1. הכנה של האפיתל להשתלות רקמות התורם טריים או קפואים אפיתל ניתן להשתיל לתוך כרית שומן פינה, אבל הכנה מוקדמת של האפיתל תורם קפוא נוח יותר עם ירידה מזערית יעילות ההשתלה (&gt; יעילות 85%). פרוטוקול להכנת אפיתל תורם קפוא הוא כדלקמן: לפני הכנת השתלת אפיתל התורם, להכין התקשורת להקפיא את האפיתל ואת aliquot על 1ml לתוך cryovials. זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים עד הצורך. הקפאת התקשורת מכיל DMEM/F12 התקשורת שנאגרו עם HEPES ו NaHCO 3, 10% בסרום שור העובר (FBS) ו sulphoxide דימתיל 10% (DMSO). קציר אפיתל החלב מן העכבר נקבה מורדמים לאחרונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העכבר עם EtOH 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך באמצע sagittal דרך הקיר הגוף המשתרעת חיק אל עצם החזה ללא חודר את הקרומים הריריים של הגוף הגחון. בצע חתך אלכסוני מן החתך הראשוני על חיק לעבר כל רגל אחורית (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל הקיר הגוף הרחק ממברנות הצפק לחשוף את בלוטת החלב 5 th מפשעתי המצורפת fascia על החלק התחתון של הקיר הגוף. הדרך הטובה ביותר להשיג זאת היא על ידי אוחז בקרום הצפק בזהירות עם החלק המעוגל של זוג מלקחיים מעוקל, נזהרים שלא לנקב את חלל הגוף הגחון. במקביל, לתפוס את הקצה של integument לחתוך ישר עם מלקחיים משוננת ולמשוך את קיר הגוף הרחק קרום הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את קשרי לימפה בתוך בלוטת החלב. קשר הלימפה ממוקמת בצומת של שלושה כלי דם בולטים בלוטת החלב וניתן הרגשתי גולה צפופה בתוך כרית השומן (איור 2). עם קצה של זוג מספריים העין, צביטה השומן הרקמה הסובבת את הצומת. עם אצבע הקדמי בצד האפידרמיס של העור, להפעיל לחץ כדי להעלות את את הצומת של כרית שומן ולצבוט אותו עם זוג מלקחיים מעוקל. מחק את הצומת לימפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מחזיק את השוליים של העור, לתפוס את כרית שומן החלב עם קצה מעוגל של זוג מלקחיים מעוקל ובהדרגה לקלף כרית שומן מן הקיר הגוף. בצע את הכיוון של כרית השומן כלפי המשטח הגבי של העכבר תוך כדי להסיר את בלוטת החלב כולו בחתיכה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את בלוטת החלב על גוש פלסטיק סטרילי לחיתוך. הוספת כמות קטנה של כלי התקשורת, על μl 200, על פני השטח של בלוטת כדי לשמור אותו לח. לקצץ את בלוטת לחתיכות 1mm בסכין גילוח טרי. מחלקים את בלוטת טחון לארבע מנות ולהפיץ בין ארבעה cryovials התקשורת להקפיא עם מלקחיים. שים את cryovials ב הקפאה &quot;מר התא Nalgene פרוסטי שבה יש 250 מ&quot;ל של אלכוהול איזופרופילי בתא החיצוני. שים את במקפיא Nalgene בתוך מקפיא -70 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. Store בקבוקונים של שברי החלב קפוא בחנקן נוזלי עד נדרש השתלה. cryovial כל יכיל שברי בלוטת החלב מספיק השתלת לתוך רפידות שומן פינה של 4 עד 8 עכברים המארח. </li></ol> 2. הכנת תאים להשתלות במעבדה שלנו יש להשתיל תאים מסוגים שונים, כולל החלב קווי הנציח תא אפיתל, החלב שורות תאים סרטניים או תאים החלב הראשוני לעכבר פינה כרית שומן. פרוטוקול להכנת פסיק-D תאים להשתלה הוא כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Comma-D תאים בתרבית התקשורת MECL רגיל המכיל DMEM: F12 בתוספת 2% למבוגרים שור סרום (ABS), mEGF, אינסולין, אנטיביוטי / Antimycotic (AB / PM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Comma-D תאים קציר כאשר התאים הם ומחוברות -90% -85%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא 1200rpm במשך 5 דקות עד גלולה התאים. Resuspend התאים התקשורת MECL טריים להתאים את ריכוז התאים 5 x 10 6 / ml. </li></ol> עבור השתלה של תאים החלב הראשוני, התאים העיקריים אפיתל החלב מבודדים מבלוטות החלב עכבר 5 th באמצעות ניתוק מכני האנזימטית. תאים הם resuspended ב DMEM: התקשורת F12 והותאמו הריכוז הרצוי, בדרך כלל 5 x 10 6 / ml. 3. הנוהל המקובל עבור ניקוי משטח עכבר שומן החלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את שלושת עכבר ישן שבוע המארח. בחר עכברים כי הם &lt;12 גר &#39;כדי להבטיח צמיחה ductal החלב לא היה יזם. אנו משתמשים 200mg/kg ממשקל הגוף של tribromoethanol-2,2,2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי העכבר הוא הרדים, בתוקף לרסן את העכבר, בצד הגחוני עם גפיים המושטת, על הבמה כירורגי כך הבטן היא להקניט. לפני הניתוח, לנהל משככי כאבים, או bupivacaine (1mg/kg &lt;) או עצירות (0.05mg/kg), תת עורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את העור עם מלקחיים כמה מילימטרים מעל האגן והרם אותו כלפי מעלה מהבטן<html> . ניפ את העור עם מספריים ולעשות חתך באמצע sagittal דרך הקיר הגוף המשתרעת חיק אל עצם החזה. אין לנקב את הקרומים הריריים של הגוף הגחון. אל תעשה חתך הראשונית שלך קרוב מדי השופכה, כך קליפים הפצע לא יפריע היכולת של העכבר כדי להשתין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מן החתך הראשוני, לבצע חתכים אלכסוניים דרך העור מאמצע קו לרוחב האגן כלפי כל רגל אחורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באזור המעוגל של מלקחיים המעוגל בעדינות כדי לתפוס את קרום הצפק. שימוש במלקחיים רקמות לתפוס את שולי חתך של העור ולמשוך את קיר הגוף הרחק ממברנות הצפק ולחשוף את בלוטת החלב 5 th מפשעתי ממוקם על fascia על החלק התחתון של הקיר הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצרוב, הפטמה הצומת ושני העורקים המובילים אל הצומת (איור 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את בלוטות הרביעי והחמישי. לצרוב את השוליים של בלוטת החמישי כדי למנוע ingrowth מבלוטת 6 ה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את כרית השומן של בלוטת החלב הרביעי של חיתוך פני כרית שומן עם מספריים רק הגחון (צד לעבר הפטמה) של הצומת. שימוש במלקחיים מעוקל כדי לתפוס בחוזקה את החלק הגחוני של כרית השומן למשוך אותו מהקיר הגוף בחתיכה אחת. לחצו על החלק הגחוני של כרית השומן בין שתי שקופיות לשים צלחת היסטולוגיה מכתים זכוכית המכיל מקבע של Carnoy. רקמה זו תהיה קבועה מוכתם לאחר מכן עם פתרון אלום ארגמן לבדוק שולי פינה (איור 3). נקו את fascia סביב האזור של החלק הסיר של כרית שומן כדי להסיר את כל עקבות של בלוטת החלב עם מלקחיים מעוקל. </li></ol> 4. הליך אלטרנטיבי &quot;מתחשבת עבור ניקוי Pad שומן אחרי אחד הפך מוכשר עם הליך סטנדרטי עבור ניקוי משטח העכבר שומן החלב, הם יעדיפו לנסות את ההליך חוסך פחות פולשני שפותח על ידי בריל et al. (2008) 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו את העכבר כמו בנוהל הרגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס את הפטמה של בלוטת החלב מפשעתי הרביעי וחתך 3-5 מ&quot;מ היקף המעגל סביב הפטמה עם קצה של מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את הפטמה מהגוף לנתק את החלק לחתוך העור לצייר את בלוטת החלב fourth מפשעתי החוצה דרך החור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הצומת. השתמש כויה כדי לצרוב את הצומת ואת בלוטת החלב 6 th דרך החור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור לנתק את החלק השטחי ביותר של בלוטת החלב 5 th ממש לפני הצומת. , באזור הפטמה מעגלי של עור חלק משטח אפיתל החלב שומן המכיל יוסרו בחתיכה אחת. </li></ol> 5. רקמות / השתלת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור שברי אפיתל השתלה, להפשיר cryovial של האפיתל ולהעביר את שברי אפיתל כדי בצלחת פטרי המכילות מדיה טרי לדלל את DMSO. עושים חור בכיס קטן או כרית שומן פינה עם קצה מספריים עבור אפיתל חדש. שים חתיכת 1mm של האפיתל תורם לכיס עם מחט מלקחיים. החזק את כיס סגור עם מלקחיים רקמות כמו שאתה למשוך את מחט מלקחיים כך הרקמה נשארת במקומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תאים השתלה, להזריק 50,000 תאים μl 10 של מדיה לתוך כרית כל השומן באמצעות מזרק 50μl המילטון עם מחט מד 22s. </li></ol> 6. סגירת / התחייה של עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסדרים את העור הסגירה. אחוז המתנגדים שולי העור, להחזיק אותם יחד עם מלקחיים, להרים אותם הרחק את הקרומים הריריים של הגוף הגחון ולסגור עם קליפים הפצע. בדרך כלל, יש צורך להשתמש בשני קליפים כדי לסגור את החתך באמצע sagittal קליפ אחד עבור כל חתך אלכסוני עבור ההליך הסטנדרטי. הימנע חוסם את השופכה. זה עשוי להיות נחוץ כדי לסגור פערים העור בצומת של חתכים אמצע sagittal ו אלכסונית עם תפר. ההליך חוסך רק דורשים קליפ אחד פצע לכל צד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . מניחים את העכבר בתוך הכלוב שלה לשמור את הכלוב תחת מנורת חימום עד העכבר מתאושש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפים הפצע יש להסיר לאחר 2 שבועות. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. הפגנה של דפוס החתך. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. מיקום של הלימפה, כלי הדם, הפטמה אפיתל אנדוגני. לצרוב במקומות המצוין. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. הר שלם מוכיח כי אפיתל אנדוגני היא מוגבלת לאזור בתוך המעגל ולכן השוליים הם &quot;ברור&quot;. 7. נציג תוצאות _r.jpg &quot;alt =&quot; איור 4 &quot;/&gt; איור 4. הר שלם של כרית השומן להסיר העכבר 3 בשבוע הישן מראה שולי פינה. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2_r.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. הר שלם של העכבר בן 10 בשבוע מראה כרית שומן פינה של האפיתל החלב אנדוגני. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3_r.jpg" alt="איור 6" /> איור 6. Hematoxylin וסעיף eosin מוכתם של כרית שומן פינה מהעכבר 10 בשבוע הישן. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig4_r.jpg" alt="איור 7" /> איור 7. הר שלם של העכבר בן 10 בשבוע מראה נורמלי עץ ductal החלב התפתח אפיתל המושתלים. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig5_r.jpg" alt="איור 8" /> איור 8. Hematoxylin וסעיף eosin מוכתם של צינוריות החלב התפתח אפיתל המושתלים. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig6_r.jpg" alt="איור 9" /> איור 9. Hematoxylin ו eosin סעיף מוכתם של גידול החלב התפתח אפיתל המושתלים.

<ol>
	<li>DeOme, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mammary+tumors+from+hyperplastic+alveolar+nodules+transplanted+into+gland-free+mammary+fat+pads+of+female+C3H+mice.">Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice.</a> Cancer Res. 19, 515-520 (1959).</li><li>Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sparing+procedure+to+clear+the+mouse+mammary+fat+pad+of+epithelial+components+for+transplantation+analysis.">A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis.</a> Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).</li><li>Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammary-specific+model+demonstrates+the+role+of+the+p53+tumor+suppressor+gene+in+tumor+development.">A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development.</a> Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).</li><li>Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -. L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439, 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439, 993-997 (2006).</li><li>Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preneoplastic+Lesions+in+Murine+Mammary+Cancer.">Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer.</a> Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).</li><li>Wagner, K. -. U., Boulanger, C. A., Henry, S. g. a. g. i. a. s., Hennighausen, M., Smith, G. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adjunct+mammary+epithelial+cell+population+in+parous+females:+its+role+in+functional+adaptation+and+tissue+renewal.">An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal.</a> Development. 129, 1377-1386 (2002).</li><li>Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+and+progesterone+induce+persistent+increases+in+p53-dependent+apoptosis+and+suppress+mammary+tumors+in+BALB/c-Trp53+/-+mice.">Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).</li></ol>

בדו&quot;ח זה, אנו מציגים שתי שיטות חלופיות עבור ניקוי משטח העכבר שומן החלב לקראת השתלות אפיתל החלב. הנוהל המקובל כבר בשימוש מאז הפיתוח שלה בשנת 1959 על ידי DeOme et al. 1 בעוד פולשני יותר, השיטה המקובלת היא השיטה המועדפת להכשרת טירון כי המבנה והכיוון של בלוטת החלב נת?...

mammary epithelial transplant procedure

מאמר זה מתאר ומשווה את כרית השומן אישור נוהל שפותח על ידי DeOme KB et al. 1 ו את ההליך חוסך שפותחה על ידי בריל B et al. 2, ואחריו הליך ההשתלה החלב אפיתל. הליך ההשתלה החלב נעשה שימוש נרחב על ידי ביולוגים החלב משום שהיא מנצלת את העובדה התפתחות משמעותית של האפיתל החלב אינה מתרחשת רק לאחר גיל ההתבגרות. ב 3 שבועות של גיל, צמיחה של עץ אפיתל החלב מוגבל באזור הפטמה ולוח נטול שומן ברובו של האפיתל החלב, אלא על ידי 7 שבועות של גיל העץ ductal אפיתל משתרע לאורך כרית שומן כולו. לכן, אם זה חלק קטן של כרית שומן המכילה אפיתל, האזור בין הפטמה לבין הלימפה, מוסר בשעה 3 שבועות של גיל, אפיתל אנדוגני לא יהיה לאכלס את כרית שומן החלב ולוח שומן מתואר &quot;כחכח &quot;. בשלב זה, אפיתל החלב ממקור אחר ניתן להשתיל בפנקס השמן פינה שבה יש פוטנציאל להרחיב עצים ductal החלב החוצה דרך כרית שומן. הליך זה נוצל במודלים ניסיוניים רבים, כולל בדיקה של פנוטיפ גידול רקמות אפיתל מהונדס החלב ללא תופעות של בלבול גנוטיפ על החיה כולה 3, בזיהוי של בתאי גזע החלב ידי השתלת תאים דילול מוגבל 4,5, קביעת אם גושים hyperplastic להמשיך גידולים החלב 6, כדי להעריך את ההשפעה של חשיפה מוקדמת ההורמון על התנהגות של האפיתל החלב 7,8. בן שלוש בשבוע עכברים מארח מורדמים, ניקה מאופקת על הבמה כירורגי. חתך אמצע sagittal נעשית דרך העור, אך לא את הצפק, המשתרעת חיק אל עצם החזה. קיצוץ אלכסוני נעשות דרך העור מפני חתך באמצע sagittal לרוחב האגן לכיוון רגל. העור הוא התרחק הצפק לחשוף את בלוטת החלב 4 מפשעתי. כרית שומן מנוקה על ידי הסרת רקמות שומן הקדמי כרית אל הצומת לימפה. שברי אפיתל או לתאי האפיתל מושתלים לתוך כרית הנותרים פינו את השומן ואת העכבר סגור.

Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial Transplant Procedure at JoVE.com

Mammary Epithelial Transplant Procedure

מאמר זה מדגים את נוהל שפותח על ידי DeOme KB<em&gt; Et al.</em&gt; (1959) ואת ההליך חוסך שפותחה על ידי בריל B<em&gt; Et al.</em&gt; (2008) עבור ניקוי משטח 4 מפשעתי שומן החלב של עכבר מתבגרת לקראת השתלה של שברי החלב, לתאי האפיתל החלב, או תאים סרטניים החלב.

החלב להשתלות אפיתל נוהל

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Research

JoVE Journal

Biology

30.9K Views.  University of Massachussetts. מאמר זה מדגים את נוהל שפותח על ידי DeOme KB Et al. (1959) ואת ההליך חוסך שפותחה על ידי בריל B Et al. (2008) עבור ניקוי משטח 4 מפשעתי שומן החלב של עכבר מתבגרת לקראת השתלה של שברי החלב, לתאי האפיתל החלב, או תאים סרטניים החלב.

Video: Mammary Epithelial Transplant Procedure

Investigating the Immunological Mechanisms Underlying Organ Transplant Rejection

בחינת מנגנוני החיסוני בבסיס דחיית איברים להשתלות

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

תאים אפיתל עכבר החלב טופס Mammospheres במהלך התמיינות Lactogenic

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4 has resulted in important insights into mechanisms of metastatic behavior such as migration, invasion and intravasation of tumor cells5, 6, angiogenesis3 and immune cells response7-9. We have recently reported a technique to image orthotopic mammary carcinomas over multiple intravital imaging sessions in living mice10. For this, we have developed a Mammary Imaging Window (MIW) and optimized imaging parameters for Dendra211 photoswitching and imaging in vivo. Here, we describe the protocol for the manufacturing of MIW, insertion of the MIW on top of a tumor and imaging of the Dendra2- labeled tumor cells using a custom built imaging box. This protocol can be used to image the metastatic behavior of tumor cells in distinct microenvironments in tumors and allows for long term imaging of blood vessels, tumor cells and host cells.

Intravital photoswitching and tracking of Dendra2-labeled tumor cells through the Mammary Imaging Window is a technique which allows us to image the metastatic behavior of tumor cells in chosen tumor microenvironments over a timescale of days.

Dendra2 Photoswitching דרך החלון דימות השד

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4  has resulted in important insights into ...

Right Hemihepatectomy by Suprahilar Intrahepatic Transection of the Right Hemipedicle using a Vascular Stapler

Successful hepatic resection requires profound anatomical knowledge and delicate surgical technique. Hemihepatectomies are mostly performed after preparing the extrahepatic hilar structures within the hepatoduodenal ligament, even in benign tumours or liver metastasis.1-5. Regional extrahepatic lymphadenectomy is an oncological standard in hilar cholangiocarcinoma, intrahepatic cholangio-cellular carcinoma and hepatocellular carcinoma, whereas lymph node metastases in the hepatic hilus in patients with liver metastasis are rarely occult. Major disadvantages of these procedures are the complex preparation of the hilus with the risk of injuring contralateral structures and the possibility of bleeding from portal vein side-branches or impaired perfusion of bile ducts. We developed a technique of right hemihepatectomy or resection of the left lateral segments with intrahepatic transection of the pedicle that leaves the hepatoduodenal ligament completely untouched. 6 However, if intraoperative visualization or palpation of the ligament is suspicious for tumor infiltration or lymph node metastasis, the hilus should be explored and a lymphadenectomy performed.

This video describes a right hemihepatectomy with intrahepatic transection of the right hemipedicle leaving the hepatoduodenal ligament completely untouched.

Hemihepatectomy העכבר על ידי חיתוך רוחב intrahepatic Suprahilar של Hemipedicle העכבר באמצעות מהדק דם

Successful hepatic resection requires profound anatomical knowledge and delicate surgical technique. Hemihepatectomies are mostly performed after ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

רקמות קביעת שווי שימוש בבעלי חיים להשתלות (ACT) Assay ב Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

בידוד של תאים אפיתל החלב של תלת ממדי תאים משולבים תרבות משותפת אליפטית

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Cryosectioning שיטה לMicrodissection של Murine גס רירית

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, signaling pathways, and protein translation. This article describes two techniques for biopsy of the bovine mammary gland (MG). Three healthy Holstein dairy cows were the subjects. Before biopsies, cows were milked and subsequently restrained in a cattle chute. An analgesic (flunixin meglumine, 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight) was administered via jugular intravenous [IV] injection 15-20 min prior to biopsy. For standing sedation, xylazine hydrochloride (0.01-0.05 mg/kg of body weight) was injected via the coccygeal vessels 5-10 min before the procedure. Once adequately sedated, the biopsy site was aseptically prepared and locally anaesthetized with 6 mL of 2% lidocaine hydrochloride via subcutaneous injection. Using aseptic technique, a 2 to 3 cm vertical incision was made using a number 10 scalpel. Core and needle biopsy tools were used. The core biopsy tool was attached to a cordless drill and inserted into the MG tissue through the incision using a clock-wise drill action. The needle biopsy tool was manually inserted into the incision site. Immediately after the procedure, an assistant applied pressure on the incision site for 20 to 25 min using a sterile towel to achieve hemostasis. Stainless steel surgical staples were used to oppose the skin incision. The staples were removed 10 days post-procedure. The main advantages of core and needle biopsies is that both approaches are minimally invasive procedures that can be safely performed in healthy cows. Milk yield following the biopsy was unaffected. These procedures require a short recovery time and result in fewer risks of complications. Specific limitations may include bleeding after the biopsy and infection on the biopsy site. Applications of these techniques include tissue collection for clinical diagnosis and research purposes, such as primary cell culture.

This article presents a bovine mammary gland biopsy using core and needle biopsy tools. Harvested tissue can be used for cell culture or to assess mammary physiology and metabolism including gene expression, protein expression, protein modifications, immunohistochemistry, and metabolite concentrations.