הפרויקט קיבל מימון העמותה עלות (מזון, חקלאות עלות פעולה FA1205: AQUAGAMETE, ותוכנית של האיחוד האירופי אופק 2020 מחקר וחדשנות תחת מארי Sklodowska-קירי פרויקט מראה מרהיב (GA לא 642893). ברצוננו להודות הצוות המדעי של PROiSER, במיוחד כדי שהתלמיד אלברטו וונדרל ברנאבאו עבור השתתפותו הפעילה הקלטת וידאו של פרויקט זה.

נהלים בנושאים בעלי חיים מעורבים היו אישור (2015/VSC אפונה 00064) הכיוון הכללי של תוצרת חקלאית, משק-החי-València דה Politècnica Universitat.
1. איסוף זרע צלופחים בוגרים האירופית בשבי
הערה: שימוש צלופח האירופית זכרים בהשתתפות טנקים עם מי ים ומערכת recirculation בטמפרטורה קבועה (20 ° C). פנקו עם הורמונים באמצעות הזרקה בקרום הבטן שבועי (גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG); לכל g IU 1.5 ממשקל הגוף דגים). ואקלום דגים בהדרגה החל מ 3 ימים במים מתוקים ואחריו החלפה עם מי ים (1/3 של המים הכולל במיכל) כל יומיים עד שהגיע עם מליחות של 37.0 גר'/mL.
<ol><li>עזים ומתנגד הצלופח 24 שעות לאחר הזרקת הורמון להשיג דגימות עם איכות זרע טובה יותר.<ol>
<li>להכין מראש ההרדמה: להוסיף 300 מ"ג בנזוקאין 100 מ של 70% אתנול. מערבבים היטב ולאחסן ב 4 º C.</li>
		<li>לדלל בנזוקאין בדלי גמיש עם 5 L של מערכת מים בכדי לקבל ריכוז סופי של 60 מ ג/ליטר, מערבבים היטב.</li>
		<li>להעביר את הדגים הדלי עם מערכת מים, בנזוקאין. המתן מספר דקות עד דגים תירגע.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנקות את אזור איברי המין עם מים ויבשה עם נייר סופג כדי למנוע זיהום של זרע דגימות צואה, שתן או מי-ים.</li>
	<li>החל לחץ עדין באזור הבטן, לאסוף דגימות זרע לתוך צינורות פלסטיק 15 מ"ל באמצעות את משאבת ואקום. נפח הזרע עד 6-7 מ ל, בהתאם הזכר.</li>
	<li>שמור דגימות זרע ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה עד תנועתיות ניתוח מבוצע.</li>
</ol>2. להכניס למקרר ו לדלל את דגימות זרע
<ol><li>הכינו מראש את הפתרון כיום. הערה: דגימות זרע צריך להיות מדולל בפתרון ה-extender ספציפיים עבור כל המינים.<ol>
<li>היכונו המדיום-מפעיל דגימות זרע צלופח (P1 בינוני). הוסף 0.42 גר' נתרן ביקרבונט, 1.828 גר' נתרן כלורי, g 0.127 של מגנזיום כלוריד, 0.56 g של אשלגן כלורי, 0.037 גרם סידן כלורי עד 250 מ"ל של מים מזוקקים. מערבבים היטב כדי להמיס. חנות ב 4 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הגדר את מגניבים הבלוק ב 4 ° C כדי לשמר דגימות בטמפרטורה קבועה. המתן עד מייצבת הטמפרטורה.</li>
	<li>לדלל את דגימות זרע באמצעות כיום פתרון ייחודיים לכל מין. הערה: יחס דילול מינים ספציפיים, חייב להיות מוגדר כדי לתקנן את הפרוטוקול. ראשית, מעריכים ריכוז הזרע מבוסס על ריכוז שהושג בניתוח קדם תנועתיות באמצעות תוכנה, כמוסבר בשלבים 3 ו- 4. ניתוח זה, זה גם אפשרי לבחור את דגימות זרע הטוב ביותר בהתאם לאחוז תנועתיות. אחרי זה, החוקר יכול להתחיל לאסוף נתונים עבור הניסוי באמצעות את הדוגמאות הטובות ביותר עם הריכוז הנכון.<ol>
<li>לדלל צלופח דגימות זרע במדיום P1 עם יחס של 1:50. כדי להכין µL 500 של זרע צלופח מדולל, להוסיף 50 µL של דגימת זרע טרי ו- 450 µL של P1. מערבבים היטב.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. להעריך את הפרמטרים תנועתיות הזרע
<ol><li>
הגדרת המודול תנועתיות של התוכנה
	<ol>
<li>הבמה קריר ב 4 ° C והמתן עד זה מייצבת.</li>
		<li>פתח את התוכנה ובחר מודול תנועתיות. צור שם משתמש וסיסמה במידת הצורך.</li>
		<li>בחר מאפיינים ובחר את הפרמטרים הרצויים לפני תחילת הניתוח זרע.<ol>
<li>לחץ על מינים | דגים.</li>
			<li>בחר את מסגרות לכל השני ואת מספר תמונות, בהתאם לתנאי הטכני הטוב ביותר עבור כל המינים. הגדר שתי האפשרויות-120 תמונות לשניה.</li>
			<li>לבחור הניגוד השלילי. . זה הכרחי עבור שחזור מדויק של ה-מסלולים spermatozoa16.</li>
			<li>בחר את המקביל קאמרית סופר ואת קנה המידה של מצלמת הוידאו. כיילו את מצלמת הווידאו עבור העדשה ההגדלה המשמשים את הניסוי. הגדר SpermTrack10 כמו חדר הספירה ואת סולם X 10. הערה: באופן כללי, לעומק של 10 מיקרומטר בתא הספירה ו עדשה ההגדלה של 10 X הם התנאים המומלצת מכיוון שהם מספקים יותר התמקדות של כל spermatozoa וללכוד את המספר הגבוה ביותר של תאים. עם זאת, מומלץ לבצע מחקר קודם של התנאים האופטימלי לניתוח תנועתיות של כל מין.</li>
			<li>להתאים את אזור החלקיקים ואת קישוריות עבור כל המינים. הגדר אזור המינימלי חלקיקים ב 2 מיקרומטר2 וקישוריות ל- 7 מיקרומטר. הערה: דגים, הערך המינימלי של חלקיקים באזור נעה בין 2-5 מיקרומטר וקישוריות תלוי את מהירות spermatozoa את קצב המסגרות.</li>
			<li>שמור את הסידור.</li>
		</ol>
</li>
		<li>בחר ללכוד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לנתח את הזרע צלופח האירופית עם תוכנה
	<ol>
<li>הכינו את הפתרון activator (מי ים מלאכותי) על-ידי הוספת 0.946 גר' מלח מסחרי 25 מ ל מים מזוקקים עם 2% BSA.</li>
		<li>לקחת 500 מ"ל של פתרון activator (מי ים מלאכותי) ומניחים על המקפצה קריר יותר. הערה: באופן כללי, דגים זרע מופעל על-ידי אירוע שוק אוסמוטי, למרות עבור מינים מסוימים ריכוז יון יכול גם להיות חשוב. מים מתוקים מינים, המדיום activator צריך להיות osmolality היפוטוניק, בעוד מינים ימיים המדיום צריך להיות hypertonic.</li>
		<li>להכניס לחדר הספירה מתחת לבמה קירור ולחכות עד מייצבת הטמפרטורה עד 4 ° C.</li>
		<li>מערבבים את activator ואת הזרע מדולל להפעיל spermatozoa ולהתחיל את תנועתיות ההקלטה בין 5-10 s לאחר ההפעלה.<ol>
<li>לקחת 4 µL activator פתרון ומקום בתא ספירה.</li>
			<li>Homogenize בעדינות את הזרע מדולל ע י ניעור של microcentrifuge 3 פעמים כדי למנוע נזק בתאים spermatozoa.</li>
			<li>לקחת 0.5 µL של זרע מדולל, מערבבים עם activator, שים את המכסה בתא הספירה במהירות. הערה: שלב זה לא אמור לקחת יותר מ 5 s כדי להתחיל את הניתוח בהקדם האפשרי.</li>
			<li>להתמקד על תאים spermatozoa ולמצוא את האזור החזותי הטוב ביותר, אשר מוגדר על ידי מספר נמוך של spermatozoa (150-200 תאים) כדי להימנע יירוט בין תאים (איור משלים 1A). בחר ללכוד וידאו כדי להשיג את המסילה spermatozoa, אשר מופרדים לפי מהירות.</li>
			<li>בחר ללכוד כדי לקבל 3 עד 7 שדות, המהווים מרווח הזמן האופטימלי כדי להשיג את השתנות התחתון בתוצאות, והמשך כמו קודם. סרטי הרשומה עד 120 s אחר-הפעלה על מנת למנוע עיבוי על השער של תא ספירה.</li>
			<li>בחר יציאה כדי לקבל מראה כללי של כל השדות.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. לקבל נתונים תנועתיות
<ol><li>בחר שדות | חלקית | שמור ובחרו שם קובץ. לחץ על שמור. הערה: הגיליון מספק ערכים אכזרי של נתונים חלקיים, תרשימים ותמונות של רצועות spermatozoa.</li>
	<li>בחר נתונים כלליים | שם הקובץ | להציל את. הערה: הנתונים מספקים קינטי ערכים בודדים spermatozoa של כל השדות.</li>
</ol>

<ol><li>Kime, D. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0166445X96008065">Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) for monitoring the effects of pollution on sperm quality of fish; application to the effects of heavy metals.</a> Aquatic Toxicology. 36, 223-237 (1996).</li>
<li>Kime, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+sperm+analysis+%28CASA%29+as+a+tool+for+monitoring+sperm+quality+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+C%3A+Toxicology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).</li>
<li>Bobe, J., Labbé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+and+sperm+quality+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Egg and sperm quality in fish.</a> General and Comparative Endocrinology. 165, 535-548 (2010).</li>
<li>Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0044848603008330">The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish.</a> Aquaculture. 234, 1-28 (2004).</li>
<li>Bekkevold, D., Hansen, M. M., Loeschcke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+reproductive+competition+in+spawning+aggregations+of+cod+%28Gadus+morhua%2C+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadus morhua, L.).</a> Molecular Ecology. 11, 91-102 (2002).</li>
<li>Chong, A. P., Walters, C. A., Weinrieb, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neglected+laboratory+test%3A+the+semen+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">The neglected laboratory test: the semen analysis.</a> Journal of Andrology. 4, 280-282 (1983).</li>
<li>Overstreet, J. W., Katz, D. F., Hanson, F. W., Fonesca, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+tests+for+human+male+reproductive+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Teratogenesis%2C+Carcinogenesis%2C+and+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Laboratory tests for human male reproductive risk assessment.</a> Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 4, 67-82 (1984).</li>
<li>Gallego, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+European+eel+%28Anguilla+anguilla%29+sperm+motility+evaluation+by+CASA+software%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Standardization of European eel (Anguilla anguilla) sperm motility evaluation by CASA software.</a> Theriogenology. 79, 1034-1040 (2013).</li>
<li>Fauvel, C., Suquet, M., Cosson, J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1439-0426.2010.01529.x">Evaluation of fish sperm quality.</a> Journal of Applied Ichthyology. 26, 636-643 (2010).</li>
<li>Mortimer, S. T., Schoëvaërt, D., Swan, M. A., Mortimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+observations+of+flagellar+motility+of+capacitating+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Quantitative observations of flagellar motility of capacitating human spermatozoa.</a> Human Reproduction. 12, 1006-1012 (1997).</li>
<li>Bompart, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CASA-Mot+technology%3A+How+results+are+affected+by+the+frame+rate+and+counting+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">CASA-Mot technology: How results are affected by the frame rate and counting chamber.</a> Reproduction, Fertility and Development. , (2018).</li>
<li>Vladić, T., Järvi, T. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1095-8649.1997.tb01632.x">Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout - the effect of water temperature.</a> Journal of Fish Biology. 50, 1088-1093 (1997).</li>
<li>Rurangwa, E., Volckaert, F. A. M., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11245263">Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardizes fertilisation in African catfish (Clarias gariepinus).</a> Theriogenology. 55, 751-769 (2001).</li>
<li>Cosson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+fish+spermatozoa%3A+racing+ephemeral+swimmers%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers.</a> Reproduction. 136, 277-294 (2008).</li>
<li>Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+best+frame+rate+for+evaluation+of+sperm+motility+in+different+species+by+computer-assisted+sperm+analysis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis?</a> Fertility and Sterility. 96, 24-27 (2011).</li>
<li>Soler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+holographic+solution+for+sperm+motility+analysis+in+boar+samples.+Effect+of+counting+chamber+depth%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">A holographic solution for sperm motility analysis in boar samples. Effect of counting chamber depth.</a> Reproduction, Fertility and Development. , (2018).</li>
<li>Elliot, F. I., Sherman, J. K., Elliot, E. J., Sullivan, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photo+method+of+measuring+sperm+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">A photo method of measuring sperm motility.</a> Journal of Animal Science. 37, 310(1973).</li>
<li>Katz, D. F., Dott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+measuring+swimming+speed+of+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">Methods of measuring swimming speed of spermatozoa.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 45, 263-272 (1975).</li>
<li>Liu, Y. T., Warme, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computerized+evaluation+of+sperm+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Computers+and+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">Computerized evaluation of sperm cell motility.</a> Computers and Biomedical Research. 10, 127-138 (1977).</li>
<li>Jecht, E. W., Russo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+the+quantitative+analysis+of+human+sperm+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">A system for the quantitative analysis of human sperm motility.</a> Andrologia. 5, 215-221 (1973).</li>
<li>Holt, W. V., Palomo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+continuous+real-time+computerized+semen+analysis+system+for+ram+sperm+motility+assessment%2C+and+evaluation+of+four+methods+of+semen+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Optimization of a continuous real-time computerized semen analysis system for ram sperm motility assessment, and evaluation of four methods of semen preparation.</a> Reproduction, Fertility and Development. 8, 219-230 (1996).</li>
<li>Stephens, D. T., Hickman, R., Hoskins, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description%2C+validation%2C+and+performance+characteristics+of+a+new+computer-automated+sperm+motility+analysis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Description, validation, and performance characteristics of a new computer-automated sperm motility analysis system.</a> Biology of Reproduction. 38, 577-586 (1988).</li>
<li>Mortimer, D., Goel, N., Shu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+CellSoft+automated+semen+analysis+system+in+a+routine+laboratory+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the CellSoft automated semen analysis system in a routine laboratory setting.</a> Fertility and Sterility. 50, 960-968 (1988).</li>
<li>Mortimer, S. T., Swan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinematics+of+capacitating+human+spermatozoa+analysed+at+60+Hz%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Kinematics of capacitating human spermatozoa analysed at 60 Hz.</a> Human Reproduction. 10, 873-879 (1995).</li>
<li>Holt, W. V., O'Brien, J., Abaigar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+interpretation+of+computer-assisted+sperm+analyses+and+sperm+sorting+methods+in+assisted+breeding+and+comparative+research%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Applications and interpretation of computer-assisted sperm analyses and sperm sorting methods in assisted breeding and comparative research.</a> Reproduction, Fertility and Development. 19, 709-718 (2007).</li>
<li>Gill, H. Y., Van Arsdalen, K., Hypolote, J., Levin, R., Ruzich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+two+computerized+semen+motility+analyzers%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Comparative study of two computerized semen motility analyzers.</a> Andrologia. 20, 433-440 (1988).</li>
<li>Jasko, D. J., Lein, D. H., Foote, R. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2254179">A comparison of two computer-assisted semen analysis instruments for the evaluation of sperm motion characteristics in the stallion.</a> Journal of Andrology. 11, 453-459 (1990).</li>
<li>Vantman, D., Koukoulis, G., Dennison, L., Zinaman, M., Sherins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+semen+analysis%3A+Evaluation+of+method+and+assessment+of+the+influence+of+sperm+concentration+on+linear+velocity+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted semen analysis: Evaluation of method and assessment of the influence of sperm concentration on linear velocity determination.</a> Fertility and Sterility. 49, 510-515 (1988).</li>
<li>Kime, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+sperm+analysis+%28CASA%29+as+a+tool+for+monitoring+sperm+quality+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+C%3A+Toxicology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).</li>
<li>Scherr, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+and+numerical+simulation+as+methods+for+standardization+of+zebrafish+sperm+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Microfluidics and numerical simulation as methods for standardization of zebrafish sperm cell activation.</a> Biomedical Microdevices. 17, 65-75 (2015).</li>
<li>Mortimer, S. T., Swan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+image+sampling+frequency+on+established+and+smoothing-independent+kinematic+values+of+capacitating+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of image sampling frequency on established and smoothing-independent kinematic values of capacitating human spermatozoa.</a> Human Reproduction. 14, 997-1004 (1999).</li>
<li>Hoogewijs, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+counting+chamber+type+on+CASA+outcomes+of+equine+semen+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Influence of counting chamber type on CASA outcomes of equine semen analysis.</a> Equine Veterinary Journal. 44, 542-549 (2012).</li>
<li>Soler, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/289987642_Effect_of_counting_chamber_on_seminal_parameters_analyzing_with_the_ISASv1_R">Effect of counting chamber on seminal parameters, analyzing with the ISASv1®.</a> Revista Internacional de Andrología. 10, 132-138 (2012).</li>
<li>Didion, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+semen+analysis+and+its+utility+for+profiling+boar+semen+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling boar semen samples.</a> Theriogenology. 70, 1374-1376 (2008).</li>
<li>David, G., Serres, C., Jouannet, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2384341">Kinematics of human spermatozoa.</a> Gamete Research. 4, 83-95 (1981).</li>
<li>Björndahl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+normal+semen+quality%3F+On+the+use+and+abuse+of+reference+limits+for+the+interpretation+of+semen+results%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Fertility+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">What is normal semen quality? On the use and abuse of reference limits for the interpretation of semen results.</a> Human Fertility (Cambridge). 14, 179-186 (2011).</li>
<li>Verstegen, J., Iguer-ouada, M., Onclin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+semen+analyzers+in+andrology+research+and+veterinary+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice.</a> Theriogenology. 57, 149-179 (2002).</li>
<li>Alavia, S. M. H., Cosson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+motility+in+fishes.+I.+Effects+of+temperature+and+pH%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review.</a> Cell Biology International. 29, 101-110 (2005).</li>
<li>Islam, M. S., Akhter, T. <a target="_blank" href="http://article.sapub.org/10.5923.j.als.20110101.03.html">Tale of Fish Sperm and Factors Affecting Sperm Motility: A Review.</a> Advancements in Life Sciences. 1, 11-19 (2011).</li>
<li>Dadras, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+common+carp+Cyprinus+carpio+sperm+motility+and+lipid+composition+using+different+in+vitro+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Reprod.+Sci%22%5BJournal%5D)">Analysis of common carp Cyprinus carpio sperm motility and lipid composition using different in vitro temperatures.</a> Anim. Reprod. Sci. 180, 37-43 (2017).</li>
<li>Soler, C., García, A., Contell, J., Segervall, J., Sancho, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinematics+and+subpopulations%27+structure+definition+of+blue+fox+%28Alopex+lagopus%29+sperm+motility+using+the+ISASV1+CASA+system%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Kinematics and subpopulations' structure definition of blue fox (Alopex lagopus) sperm motility using the ISASV1 CASA system.</a> Reproduction in Domestic Animals. 49, 560-567 (2014).</li>
<li>Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermiogram+and+sperm+head+morphometry+assessed+by+multivariate+cluster+analysis+results+during+adolescence+%2812-18+years%29+and+the+effect+of+varicocele%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele.</a> Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).</li>
<li>Soler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dog+sperm+head+morphometry%3A+its+diversity+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution.</a> Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).</li>
<li>Valverde, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometry+and+subpopulation+structure+of+Holstein+bull+spermatozoa%3A+variations+in+ejaculates+and+cryopreservation+straws%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws.</a> Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

התוכנה ניתוח זרע בשימוש פרוטוקול זה שימש על ידי חוקרים ברחבי העולם עבור מינים שונים, כולל דגים. עם זאת, דגים יש מספר תכונות ספציפיות יכול להשפיע על ההערכה זרע. דגים spermatozoa הראו מהירות גבוהה ברגע של ההפעלה אשר מסרב במהירות, מוביל זמן קצר של תנועתיות לאחר ההפעלה. חוץ מזה, הטמפרטורה של רבייה היא...

היעילות של רבייה תלויה באיכות של שתי גמטות (ביצים, זרע)1,2. . זה הגורם אשר תורם הפריה מוצלחת, ומאפשר התפתחות הצאצאים קיימא3,4 הערכת איכות תא רבייה נוח הוא הכלי הטוב ביותר עבור הגדרת את פוטנציאל הפוריות של הדגימה.
ערבוב זרע מן הזכרים מרובים הוא מנהג נפוץ בייצור של מינים ימיים מסחריים רבים4. עם זאת, ההשתנות זרע בין הזכרים יכול להוביל זרע תחרות, כתוצאה מכך, לא כל הגברים באותה מידה תורמים מאגר הגנים5. במובן זה, הערכת הנכונות לפלוט בודדים/spermatozoa תכונות, כגון תנועתיות, הוא היסוד המפלה מידע לגבי פוריות הגבר בודדים פוטנציאליים. התבוננות תנועתיות הזרע יכול להפיק נתונים לא מדויקים ולא סובייקטיבי כפי שהוא דורש זמן וניסיון, מה שמוביל חוסר עקביות של אי-תאימות של תוצאות6,7. עם זאת, ישנם טכניקות חדשניות, מהיר ולא כמותית רבות שיכול לספק2,4ניתוח איכות הזרע אמין.
ניתוח המחשב בסיוע זרע פותחה להציע נתונים מדויקים לגבי איכות הזרע8. טכנולוגיה זו כוללת הפיתוח של תוכנה הקשורים עם מיקרוסקופ לעומת זאת שלב המאפשר להערכת תנועתיות הזרע. עם זאת, גורם מגביל של תנועתיות פרמטר הוא קצב המסגרות של מצלמת הוידאו. Spermatozoa בודדים מסלולים מבוססים על spermatozoa ראש centroid המיקום במסגרות רצופים של הקלטות וידאו, אשר הוא מתואם עם התנועה השוטוניים דפוסי3,9,10, 11. הפרמטרים העיקריים קינטי נמדד הם מהירות הקו הישר (וי), מהירות לאכסדרות (צ'לו) נתיב ממוצע מהירות (ידינו). וי הוא המרחק בין נקודת המוצא מובילים שגבה את spermatozoa מחולק זמן. צ'לו היא המהירות האמיתית לאורך המסלול נלקחה על ידי spermatozoa. ידינו הוא המהירות לאורך נתיב מוחלקים נגזרת של המסלול. פרמטרים אלה מאפשרים פרטים קינטי נוספים, לרבות ליניאריות (לין), יושר (STR), התנודדות (WOB), מדידות מכות כמו משרעת של התנועה הראשי לרוחב (ALH) ו ביט-צלב תדר (BCF)4,10.
מערכת ניתוח זרע ששימש במקור עבור יונקים, אחת הדרישות של המערכת לפעול טמפרטורת הגוף של התורם (כ 37 מעלות צלזיוס). תוכנה זו יכולה לשמש גם זני דגים; למרות, יש צורך לבצע כמה עיבודים כדי להפחית את השגיאה של תוצאות ניתוח זרע. במינים מסוימים דג ', כגון סלמונאיים: צלופח8,12, ההפריה מתרחשת בטמפרטורה נמוכה (בסביבות 4 ° C)2,4. לפיכך, התקני קירור צריכה להיות מפותחת כדי להימנע תנאי עבודה לא נוח. בנוסף, דג spermatozoa immotile בנוזל הזרע, לדרוש מכת אוסמוטי להפעלת תנועתיות. מים מתוקים מינים, המדיום activator צריך להיות osmolality היפוטוניק, בעוד מינים ימיים המדיום צריך להיות hypertonic. עם זאת, עבור מינים מסוימים, כמו סלמונאיים:, ריכוז יון יכול גם להיות חשוב3,4,9. לאחר ההפעלה, דגים זרע מאופיין על ידי ירידה מהירה של תנועתיות (פחות מ- 2 דקות)13,14 ו בדחיסות גבוהה, להיות חיוני כדי לקבוע את קצב המסגרות אופטימלית להשיג נתונים אמינים15.
מטרות המחקר הן לעצב וליישם מערכות קירור עבור דגימות זרע של דג. בנוסף, פרוטוקול זה מגדיר כיצד לקבוע את המחירים מסגרת אופטימלית עבור הקמת פרוטוקולים סטנדרטיים בהתאם למין. השימוש בפרוטוקול זה פותח דלתות חדשות בהקשר של הערכת הזרע דגים, משתמש הצלופח אירופה כמודל.

<table><tbody><tr><td>Human Chorionic Gonadotropin</td><td>Argent Chemical Laboratories</td><td>hCG</td><td>Hormone</td></tr><tr><td>Benzocaine</td><td>Merck</td><td>E1501 Sigma</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>sodium bicarbonate</td><td>Merck</td><td>S5761 Sigma&amp;nbsp;</td><td>P1 medium</td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>Merck</td><td>1.06406 EMD Millipore</td><td>P1 medium</td></tr><tr><td>magnesium chloride</td><td>Merck</td><td>1374248 USP</td><td>P1 medium</td></tr><tr><td>potassium chloride</td><td>Merck</td><td>P3911-500G</td><td>P1 medium</td></tr><tr><td>calcium chloride</td><td>Merck</td><td>C7902-500G</td><td>P1 medium</td></tr><tr><td>commercial salt</td><td>Aqua Medic&amp;nbsp;</td><td>Meersalz</td><td>Activator solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>05470 Sigma</td><td>Activator solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon tubes 15 ml</td><td>Merck</td><td>T1943-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes support</td><td>Merck</td><td>R5651-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorfs</td><td>Merck</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet 20 &amp;micro;l</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAN&amp;reg; Classic</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet 10 &amp;micro;l</td><td>Merck</td><td>Z683787-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Tips for micropipets 20 &amp;micro;l</td><td>Merck</td><td>Z740030-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Tips for micropipets 10 &amp;micro;l</td><td>Merck</td><td>Z740028-2000EA</td><td></td></tr><tr><td>Spermtrack</td><td>PROiSER</td><td>Counting chamber</td><td></td></tr><tr><td>TruMorph</td><td>PROiSER</td><td>TruMorph</td><td></td></tr><tr><td>Microscope UB 200i Serie</td><td>PROiSER</td><td>Microscope</td><td></td></tr><tr><td>Cooler plate</td><td>PROiSER</td><td></td><td>Prototype</td></tr><tr><td>Cooler block</td><td>PROiSER</td><td></td><td>Prototype</td></tr><tr><td>ISAS v1</td><td>PROiSER</td><td>ISAS</td><td>Software</td></tr></tbody></table>

fish sperm assessment using software and cooling devices

להערכת איכות תא רבייה, ישנן טכניקות חדשניות, מהירה, כמותיים שיכול לספק נתונים שימושיים עבור חקלאות ימית. מערכות ממוחשבות לניתוח זרע פותחו כדי למדוד פרמטרים מספר, באחד נמדד בדרך כלל תנועתיות הזרע.
בתחילה, טכנולוגיית מחשב זה תוכנן עבור יונקים, למרות שזה יכול לשמש גם לצורך ניתוח זרע של דג. לדגים יש תכונות ספציפיות אשר יכולים להשפיע על זרע הערכה כגון זמן קצר תנועתיות לאחר ההפעלה ו, במקרים מסוימים, הסתגלות כדי להוריד את הטמפרטורה. לכן, זה הכרחי לשנות רכיבי תוכנה וחומרה לבצע ניתוח תנועתיות יעילה יותר לניתוח זרע של דג. לזרע יונקים, הצלחת חימום משמש כדי לשמור על טמפרטורות אופטימלית של spermatozoa. עם זאת, עבור כמה זני דגים, זה יתרון לשימוש בטמפרטורה נמוכה כדי להאריך את משך הזמן של תנועתיות, מאז הזרע להישאר פעיל למשך פחות מ 2 דקות. לכן, התקני הצינון יש צורך לקרר את דגימות בטמפרטורה קבועה על פני הזמן של ניתוח, כולל על המיקרוסקופ האופטי. פרוטוקול זה מתאר הניתוח של תנועתיות הזרע דגים באמצעות תוכנה לניתוח זרע וקירור חדש התקנים כדי למטב את התוצאות.

ניתוח של אפקט הזמן על תנועתיות הזרע
במקרה של הצלופח האירופית, האחוז של spermatozoa סטטי עלה מ 15 s ל 120 s לאחר ההפעלה (מ- 24.4% ל- 40.7%), ואת האחוז של ניידת spermatozoa מתקדמת ירד (מ 36.9% 20.9%) (איור 1A ו 1B). מבוסס על מהירות, spermatozoa תא...

Watch this Scientific Journal Video about Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices at JoVE.com

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

בפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך של דגים זרע הערכה באמצעות ניתוח המחשב בסיוע זרע, התקני קירור. התוכנה נותנת מהירה, מדויקת, ניתוח כמותי של איכות הזרע דגים בהתבסס על spermatozoa מורפולוגית, יכול להיות כלי שימושי חקלאות מים כדי לשפר את ההצלחה רבייה.

הערכת זרע דגים באמצעות תוכנה, התקני קירור

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

fish-sperm-assessment-using-software-and-cooling-devices

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K Views.  PROiSER R+D S.L.. בפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך של דגים זרע הערכה באמצעות ניתוח המחשב בסיוע זרע, התקני קירור. התוכנה נותנת מהירה, מדויקת, ניתוח כמותי של איכות הזרע דגים בהתבסס על spermatozoa מורפולוגית, יכול להיות כלי שימושי חקלאות מים כדי לשפר את ההצלחה רבייה.

Video: Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Genetics

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

מניפולציה ploidy של עוברי דג הזברה עם חום 2 הלם טיפול

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Developmental Biology

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and maturation. As of yet, weekly injections of human chorionic gonadotropin (hCG) have proved to maturate males after just 5-6 weeks of treatment, producing high volumes of high-quality sperm during several weeks. In addition, sperm cryopreservation protocols using different extenders, cryoprotectants and cooling and thawing times have been previously described for European eel. Here, we show that Tanaka&#180;s extender solution can be directly used for fertilization or for cryopreservation, making unnecessary the usage of different types of solutions and dilutions. Furthermore, the use of methanol as a cryoprotectant makes this protocol easy to use as methanol has low toxicity and does not activate the sperm. The sperm does not need to be cryopreserved immediately after the addition of the cryoprotectant, and it can be used long after being thawed. Moreover, sperm motility is still high after thawing although it is lower than that of fresh sperm. The aim of this work is to show the best available protocol for European eel handling, maturation, and sperm cryopreservation.

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Protocols for European eel maturation and sperm cryopreservation have been improved over the last years. This article describes the best protocol available using human chorionic gonadotropin (hCG) for inducing maturation and methanol as cryoprotectant.

טיפול וצלופחים טיפול של זכר האירופית (אנגווילה אנגווילה) התבגרות הורמונלית, הקפאה קריוגנית זרע

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, motility and progressive motility, and sperm morphology and viability. However, none of these assessments is good enough to predict the semen quality. Given that maintenance of sperm viability and fertilization potential depends on membrane integrity and intracellular functionality, evaluation of these parameters might enable a better prediction of sperm fertilization competence. Here, we describe three feasible methods to evaluate sperm quality using specific fluorescent probes combined with fluorescence microscopy or flow cytometry analyses. Analyses assessed plasma membrane integrity using 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and propidium iodide (PI), acrosomal membrane integrity using fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and mitochondrial membrane integrity using 5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1). Combinations of these methods are also presented. For instance, use of annexin V combined with PI fluorochromes enables assessing apoptosis and calculating the proportion of apoptotic sperm (apoptotic index). We believe that these methodologies, which are based on examining spermatozoon membranes, are very useful for the evaluation of sperm quality.

Here, we present methodologies to evaluate spermatozoan membrane integrity, a cellular feature associated with sperm fertilization competence. We describe three techniques for the fluorimetric assessment of sperm membranes: simultaneous staining with specific fluorescent probes, fluorescence microscopy, and advanced sperm-dedicated flow cytometry. Examples of combining the methodologies are also presented.

Fluorimetric טכניקות להערכה של ממברנות זרע

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods for safe storage of genetic resources beyond the common practices of keeping breeding colonies. The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Cryopreservation of early-stage germ cells by whole testes NIV offers possibilities for the storage of zebrafish genetic resources, especially since after transplantation they can mature into both male and female gametes. Testes were excised, pinned on an acupuncture needle, equilibrated in two cryoprotective media (equilibration solution containing 1.5 M methanol and 1.5 M propylene glycol; and vitrification solution containing 3 M dimethyl sulfoxide and 3 M propylene glycol) and plunged into liquid nitrogen. Samples were warmed in a series of three consequent warming solutions. The main advantages of this technique are (1) the lack of spermatozoa after digestion of warmed testes thus facilitating downstream manipulations; (2) ultra-rapid cooling enabling the optimal exposure of tissues to liquid nitrogen therefore maximizing the cooling and reducing the required concentration of cryoprotectants, thereby reducing their toxicity; (3) synchronous exposure of several testes to cryoprotectants and liquid nitrogen; and (4) repeatability demonstrated by obtaining viability of above 50% in five different zebrafish strains.

The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Additionally, the repeatability of the method in five different zebrafish strains was tested.

הקפאה קריוגנית של דג זברה Spermatogonia על ידי מחט האשכים כולו שקוע צינון אולטרה מהיר

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology research. Medaka is also used extensively to investigate vertebrate reproduction, which is an essential biological function as it allows a species to perpetuate. Sperm quality is an important indicator of male fertility and, thus, reproduction success. Techniques for extracting sperm and sperm analysis are well documented for many species, including teleost fish. Collecting sperm is relatively simple in larger fish but can be more complicated in small model fish as they produce less sperm and are more delicate. This article, therefore, describes two methods of sperm collection in the small model fish, Japanese medaka: testes dissection and abdominal massage. This paper demonstrates that both approaches are feasible for medaka and shows that abdominal massage can be performed a repeated number of times as the fish quickly recover from the procedure. This article also describes a protocol for computer-assisted sperm analysis in medaka to objectively assess several important indicators of medaka sperm quality (motility, progressivity, duration of motility, relative concentration). These procedures, specified for this useful small teleost model, will greatly enhance understanding of the environmental, physiological, and genetic factors influencing fertility in vertebrate males.

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

This article describes two quick and efficient methods for collecting sperm from the small model fish medaka (Oryzias latipes), as well as a protocol for reliably assessing sperm quality using computer-assisted sperm analysis (CASA).

איסוף זרע וניתוח זרע בעזרת מחשב במודל הטלוסט מדאקה היפנית (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology ...

U-Shaped Horizontal Swimming Technique for Preparing High-Quality Sperm with Low DNA Fragmentation Index

Human semen is a complex mixture comprising progressively motile spermatozoa, non-progressively motile spermatozoa, immotile spermatozoa, cell debris, and viscous seminal plasma. High-quality sperm refers to progressively motile spermatozoa with normal morphology, which often exhibit a lower DNA fragmentation index (DFI) and higher fertilization potential. Preparing high-quality sperm is a critical step in human-assisted reproductive technology. The traditional sperm preparation method, discontinuous density gradient centrifugation (DGC), is time-consuming and labor-intensive. Repeated centrifugation can damage sperm DNA, thereby affecting subsequent fertilization and embryo development. This study introduces a U-shaped horizontal swimming (UHS) method for preparing intracytoplasmic sperm injection (ICSI) sperm, which significantly eliminates the detrimental effects of&#160;centrifugation on sperm DNA.&#160;The UHS method involves creating a UHS lane using a fertilization medium within an ICSI operating dish. A 10 &#181;L fertilization medium microdroplet is placed at the starting point on the left side of the UHS lane to hold the semen. Two additional 10 &#181;L fertilization medium buffer droplets are positioned at intervals along the left middle section of the lane, with all droplets connected by fertilization medium. The dish is then covered with culture oil and incubated overnight at 37 &#176;C with 6% CO2 to equilibrate. Subsequently, 3 &#181;L of semen is added to the microdroplet at the starting point. High-quality spermatozoa swim to the right side of the UHS lane, facilitating their suction into the ICSI injection needle. Dead sperm, cell debris, and other viscous impurities largely remain at the initial point or in the buffer droplets. We simultaneously processed 21 semen samples using both UHS and DGC techniques and compared their DFI. The results demonstrated that the DFI in the DGC group was 5.5% &#177; 3.2%, whereas the DFI in the UHS group was 1.7% &#177; 1.1%. The difference between the two groups was statistically significant (P &#60; 0.05).

This protocol describes a method for screening high-quality sperm with a low DNA fragmentation index by utilizing sperm motility characteristics and thigmotaxis. The method employs a U-shaped horizontal swimming lane, enabling high-quality sperm to reach the opposite side through buffer droplets, while dead sperm, cell debris, and impurities are excluded.

טכניקת שחייה אופקית בצורת U להכנת זרע איכותי עם אינדקס פיצול DNA נמוך

Human semen is a complex mixture comprising progressively motile spermatozoa, non-progressively motile spermatozoa, immotile spermatozoa, cell debris, and ...