potential. Preparing high-quality sperm is a critical step in human-assisted reproductive technology. The traditional sperm preparation method, discontinuous density gradient centrifugation (DGC), is time-consuming and labor-intensive. Repeated centrifugation can damage sperm DNA, thereby affecting subsequent fertilization and embryo development. This study introduces a U-shaped horizontal swimming (UHS) method for preparing intracytoplasmic sperm injection (ICSI) sperm, which significantly eliminates the detrimental effects of&#160;centrifugation on sperm DNA.&#160;The UHS method involves creating a UHS lane using a fertilization medium within an ICSI operating dish. A 10 &#181;L fertilization medium microdroplet is placed at the starting point on the left side of the UHS lane to hold the semen. Two additional 10 &#181;L fertilization medium buffer droplets are positioned at intervals along the left middle section of the lane, with all droplets connected by fertilization medium. The dish is then covered with culture oil and incubated overnight at 37 &#176;C with 6% CO2 to equilibrate. Subsequently, 3 &#181;L of semen is added to the microdroplet at the starting point. High-quality spermatozoa swim to the right side of the UHS lane, facilitating their suction into the ICSI injection needle. Dead sperm, cell debris, and other viscous impurities largely remain at the initial point or in the buffer droplets. We simultaneously processed 21 semen samples using both UHS and DGC techniques and compared their DFI. The results demonstrated that the DFI in the DGC group was 5.5% &#177; 3.2%, whereas the DFI in the UHS group was 1.7% &#177; 1.1%. The difference between the two groups was statistically significant (P &#60; 0.05).

This protocol describes a method for screening high-quality sperm with a low DNA fragmentation index by utilizing sperm motility characteristics and thigmotaxis. The method employs a U-shaped horizontal swimming lane, enabling high-quality sperm to reach the opposite side through buffer droplets, while dead sperm, cell debris, and impurities are excluded.

טכניקת שחייה אופקית בצורת U להכנת זרע איכותי עם אינדקס פיצול DNA נמוך

Human semen is a complex mixture comprising progressively motile spermatozoa, non-progressively motile spermatozoa, immotile spermatozoa, cell debris, and ...