מחקר זה נתמך על ידי NIH מחקר מימון (DK090868 ו GM092930 ל TI). יש פטנט על אנלוגי rapamycin בכלוב.

1. Transfection של DNA פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DNAs פלסמיד, 0.5 קרום קשור מיקרוגרם FRB (להלן: LDR) ו -0.5 מיקרוגרם FKBP-Tiam1 (T-cell לימפומה הפלישה גרורות-התרמה חלבון 1: RAC activator) מתויג עם חלבון פלואורסצנטי כדי μl 37.5 DH 2 א &#39; הוסף 1 μl FuGENE HD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. בינתיים, המשך הצעדים 1.3-1.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב בכל חדר 8-גם עם 50 μl פולי-D-ליזין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את מרכז גם כל אחד עם DH 2 א &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize 80-85% confluent-NIH 3T3 תאים לדלל עד בינוני 10 מ&quot;ל התרבות (DMEM עם FBS 10%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של 375 μl של השעיה ו סרכזת ב 1750 סל&quot;ד למשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate התקשורת, נזהר לא להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 750 μl של DMEM FBS w / 10% ו resuspend. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ההשעיה התא DH 2 O / DNA / פתרון FuGENE HD ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 250μl ההשעיה תא / DNA אחד טוב (ימלא עד 3 בארות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים transfected על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 15-18 שעות. </li></ol> 2. הכנת פתרון CRB- <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז בכלוב rapamycin-ביוטין adduct (CRB). ראה &quot;תוכנית סינתטית של CRB&quot; לקבלת פרטים. בקצרה, moieties caging ו ביוטין מוכנים בנפרד. מחצית caging אז הוא מצומדות כדי rapamycin (LC מעבדה), המוצר יחד לאחר מכן מחצית ביוטין באמצעות תגובת לחץ 7 להרשות לעצמם CRB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מיקרומטר המניות הפתרון של CRB ב DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים avidin במינון של 1 ב 250 μl של PBS על צינור 0.5 Eppendorf מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של פתרון המניות CRB כדי avidin מומס. מערבבים כמה פעמים על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות להניב CRB-avidin המצומד (CRB-) פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכללה של מולקולות קטנות מאוגד ולטהר-CRB באמצעות עמודה בגודל הדרה. </li></ol> 3. מיקרוסקופיה תאורה אור ברמת subcellular <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרום להרעיב תאים transfected ב DMEM ללא FBS במשך 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשאוב התקשורת את התאים ומוסיפים 250 μl של 400 ננומטר מוכן CRB-פתרון (משלב 2.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את הדינמיקה חלבונים בתאים חיים ברזולוציה subcellular לפני ואחרי הטיפול האור, מיקרוסקופיה דיסק מסתובב שימש (איור 2 א). תאורה UV הושג על ידי צימוד עבור אופטיקה אור LED UV (365 ננומטר) עם אור EPI-פלואורסצנטי (איור 2b). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MetaMorph תוכנה נעשה שימוש כדי ללכוד תמונות הקרינה של תאים transfected כל 15 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את הקואורדינטות ואת הגודל של המקום תאורה באמצעות צלחת זכוכית מצופה צבעי ניאון נרגש על ידי אור UV. גודל יכוללהיות מגוונים על ידי יישום היעד עם העדשה בהגדלה שונות על ידי בחירת סיבים אופטיים עם גודל הליבה שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קביעת רמות הרקע של עלעול קרום אור, להקרין UV בשולי התאים. את שני השלבים הם לעמת הקודמת השפעות מקומיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברחבי העולם להקרין תאים עם אור 365 ננומטר מסופק על ידי מנורת כספית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים שברחה מכלוב, ובכך rapamycin המקורי DMSO ולאחר מכן PBS (400 nm הסופי), ולהוסיף את הפתרון לחדר ההדמיה לגרום השפעות גלובליות. </li></ol> 4. נציג תוצאות דוגמה תוצאות נציג מוצגת באיור 3. הקרנת אור UV על אזור קטן ליד קצה נייד המושרה במהירות היווצרות מקומית סלסולים רק וליד אזור מוקרן. כדי לאשר כי אכן הפעילות המקומית, לאחר מכן מוקרן ברחבי העולם תאים עם UV, או להוסיף rapamycin לתקשורת בכמות גדולה, הן של WHIפרק המושרה היווצרות קפלים העולמי לאורך הממברנה. לניתוח כמותי, חילקנו תאים היעד לתוך ארבעת הרבעים, וספרו את תדירות היווצרות קפלים ברביע זה על מקומי, כמו גם בעקבות גירוי גלובלית בתנאים שונים, כולל בקרות (איור 4). רק שילוב זה של קרינה UV, CRB-A, ו-המתאימות FKBP FRB בונה שגורם עלעול המקומית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig1.jpg" /> באיור 1. סכמטי של חלבון dimerization מוגבל מרחבית באמצעות בכלוב rapamycin-avidin המצומד (CRB-) אור אולטרה סגול. קרינת UV המסלקת מקשר בין rapamycin ו ביוטין, והתוצאה היא שחרור של חומר כימי dimerizer (HE-ראפה, C40-O-(2-hydroxyethyl) rapamycin) ו תוצר לוואי שלה. Dimerizer מכן שוחרר מתמוסס לתוך התאים וגורם dimerization בין FKBP-POI (חלבון של עניין) ו פלזמה membRane מעוגנת FRB רק בקרבת האזור המוקרן (עיגול כחול). ללא קרינה UV, FKBP ו FRB לא שותף (הצלב האדום), ומכאן לייצר כל השפעה. (כל הזכויות שמורות @ ACS2011) 6 <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig2.jpg" /> איור 2. תמונה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal אישית. (א) צפה הקדמי של מיקרוסקופ confocal (הפוך Axiovert 200, Zeiss). (ב) צילום מקרוב, צפה מעל יחידת צימוד עבור EPI הקרינה ואת התאורה UV. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig3.jpg" /> איור 3. היווצרות קפלים מוגבל מרחבית בתא NIH3T3 transfected הנגרמת על ידי קרינה UV מקומי. תמונות הקרינה confocal של תאים פיברובלסטים NIH3T3 כי הוא transfected עם YFP-מתויג FKBP-Tiam1 (RAC activator) ו LDR (קרום מעוגנת FRB) עברו הקרנה באזור מצומצם ליד הקצה עם LED אור 365 ננומטר במשך 15 שניות החל מ 210 שניות בנוכחות המצומד CRB-בתקשורת בתפזורת. טיפול זה בעקבות גלובל תאורה עם כספית מנורה 1 שניות ב בנוסף שניות והעולמית 1063 של rapamycin 400 nm האחרונים ב 1560 שניות. תא הראו כמעט שום פעילות פורעת בראשית (א), אך הראה מוגבל מרחבית פורעת לאחר תאורה מקומית (עיגול צהוב) (ב). התא הראה היווצרות קפלים העולמי אחרי ההארה הגלובלית תוספת של rapamycin (CD), המציין את היווצרות קפלים המקומי נגרם על ידי הפעלה מוגבלת מרחבית של RAC. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. (כל הזכויות שמורות @ ACS2011) 6 <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig4.jpg" /> איור 4. תדירות היווצרות לפרוע ב הרביעים של NIH3T3 תאים transfected. קרינה UV מקומי עם CRB-A ו-UV הבאה קרינה גלובלית בוצעו על 13 תאים. CRB- </sטרונג&gt; בנוסף (ללא קרינה UV), קרינה UV מקומית עם או בלי avidin יושמו על תאים 13, 5 ו -6, בהתאמה. אף אחד התאים שנצפו הראו היווצרות קפלים עם CRB, ללא קרינה UV או קרינה UV מקומית עם או בלי avidin בתקשורת בתפזורת. אספנו נתונים מכל התאים עם רקע היווצרות נמוכה לפרוע אך היה היכולת של היווצרות קפלים rapamycin-Induced, אשר בדקנו לאחר כל ניסוי תאשר הקמת לפרוע העולמית כתוצאה תוספת של rapamycin (סופי 400 ננומטר). תוצאות אלה הראו כי CRB-A ו-UV הקרנה מקומית נחוצים ליצירת קפלים המקומי בתאים. (כל הזכויות שמורות @ ACS2011) 6 קיצורים: FKBP: FK506 מחייב חלבון FRB: FKBP-rapamycin מחייב חלבון Tiam1: T-cell לימפומה הפלישה גרורות-התרמה חלבון 1 (RAC GEF) LDR: Lyn-DSAG מקשר-FRB (לין: N-מסוף 11 חומצות אמינו של לין קינאז) HE-ראפה: C40-O - (2-hydroxyethyl) rapamycin CRB: rapamycin בכלוב עם מחצית ביוטין CRB-: CRB מצומדות כדי avidin

<ol>
	<li>Etienne-Manneville, S., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+in+cell+biology.">Rho GTPases in cell biology.</a> Nature. 420, 629-635 (2002).</li><li>Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTP-binding+proteins.">Small GTP-binding proteins.</a> Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).</li><li>Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+regulation+of+small+GTPases+as+revealed+by+probes+based+on+the+principle+of+Forster+Resonance+Energy+Transfer+(FRET):+Implications+for+signaling+and+pharmacology.">Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).</li><li>Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+translocation+strategy+to+rapidly+activate+and+inhibit+small+GTPase+signaling+pathways.">An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways.</a> Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).</li><li>Komatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific,+rapid+induction+of+molecular+activities+and+membrane+tethering.">Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering.</a> Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).</li><li>Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photocleavable+rapamycin+conjugate+for+spatiotemporal+control+of+small+GTPase+activity.">A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity.</a> J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).</li><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry:+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions.">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li><li>Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells.">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li><li>Wu, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li><li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light.">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).</li><li>Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+controlled+protein+assembly:+techniques+and+applications.">Chemically controlled protein assembly: techniques and applications.</a> Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).</li><li>Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemically+induced+changes+of+PtdIns(4,5)P2+gate+KCNQ+ion+channels.">Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels.</a> Science. 314, 1454-1457 (2006).</li><li>Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapidly+inducible+changes+in+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate+levels+influence+multiple+regulatory+functions+of+the+lipid+in+intact+living+cells.">Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells.</a> J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

תיארנו טכניקה המשתמשת רומן בכלוב המתחם יחד עם מערכת FKBP-FRB heterodimerization כדי לתפעל פעילות Rho GTPase במיקום subcellular מדויק בקנה מידה זמן של שניות. יש שלוש מגבלות הגישה הנוכחית. ראשית, כי השיטה מבוססת על מניעת או לאפשר דיפוזיה של dimerizer דרך הממב?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Rapamycin </td><td> Tecoland </td><td> RAPA99 </td></tr><tr><td> FuGENE HD </td><td> רוש </td><td> 04709691001 </td></tr><tr><td> Avidin </td><td> סיגמא </td><td> A9275-10 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> סיגמא </td><td> D2650-5X5ML </td></tr><tr><td> גודל הדרה עמודה </td><td> GE Healthcare </td><td> ספין מלכודת G-25 </td></tr><tr><td> תחתית זכוכית 8-גם קאמרית </td><td> Thermo Scientific </td><td> 12-565-47 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert200M </td></tr><tr><td> UV-LED כמקור אור </td><td> ראפ Opto אלקטרוניקה </td><td> UVILED </td></tr><tr><td> דיסק מסתובב confocal </td><td> Yokogawa החשמל </td><td> CSU10 </td></tr><tr><td> מצלמת CCD </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> ORCA-ER </td></tr><tr><td> העדשה המטרה 100x </td><td> Zeiss </td><td> תוכנית Apochromat </td></tr></tbody></table> תוכנית סינתטית של CRB (כל הזכויות שמורות ACS2011) 6 <a href="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1.jpg" alt="תוכנית 1" /></a> תנאי סינתטיים: (א) BnBr, K 2 CO 3, DMF (ב) f.HNO 3, AcOH (ג) TFA (ד) Propargyl-BR, K 2 CO 3, DMF, (ה), חתול גליצרול. pTsA, טולואן (ו) CN 3 NaBH, TiCl 4, MeCN (ז) TF 2 O, Pyridin (ח) מתנול HCl, (אני) LiAlH 4, THF (י) TsCl, פירידין, CH 2 Cl 2 (k) NaN 3, DMF (L) 8, 2,6-di-t-butylpyridine, CH 2 Cl 2 (מ) 13, CuSO 4, ascorbate, 2-propanol, H 2 O, CH 2 Cl 2.

spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells

ויסות דינאמי של משפחת רו של triphosphatases guanosine קטנים (GTPases) עם דיוק רב spatiotemporal חיוני לתיפקוד התאי ואירועים שונים 1, 2. הדינאמיות spatiotemporally שלהם נחשף על ידי הדמיה של פעילות שלהם לוקליזציה ב 3 בזמן אמת. על מנת לקבל הבנה עמוקה יותר של תפקידם תפקודים תאיים שונים ברמה המולקולרית, הצעד הבא צריך להיות הפרעה של פעילות חלבון במקום העיתוי subcellular מדויק. כדי להשיג מטרה זו, פיתחנו שיטה קלה הנגרמת, spatio-temporally הפעלה מבוקרת של GTPases קטנות על ידי שילוב של שתי טכניקות: (1) rapamycin הנגרמת FKBP-FRB heterodimerization ו (2) שיטת צילום caging של rapamycin. עם השימוש heterodimerization FKBP-FRB rapamycin בתיווך, פיתחנו שיטה מהירה מושרה ההפעלה או איון של קטן GTPases including RAC 4, 4 Cdc42, RhoA 4 ו 5 ראס, שבו rapamycin גורם טרנסלוקציה של FKBP-התמזגו GTPases או activators שלהם, קרום הפלזמה שבו FRB מעוגן. עבור צימוד עם מערכת זו heterodimerization, פיתחנו גם מערכת צילום caging של אנלוגים rapamycin. מתחם צילום בכלוב היא מולקולה כימית קטנה, אשר הפעילות מדוכאת עם קבוצת הגנה photocleavable הידועה כקבוצה caging. כדי לדכא את פעילות heterodimerization לחלוטין, עיצבנו rapamycin בכלוב כי הוא קשור מקרומולקולה כך מורכבת גדול וכתוצאה מכך אינו יכול לחצות את הממברנה הפלסמטית, המוביל פעילות כמעט ללא רקע כמו dimerizer כימי בתוך התאים 6. איור 1 מדגים התוכנית שלנו המערכת. עם שילוב של שתי מערכות אלו, אנו מקומי גייס activator RAC קרום הפלזמה על זמנים של שניות והשיג אור הנגרמת ההפעלה RAC על לב subcellularאל 6.

Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells at JoVE.com

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

שיטה לשליטה במרחב ובזמן פעילות GTPase קטן לאור המתואר. שיטה זו מבוססת על heterodimerization FKBP-FRB rapamycin הנגרמת צילום-caging מערכות. אופטימיזציה של הקרנת אור מאפשר הפעלה מבוקרת spatio-temporally של GTPases קטנים ברמה subcellular.

במרחב ובזמן מניפולציה של פעילות GTPase קטן ברמת subcellular ועל לוח זמנים של שניות בתאים חיים

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

spatio-temporal-manipulation-small-gtpase-activity-at-subcellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.7K Views.  Johns Hopkins University. שיטה לשליטה במרחב ובזמן פעילות GTPase קטן לאור המתואר. שיטה זו מבוססת על heterodimerization FKBP-FRB rapamycin הנגרמת צילום-caging מערכות. אופטימיזציה של הקרנת אור מאפשר הפעלה מבוקרת spatio-temporally של GTPases קטנים ברמה subcellular.

Video: Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

חיים דימות פלואורסצנטי של הרוטורים מולקולרית בתאים חיים

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological states of islet hypoxia, especially in transplant environments. Standard hypoxic chamber techniques cannot modulate both stimulations at the same time nor provide real-time monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors. To address these difficulties, we applied a multilayered microfluidic technique to integrate both aqueous and gas phase modulations via a diffusion membrane. This creates a stimulation sandwich around the microscaled islets within the transparent polydimethylsiloxane (PDMS) device, enabling monitoring of the aforementioned coupling factors via fluorescence microscopy. Additionally, the gas input is controlled by a pair of microdispensers, providing quantitative, sub-minute modulations of oxygen between 0-21%. This intermittent hypoxia is applied to investigate a new phenomenon of islet preconditioning. Moreover, armed with multimodal microscopy, we were able to look at detailed calcium and KATP channel dynamics during these hypoxic events. We envision microfluidic hypoxia, especially this simultaneous dual phase technique, as a valuable tool in studying islets as well as many ex vivo tissues.

Microfluidic oxygen control confers more than just convenience and speed over hypoxic chambers for biological experiments. Especially when implemented via diffusion through a membrane, microfluidic oxygen can provide simultaneous liquid and gas phase modulations at the microscale-level. This technique enables dynamic multi-parametric experiments critical for studying islet pathophysiology.

בקרה כמותי וזמנית של Microenvironment חמצן ברמה יחיד Islet

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

בידוד של תאי גידול במעי גס אנושיים ראשוניים מרקמות כירורגי וCulturing אותם ישירות על מצעים אלסטיים רכים לגרירה Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

שליטה אופטית של תאי חיים פעילות חשמלית על ידי פולימרים מצומדות

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

עמית תרבות Microbiome חי עם Microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

בידוד של גזע Mesenchymal מן האדם קרום העצם מכתשיים ואפקטים של ויטמין D על פעילות Osteogenic של תאים נגזר קרום העצם

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

מדידה של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים באמצעות שילוב של טכניקות פלורסנט

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

הקמת הגיאומטריה של האדם תא גזע עובריים המושבות על מצעים תואמי כדי לשלוט במכניקה ברמת רקמות

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...