1. הקמת תלת ממדי שיתופי תרבויות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני להקים את שיתוף תרבויות, הסר Matrigel מהמקפיא להפשרה על קרח במקרר 4 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הניסוי, להכין את המדיום לתרבות משותפת, אשר תואמים את המדיום של תאים אפיתל כדי להשתמש בהם (בינוני HMEC בדוגמה זו: DME/F12 בינוני עם 10% שור נסיוב של עגלים, 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אינסולין , 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​הידרוקורטיזון, ו 1 ng / mL EGF). שמור את המדיום על הקרח שעה לפחות 1 לפני ערבוב עם Matrigel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לדלל את Matrigel מופשר, לקבוע את הכמות הרצויה כולל של Matrigel: בינוני (300 μL לכל טוב 24 גם צלחות) ולהוסיף חצי נפח בינוני קר כקרח HMEC לצינור סטרילית על הקרח. לאחר מכן להוסיף את אותו נפח של חצי הכולל של Matrigel מופשר לצינור להשיג דילול 01:01. שמור את הצינור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 50 μL של Matrigel: תערובת בינוני באמצע היטב בארות ייעודיים של צלחת 24 גם וגםדגירה של 10 דק &#39;ב 37 ° C החממה באוויר humidified ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μL נוסף של 450 Matrigel: תערובת בינוני עד בארות דגירה עוד 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, להכין את ההשעיה של fibroblasts 01:01 (כאן ה-טרט, הנציח Fibroblasts הפחתת החלב המבטאים GFP) ותאי אפיתל (כאן ה-טרט, הנציח קו אנוש החלב תא אפיתל להביע RFP) בריכוז של 0.5 x 10 5 תאים כל אחד ב 0.5 מ&quot;ל של מדיום HMEC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלב 60 דקות הדגירה, בעדינות ושחרר את ההשעיה על התא העליון של ג&#39;ל הקרושה, ולחזור התרבות בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נא לא להפריע התרבויות של 2 ימים. אחרי זה, המדיום יכול להיות שונה בכל 2-3 ימים על ידי בעדינות רבה aspirating בינוני מצד הבאר בעדינות להחליף עם המדיום HMEC טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעקב אחר היווצרות אליפטית יום תחת מיקרוסקופ. תרבויות בדרך כלל בוגר לאחר 10-14 ימים. התמונה בתורהמתאים באמצעות אור או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גודל אליפטית ואורך הקרנת ניתן למדוד תחת מיקרוסקופ אור. </li></ol> 2. בידוד של תאים אליפטית שיתופי תרבויות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות רבה, פיפטה התרבות מעלה 10x למטה באמצעות פיפטה סטרילית 2-מ&quot;ל זכוכית. לחלופין, לנתק את קצה קצהו 1000 פלסטיק microliter פיפטה באמצעות מספריים מעוקרות ידי מעוקר או טבילה באתנול 70% כדי פיפטה התרבות. מעבירים את התרבות עם טפטפת או כוס או לחתוך את קצה הצינורית פלסטיק צינור צנטריפוגות סטרילית 15 מ&quot;ל ו צנטריפוגות במשך 5 דקות על סל&quot;ד 2000 בטמפרטורת החדר. את spheroids הסלולר יהיה משקעים בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש עצה סטרילית פיפטה פסטר בעדינות כדי להסיר את Matrigel שיבשו מהחלק העליון של הצינור centrifuged. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל בינוני HMEC על spheroids pelleted, פיפטה למעלה ולמטה 2-3 פעמים עם סטרילית 2 מ&quot;ל זכוכית פיפטה, ולהעביר את התרבות גם ב 24 גםתרביות רקמה צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר spheroids את לצרף מנה לפחות 48 שעות לפני שינוי בינוני. במשך הזמן התאים יעזבו את המבנים spheroidal ולגדול כמו monolayers. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התא מעבר תרבויות כאשר התאים מגיעים למפגש 50%. ראשית להרחיב את התרבות לצלחת 35 מ&quot;מ (כ 2-4 ימים), ואז לצלחת 100 מ&quot;מ (כ 3-5 ימים). בסמוך לפני שלב המעבר, השתמש סטרילית פיפטה פסטר להסיר באופן ידני כמו רבים &quot;spheroids רפאים&quot; שיורית ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את התאים על ידי זרימה cytometry על טוהר האוכלוסייה באמצעות המתאימים שטח פני התא סמנים נוספים אוכלוסיות נפרדות תאים שונים על ידי מיון התא הקרינה במידת הצורך. תאים בודדים מוכנים כעת לניתוח נוסף לפי הצורך. </li></ol> 3. נציג תוצאות ב תלת מימדי אליפטית שיתוף תרבויות, fibroblasts עם ההשתקה Tiam1 מהונדסים לגרום לפלישה גדל לתוך MAטריקס על ידי תאים אפיתל החלב (איור 1, השווה D, E, F ל A, B, C). Fibroblasts עם מהונדסים יתר ביטוי Tiam1 לגרום לפלישה מטריקס ירד ב קו סרטן השד SUM159 התא (איור 1, להשוות J, K, L ל G, H, I). לאחר שיתוף תרבותי spheroids הוקמו, אוכלוסיות תאים יכול להיות מבודד spheroids על ידי ציפוי מחדש בהקשר דו מימדי, כפי שמוצג באיור 2. בהתאם את שיעורי הצמיחה היחסי של תאים שנבדקו, אוכלוסיות טהור יכול לצאת דרך מעבר סדרתי (כפי שמוצג באיור 3) או ניתן למיין באמצעות סמנים סלולריים מתאימים. לאחר במנותק מן 3D שיתוף תרבות, לתאי האפיתל לשמור את המאפיינים שמעניקה התרבות בשיתוף עם fibroblasts על פרקי זמן ארוכים, המאפשר מספיק הזדמנויות לניתוח. בדוגמה זו, חשיפה Tiam1 לקוי fibroblasts גרמו להגירה מוגברת ושיתוף תרבותי HMECs שנמשכה שבועות ארוכיםחרי במנותק מן התרבות המשותפת 3D (איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3760/3760fig1.jpg" /> באיור 1. הדמיה של אליפטית הוקמה שיתוף תרבויות תחת מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי. תרבויות אליפטית מבוססים עם החלב שורות תאים אפיתל פיברובלסטים ואיפשר לצמוח בתרבות של 10-14 ימים. AF: אפיתל = HMEC-mCherry תאים. GL: ותאי אפיתל = SUM159-mCherry תאים. AC, במערכת העיכול: = שליטה RMF-GFP תאים פיברובלסטים. DF: פיברובלסטים = RMF-GFP עם ההשתקה Tiam1. JL: פיברובלסטים = RMF-GFP עם Tiam1 יתר הביטוי. החצים מצביעים על תחזיות אפיתל הפולשים לתוך מטריקס. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3760/3760fig2.jpg" /> איור 2. הדמיה סידורי של תרבויות תחת מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי לאחר במנותק מן התרבות Matrigel. יום 0 מייצג הדמיה מיד לאחר הבידוד, בימים 1, 2 ו5 עולה ימים לאחר הבידוד. הילה של תאים היוצאים עולה אליפטית לאורך זמן. בסופו של דבר, &quot;רוח רפאים&quot; אליפטית עם תאים מעט מאוד נשאר (החץ). Spheroids מעט מאוד נשאר לאחר הסרת שד ומעבר 1. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3760/3760fig3.jpg" /> 3. תרשים זרימה cytometry ניתוח של תאים לאחר במנותק מן Matrigel שיתוף תרבות. לאחר אליפטית שיתוף תרבויות הבשילו, תאים מבודדים 3D שיתוף תרבות עם pipetting ו passaging סדרתי. Aliquots מדגם מנותחים על ידי cytometry זרימה (בדוגמה זו באמצעות הקרינה פלואורסצנטי ירוק ואדום לזהות GFP-להביע fibroblasts mCherry ו-לבטא בתאי אפיתל בהתאמה) כדי לקבוע אוכלוסיות יחסית של תאים אפיתל פיברובלסטים. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3760/3760fig4.jpg" /> איור 4. ההגירה Transwell של HMECs נמשכת לאחר isolatiעל פי Matrigel שיתוף תרבות. אחת האוכלוסיות טהורים התקבלו באמצעות התרבות או מיון התא הקרינה, תאים ניתן לנתח לפי הצורך. כאן ההגירה של HMECs שיתוף תרבותי עם שליטה או (ג) או Tiam1 לקויה (shT) fibroblasts ברחבי transwells מחורר הוערך ב 2 שבועות, 4 ו -8 לאחר במנותק מן התרבות המשותפת.

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100, 57-70 (2000).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Kim, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissue+culture+models+in+cancer+biology.">Three-dimensional tissue culture models in cancer biology.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).</li><li>Li, H., Fan, X., Houghton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment:+the+role+of+the+tumor+stroma+in+cancer.">Tumor microenvironment: the role of the tumor stroma in cancer.</a> J. Cell Biochem. 101, 805-815 (2007).</li><li>Tse, J. C., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+metastasis:+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+contribution+of+tumor+microenvironment.">Mechanisms of metastasis: epithelial-to-mesenchymal transition and contribution of tumor microenvironment.</a> J. Cell Biochem. 101, 816-829 (2007).</li><li>Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+signaling+in+fibroblasts+modulates+the+oncogenic+potential+of+adjacent+epithelia.">TGF-beta signaling in fibroblasts modulates the oncogenic potential of adjacent epithelia.</a> Science. 303, 848-851 (2004).</li><li>Bhowmick, N. A., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-stroma+interactions.">Tumor-stroma interactions.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 15, 97-101 (2005).</li><li>Havlickova, B., Biro, T., Mescalchin, A., Arenberger, P., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+optimization+of+an+organotypic+assay+system+that+imitates+human+hair+follicle-like+epithelial-mesenchymal+interactions.">Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle-like epithelial-mesenchymal interactions.</a> Br. J. Dermatol. 151, 753-765 (2004).</li><li>Kilani, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cytotoxicity+of+gemcitabine+in+bladder+cancer+cell+lines.">Selective cytotoxicity of gemcitabine in bladder cancer cell lines.</a> Anticancer Drugs. 13, 557-566 (2002).</li><li>Seidl, P., Huettinger, R., Knuechel, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+fibroblast-tumor+cell+interaction+causes+downregulation+of+RACK1+mRNA+expression+in+breast+cancer+cells+in+vitro.">Three-dimensional fibroblast-tumor cell interaction causes downregulation of RACK1 mRNA expression in breast cancer cells in vitro.</a> Int. J. Cancer. 102, 129-136 (2002).</li><li>Silzle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+fibroblasts+recruit+blood+monocytes+into+tumor+tissue.">Tumor-associated fibroblasts recruit blood monocytes into tumor tissue.</a> Eur. J. Immunol. 33, 1311-1320 (2003).</li><li>Bartling, B., Demling, N., Silber, R. E., Simm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+stimulus+of+lung+fibroblasts+on+lung+cancer+cells+is+impaired+by+the+receptor+for+advanced+glycation+end-products.">Proliferative stimulus of lung fibroblasts on lung cancer cells is impaired by the receptor for advanced glycation end-products.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 34, 83-91 (2006).</li><li>Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+fibroblasts+to+regulate+the+formation+of+three-dimensional+vessel-like+structures+from+endothelial+cells+in+vitro.">Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290, C1385-C1398 (2006).</li><li>Liu, T., Lin, B., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinoma-associated+fibroblasts+promoted+tumor+spheroid+invasion+on+a+microfluidic+3D+co-culture+device.">Carcinoma-associated fibroblasts promoted tumor spheroid invasion on a microfluidic 3D co-culture device.</a> Lab Chip. 10, 1671-1677 (2010).</li><li>Zengel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+therapy+for+synergic+inhibition+of+tumour+cell+invasion+and+tumour-induced+angiogenesis.">Multimodal therapy for synergic inhibition of tumour cell invasion and tumour-induced angiogenesis.</a> BMC Cancer. 10, 92-92 (2010).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., Heyder, P., Schroeder, J., Knuechel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heterologous+3-D+coculture+model+of+breast+tumor+cells+and+fibroblasts+to+study+tumor-associated+fibroblast+differentiation.">A heterologous 3-D coculture model of breast tumor cells and fibroblasts to study tumor-associated fibroblast differentiation.</a> Exp. Cell Res. 266, 74-86 (2001).</li><li>Djordjevic, B., Lange, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+spheroids+maintained+in+suspension.">Cell-cell interactions in spheroids maintained in suspension.</a> Acta Oncol. 45, 412-420 (2006).</li><li>Hirschhaeuser, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+an+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).</li><li>Hoevel, T., Macek, R., Swisshelm, K., Kubbies, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexpression+of+the+TJ+protein+CLDN1+induces+apoptosis+in+breast+tumor+spheroids.">Reexpression of the TJ protein CLDN1 induces apoptosis in breast tumor spheroids.</a> Int. J. Cancer. 108, 374-383 (2004).</li><li>Paduch, R., Kandefer-Szerszen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D,+tamoxifen+and+beta-estradiol+modulate+breast+cancer+cell+growth+and+interleukin-6+and+metalloproteinase-2+production+in+three-dimensional+co-cultures+of+tumor+cell+spheroids+with+endothelium.">Vitamin D, tamoxifen and beta-estradiol modulate breast cancer cell growth and interleukin-6 and metalloproteinase-2 production in three-dimensional co-cultures of tumor cell spheroids with endothelium.</a> Cell. Biol. Toxicol. 21, 247-256 (2005).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids.">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720-e2720 (2011).</li><li>Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fibroblast+Tiam1+in+tumor+cell+invasion+and+metastasis.">The role of fibroblast Tiam1 in tumor cell invasion and metastasis.</a> Oncogene. 29, 6533-6542 (2010).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

השיטה המוצגת כאן מייצגת גישה פשוטה לניתוח השפעות fibroblasts סטרומה בתאי אפיתל, כולל תאים סרטניים. היא מאפשרת אינטראקציה תאים תאים ישירה בהקשר תלת מימדי נתמך על ידי מטריקס במרתף תאי הממברנה, תוך מתן אפשרות חילוץ קל של תאים מהמטריצה ​​לניתוח נוסף. זה יכול להיות מיושם על מח...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> BD Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356237 </td><td> פנול אדום חינם </td></tr><tr><td> Hyclone בינוני נוזלי קלאסית: DMEM F12 </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30023.01 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone שור עגל סרום </td><td> ThermoScientific </td><td> SH3007303 </td><td></td></tr><tr><td> אינסולין </td><td> EMD כימיקלים </td><td> 407709 </td><td> להמיס 0.005N HCl: 0.22 מסנן מיקרומטר </td></tr><tr><td> הידרוקורטיזון </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4001 </td><td> להמיס EtOH 50%, 0.22 מסנן מיקרומטר </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9644 </td><td> להמיס חומצה אצטית 10mm; 0.22 מיקרומטר המסנן </td></tr></tbody></table>

isolation of mammary epithelial cells from three-dimensional mixed-cell spheroid co-culture

למרות מאמצים אדירים הושקעו בזיהוי מסלולי איתות ומולקולות מעורבים בהתנהגויות סלולריים רגילים וממאירים 1-2, את רוב העבודה הדבר נעשה באמצעות קלאסיות דו מימדי תרבות דגמים סלולריים, המאפשרים מניפולציה התא קל. זה הפך להיות ברור כי מסלולי איתות תאיים מושפעים על ידי כוחות תאיים, כולל ממדיות ואת שטח פני התא המתח 3-4. גישות רבות ננקטו כדי לפתח דגמים תלת ממדיים, כי יותר נכון לייצג את הרקמה ביולוגית ארכיטקטורת 3. בעוד המודלים האלה לשלב ממדיות רב מדגיש אדריכליים, חקר את ההשפעות הנובעות מכך על תאים הוא קליל פחות בתרבות דו מימדי רקמות בשל המגבלות של המודלים ואת הקושי להפיק תאים לצורך ניתוח מאוחר יותר. תפקיד חשוב של microenvironment סביב גידולים tumorigenesis והתנהגות הגידול אניזה הופך מוכר יותר ויותר 4. Stroma הגידול מורכב מספר רב של סוגי תאים ומולקולות תאיים. במהלך התפתחות גידולים קיימים אותות דו כיוונית בין תאים סרטניים ותאים סטרומה 5. אף על פי כמה גורמים שהשתתפו האבולוציה שיתוף גידולים stroma זוהו, עדיין יש צורך לפתח טכניקות פשוטות באופן שיטתי לזהות וללמוד מערך מלא של אותות אלה 6. Fibroblasts הם סוג התא הנפוץ ביותר ברקמות סטרומה רגילים או גידולים הקשורים, ולתרום בתצהיר ותחזוקה של קרום המרתף גורמי גדילה paracrine 7. קבוצות רבות השתמשו בשלוש מערכות תרבות מימדי כדי לחקור את תפקידה של fibroblasts על תפקודים תאיים שונים, לרבות תגובת הגידול לטיפולים, גיוס של תאים חיסוניים, מולקולות איתות, התפשטות, אפופטוזיס, אנגיוגנזה, ופלישה 8-15. יש לנו אופטימיזציה שיטה פשוטה התחתessing את ההשפעות של fibroblasts החלב על תאים אפיתל החלב באמצעות מודל זמין מסחרית תאי מטריקס ליצור תלת ממדי תרבויות של אוכלוסיות תאים מעורבים (עמיתים תרבויות) 16-22. עם תרבות משותפת המשך התאים יוצרים spheroids עם אשכולות fibroblasts בפנים ואת לתאי האפיתל בעיקר על הצד החיצוני של spheroids את ויוצרים רב תאיים תחזיות לתוך מטריקס. מניפולציה של fibroblasts שמוביל הפולשנות שינו תא אפיתל ניתן לכמת בקלות על ידי שינויים מספרים באורך של 23 תחזיות אפיתל. יתר על כן, אנו פיתחו שיטה לבודד תאים אפיתל מתוך תרבות משותפת תלת מימדי המאפשר ניתוח של ההשפעות של חשיפה פיברובלסטים על התנהגות אפיתל. מצאנו כי ההשפעות של תרבות משותפת להימשך שבועות לאחר בידוד תא אפיתל, המתיר מספיק זמן כדי לבצע מבחני מרובים. שיטה זו ניתנת להתאמה של התאיםשינוי פוטנציאל ממאיר לא דורש ציוד מיוחד. טכניקה זו מאפשרת הערכה מהירה של במודלים תאים במבחנה בתנאים רבים, את התוצאות המתאימות ניתן להשוות ברקמות ב vivo בבעלי חיים, כמו גם דגימות רקמה אדם.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture at JoVE.com

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

השיטה פשוטה מתוארת לניתוח השפעות fibroblasts רקמה על תאים אפיתל הכרוכים בכך. השילוב של שיטה זו, תלת מימדי התרבות רקמת יכול להקל על ניתוח של תאים לאחר במנותק מן 3D. הטכניקה היא החלה על תאים שונים של פוטנציאל ממאיר, המאפשר לימוד שיטתי של השפעות stroma הגידול הקשורים על תאים סרטניים.

בידוד של תאים אפיתל החלב של תלת ממדי תאים משולבים תרבות משותפת אליפטית

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

isolation-mammary-epithelial-cells-from-three-dimensional-mixed-cell

Research

JoVE Journal

Biology

16.0K Views.  Tufts Medical Center. השיטה פשוטה מתוארת לניתוח השפעות fibroblasts רקמה על תאים אפיתל הכרוכים בכך. השילוב של שיטה זו, תלת מימדי התרבות רקמת יכול להקל על ניתוח של תאים לאחר במנותק מן 3D. הטכניקה היא החלה על תאים שונים של פוטנציאל ממאיר, המאפשר לימוד שיטתי של השפעות stroma הגידול הקשורים על תאים ס...

Video: Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

תאים אפיתל עכבר החלב טופס Mammospheres במהלך התמיינות Lactogenic

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidic משותף התרבות של תאים וחיידקים אפיתל לחקירת מסיסים אותות בתיווך אינטראקציות

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

החלב להשתלות אפיתל נוהל

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular matrix. The ability of CSCs to participate in the development of endothelium constitutes an important characteristic that directly contributes to the general understanding of the mechanisms of tumorigenesis and tumor metastasis. The purpose of this work is to establish a reproducible methodology to investigate the tumor-initiation capability of ovarian cancer stem cells (OCSCs). Herein, we examined the neovascularization mechanism between endothelial cells and OCSCs along with the morphological changes of endothelial cells using the in vitro co-culture model NICO-1. This protocol allows visualization of the neovascularization step surrounding the OCSCs in a time course manner. The technique can provide insight regarding the angiogenetic properties of OCSCs in tumor metastasis.

Ovarian cancer stem cells (OCSC) are responsible for cancer initiation, recurrence, therapeutic resistance, and metastasis. The OCSC vascular niche is considered to promote self-renewal of OCSCs, leading to chemoresistance. This protocol provides the basis for establishing a reproducible OCSC vascular niche model in vitro.

הערכת התכונות האנגיוגנטיות של תאים דמויי גזע של סרטן השחלות באמצעות מערכת תרבית קו-תרבית תלת-ממדית, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine. To fully exploit these models, it is crucial to study them at cellular and subcellular levels. However, characterizing such in vitro 3D cell culture models can be technically challenging and requires specific expertise to perform effective analyses. Here, this paper provides detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed in vitro 3D cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters. These protocols are applicable to a wide variety of organoids and spheroids that differ in their cell-of-origin, morphology, and culture conditions. From 3D structure harvesting to image analysis, these protocols can be completed within 4-5 days. Briefly, 3D structures are collected, fixed, and can then be processed either through paraffin-embedding and histological/immunohistochemical staining, or directly immunolabeled and prepared for optical clearing and 3D reconstruction (200 &#181;m depth) by confocal microscopy.

Here, we provide detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed three-dimensional cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters, thus enabling the visualization of their morphology, cell-type composition, and interactions.

צביעה והדמיה ברזולוציה גבוהה של מודלים תלת מימדיים של אורגנואידים וכדוריים

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

Isolation of Epithelial Cells from Human Dental Follicle

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was performed on the day of DF harvest. The DF was washed three times with DPBS and then dissected with tissue scissors until the tissue had a pulpy or squishy consistency. Single-cell populations were pelleted by centrifugation and washed with keratinocyte serum-free medium. Heterogeneous cell populations were distributed in a culture dish. Keratinocyte serum-free medium was used to select the epithelial cells. The culture medium was changed daily until no floating debris or dead cells were observed. Epithelial cells appeared within 7-10 days after cell population distribution. Epithelial cells survived in serum-free medium, while &#945;-modification minimal essential medium supplemented with 10% fetal bovine serum allowed the proliferation of mesenchymal-type cells. The DF is a tissue source for the isolation of dental epithelial cells.
The purpose of this study was to establish a method for the isolation of epithelial cells from human DF. Periodontal ligament (PDL) was used for the isolation of human dental epithelial cells. Procuring epithelial cells from human PDL is not always successful due to the small tissue volume, leading to low numbers of epithelial cells. DF has a larger volume than PDL and contains more cells. DF can be a tissue source for the primary culture of human dental epithelial cells. This protocol is easier and more efficient than the isolation method using PDL. Procuring human dental epithelial cells may facilitate further studies of dental epithelial-mesenchymal interactions.

The dental follicle contains an epithelial population and mesenchymal cells. The epithelial population was selected from the heterogeneous dental follicle cell population by providing a distinct culture medium. Epithelial cells survived and formed colonies in a serum-free medium.

בידוד תאי אפיתל מזקיקי השיניים האנושיים

The dental follicle (DF) was harvested during the removal of an impacted third molar by an oral maxillofacial surgeon. Epithelial cell isolation was ...