פרוטוקול זה מדגים שיטה משופרת להשגת תאי אפיתל שיניים אנושיים. קשה לזהות את גלולה התא המצטבר במהלך ההליכים. היזהר כאשר אתה מטפל supernatant כדי למנוע את אובדן אוכלוסיות התא.
כדי להתחיל, לקצור זקיקי שיניים במהלך החילוץ הכירורגי של שן הטוחנות השלישית שהושפעו. התחל נהלי בידוד תאים או לאחסן את זקיקי השיניים בארבע מעלות צלזיוס ב- DPBS עם 3%פניצילין-סטרפטומיצין. כדי לשטוף את זקיקי השיניים, להחזיק את זקיק השיניים עם פינצטה ומניחים אותו צינור כביסה 1.
לנער אותו בעדינות 10 עד 15 פעמים. תוציא את זה ותניח את זה בצינור 2. שוב, לנער אותו 10 עד 15 פעמים.
לבסוף, להוציא אותו ולהניח אותו בצינור 3, ולאחר מכן לנער אותו. לאחר הכביסה שלוש פעמים, מניחים את זקיק השיניים בצלחת תרבות של 60 מ"מ. טחון את הרקמה עם מספריים רקמה עד זקיק השיניים יש מראה pulpy או מעוך.
השתמש בחלק צדדי קטן של צלחת התרבות כדי למזער את אובדן הרקמות. מערבבים מיליליטר אחד כל אחד של קולגנאז סוג 1 ותמיסת פרוטאז בצינור חרוט 15 מיליליטר. מעבירים את הרקמה הטחון לתוך הצינור החרוטי 15 מיליליטר, ולאחר מכן בעדינות לנער אותו ודגור אותו במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.
הוסף חמישה מיליליטר של 0.05%טריפסין-EDTA לצינור. לנער אותו ודגרה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הכן קרטינוציט בינוני המכיל קרטינוציטים ללא סרום בינוני 10% סרום בקר עוברי.
הוסף שלושה מיליליטר של מדיום קרטינוציט לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר חדש. מניחים מסננת 40 מיקרומטר על גבי הצינור הזה. לאחר מכן, שאפו את supernatant מן הצינור המכיל את הרקמה עם פיפטה סרולוגית 10 מיליליטר ולהעביר אותו דרך מסננת.
העבר את ההשעיה שנאספה לצינור חרוט 15 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור ולהסיר את supernatant. לאחר מכן להוסיף שלושה מיליליטר של מדיום ללא סרום קרטינוציט.
צנטריפוגה לעוד שלוש דקות ולהסיר את supernatant. צלחת אוכלוסיית התא הבודד לתוך צלחת תרבות 60 מילימטר באמצעות מדיום ללא סרום קרטינוציט. שמור על צלחת התרבות עם נפח סופי של חמישה מיליליטר באטמוספירה לחה של 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס.
תאים עם מורפולוגיה אפיתל הופיעו בתוך שבעה עד 10 ימים לאחר ציפוי אוכלוסיות תאים בודדים. מספר תאי האפיתל בצורת אבן מרוצפת נע בין אחד לעשר בעת הופעתם והתאים התרחבו למושבות לאורך זמן. הצעד המכריע ביותר הוא כריית זקיק השיניים לחלקיקים קטנים.
זה משפר את ההפרדה של תאים בודדים מרקמת זקיק. תאים mesenchymal ניתן לבודד מזקיק השיניים האנושי. סרום המכיל סביבת תרבות בוחר תאים מזנכימליים ומעכב צמיחה אפיתל מאוכלוסיות תאים בודדים.
פרוטוקול זה מספק את השיטה של רכישת תאי אפיתל השיניים האנושיים. תאי אפיתל נגזר זקיק שיניים ניתן להשתמש לחקר של אינטראקציות אפיתל-מזנכימלי שיניים.
