Este estudo foi financiado pelo NIH o financiamento da investigação (DK090868 e GM092930 de TI). Existe uma patente pendente sobre um análogo rapamicina enjaulado.

1. A transfecção de DNA de plasmídeo <ol><li> Adicionar DNAs plasmídicos, 0,5 ug FRB membrana amarrado (daqui em diante referido como LDR) e 0,5 ug FKBP-Tiam1 (T-cell lymphoma invasão e metástase indutora de proteína 1: Rac activador) marcado com proteína fluorescente para 37,5 uL dH 2 O. Adicionar 1 ml FuGENE HD. </li><li> Vortex e incube à temperatura ambiente durante 20 minutos. Enquanto isso, vá para as etapas 1,3-1,8. </li><li> Lava-se cada poço de uma câmara de 8-bem com 50 uL de poli-D-lisina. </li><li> Lavar o centro de cada poço com dH 2 O. </li><li> Trypsinize 80-85% confluentes células NIH-3T3 e diluir até 10 mL meio de cultura (DMEM com FBS 10%). </li><li> Remover 375 ul de suspensão e centrifugar a 1750 rpm durante 3 minutos. </li><li> Aspirar a mídia, tomando cuidado para não perturbar o sedimento. </li><li> Adicionar 750 ul de DMEM FBS w / 10% e ressuspender. </li><li> Adicionar suspensão de células de dH 2 O / DNA / solução FuGENE HD e misture delicadamente. </li><li> Adicionar 250ul de célula / DNA suspensão a cada poço (irá preencher até 3 poços). </li><li> Incubar as células transfectadas a 37 ° C e 5% de CO2 durante 15-18 hr. </li></ol> 2. Preparação de crb-se uma solução <ol><li> Sintetizar enjaulado aduto rapamicina-biotina (CRB). Consulte &quot;esquema sintético do crb&quot; para detalhes. Resumidamente, porções enjaulamento e biotina são preparados separadamente. A porção de encarceramento é então conjugado de rapamicina (LC laboratório), o produto subsequentemente acoplado à porção de biotina por um meio de reacção clique 7 para se obter CRB. </li><li> Preparar uma solução-mãe 1 mM de crb em DMSO. </li><li> Dissolve-se avidina 1mg em 250 ul de PBS em um tubo Eppendorf 0,5 ml. </li><li> Adicionar 1 ml de solução estoque para crb avidina dissolvido. Misturar invertendo várias vezes. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 15 min para se obter CRB-avidina conjugada (CRB-A) De solução. </li><li> Excluir pequenas moléculas não ligadas e purificar CRB-A. Utilizando uma coluna de exclusão de tamanho </li></ol> 3. Microscopia e Iluminação Luz em nível subcelular <ol><li> Soro fome células transfectadas em DMEM sem FBS durante 12 horas. </li><li> Aspirar cuidadosamente os meios de comunicação fora das células e adicionar 250 uL da nM 400 preparada CRB-se uma solução (a partir do passo 2.6). </li><li> Para visualizar dinâmica de proteínas em células vivas em resolução subcelular antes e após tratamento com luz, microscopia de disco giratório foi utilizado (Figura 2a). Iluminação UV foi conseguida por acoplamento óptica para luz do LED UV (365 nm) com epi-fluorescência de luz (Figura 2b). </li><li> MetaMorph software foi usado para capturar imagens de fluorescência de células transfectadas a cada 15 segundos. </li><li> Definir as coordenadas e tamanho de um ponto de iluminação usando uma placa de vidro revestida com corantes fluorescentes excitadas pela luz UV. O tamanho podeser variado através da aplicação de lente objectiva com ampliações diferentes e seleccionando as fibras ópticas com tamanho do núcleo diferente. </li><li> Após a determinação dos níveis de fundo de luz membrana ruffling UV, irradiam na periferia das células. Os dois passos seguintes são para contrastar anterior efeitos localizados. </li><li> Globalmente irradiar as células com luz de 365 nm fornecida por uma lâmpada de mercúrio. </li><li> Dissolver uncaged, assim rapamicina original em DMSO e em seguida em PBS (400 nM final), e adicionar a solução para a câmara de imagem para induzir efeitos globais. </li></ol> 4. Os resultados representativos Um exemplo de resultados representativos é mostrado na Figura 3. Irradiação com luz UV a uma pequena região perto de uma aresta celular rapidamente induzida a formação de zonas plissados ​​apenas na e próximo da área irradiada. Para confirmar que esta era de fato a atividade local, em seguida, globalmente irradiados células com UV, ou adicionado a rapamicina para os meios de comunicação em massa, tanto de which induziram a formação ruffle global ao longo da membrana. Para uma análise quantitativa, as células alvo dividida em quatro quadrantes, e contados a frequência de formação de plissado em cada quadrante sobre local, bem como após a estimulação global sob várias condições, incluindo os controlos (Figura 4). É apenas esta combinação de irradiação UV, CRB-A, e adequados FKBP-FRB construções que induz ruffling local. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática da dimerização de proteínas espacialmente confinado usando gaiolas rapamicina-avidina conjugada (CRB-A) e luz UV. Irradiação UV cliva o ligante entre rapamicina e biotina, resultando na libertação de química dimerizer (HE-Rapa, C40-O-(2-hidroxietil) rapamicina) e do seu sub-produto. O dimerizer liberado em seguida, difunde para as células e induz a dimerização entre FKBP-POI (proteína de interesse) e memb plasmarane ancorado FRB apenas na proximidade da região irradiada (círculo azul). Sem a irradiação UV, FKBP e FRB não associado (cruz vermelha), portanto, não produzindo efeito. (Copyright @ ACS2011) 6 <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig2.jpg" /> Figura 2. Imagem do microscópio confocal personalização de fluorescência. (A) Vista frontal do microscópio confocal (invertido Axiovert 200, Zeiss). (B) Close-up vista, topo de uma unidade de acoplamento de EPI fluorescência e iluminação UV. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig3.jpg" /> Figura 3. Formação plissado espacialmente confinado numa célula NIH3T3 transfectadas induzida por irradiação UV localizada. Confocal imagens de fluorescência de uma célula de fibroblastos NIH3T3 que é transfectada com YFP-marcado FKBP-Tiam1 (Rac ativador) e LDR (membrana ancoradas FRB) foram submetidos à irradiação em uma área restrita perto de sua borda com LED luz a 365 nm durante 15 seg 210 seg a partir de, na presença de CRB-Um conjugado nos meios de comunicação a granel. Este tratamento foi seguido de iluminação global com lâmpada de mercúrio durante 1 seg a 1063 adição seg e global de rapamicina finais 400 nM em 1560 seg. A célula mostrou quase nenhuma atividade despenteando no início (a), mas mostrou espacialmente confinado despenteando após a iluminação localizada (círculo amarelo) (b). A célula mostrou a formação plissado global após iluminação global e adição de rapamicina (cd), indicando que a formação de plissado local foi causada por activação espacialmente confinado de rac. Barra de escala: 10 um. (Copyright @ ACS2011) 6 <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig4.jpg" /> Figura 4. Frequência de formação de plissado em quadrantes de transfectadas células NIH3T3. Irradiação UV local com CRB-A e irradiação UV seguinte global foram realizados em 13 células. CRB-A </sTrong&gt; adição (sem irradiação de UV), irradiação UV local com ou sem avidina foram aplicadas sobre as células 13, 5 e 6, respectivamente. Nenhuma das células observados mostrou a formação de plissado com CRB-A, sem irradiação de UV, ou irradiação de UV local com ou sem avidina em meios a granel. Foram colhidos dados a partir de células com baixa formação de fundo plissado, mas que tinha a capacidade de rapamicina induzida por formação de plissado, que verificada após cada experiência, confirmando a formação de plissado global como um resultado da adição de rapamicina (finais 400 nM). Estes resultados mostraram que CRB-A e irradiação UV local são necessários para a formação plissado local nas células. (Copyright @ ACS2011) 6 Abreviaturas: FKBP: FK506-binding protein FRB: FKBP-rapamicina-binding protein Tiam1: T-cell lymphoma invasão e metástase indutor de proteína 1 (Rac GEF) LDR: Lyn-DSAG ligante-FRB (Lyn: N-terminal 11 aminoácidos da Lyn quinase) HE-Rapa: C40-O - (2-hidroxietil) rapamicina crb: rapamicina enjaulado com porção biotina CRB-A: crb conjugada com avidina

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	<li>Etienne-Manneville, S., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+in+cell+biology.">Rho GTPases in cell biology.</a> Nature. 420, 629-635 (2002).</li><li>Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTP-binding+proteins.">Small GTP-binding proteins.</a> Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).</li><li>Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+regulation+of+small+GTPases+as+revealed+by+probes+based+on+the+principle+of+Forster+Resonance+Energy+Transfer+(FRET):+Implications+for+signaling+and+pharmacology.">Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).</li><li>Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+translocation+strategy+to+rapidly+activate+and+inhibit+small+GTPase+signaling+pathways.">An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways.</a> Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).</li><li>Komatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific,+rapid+induction+of+molecular+activities+and+membrane+tethering.">Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering.</a> Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).</li><li>Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photocleavable+rapamycin+conjugate+for+spatiotemporal+control+of+small+GTPase+activity.">A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity.</a> J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).</li><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry:+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions.">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li><li>Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells.">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li><li>Wu, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li><li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light.">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).</li><li>Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+controlled+protein+assembly:+techniques+and+applications.">Chemically controlled protein assembly: techniques and applications.</a> Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).</li><li>Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemically+induced+changes+of+PtdIns(4,5)P2+gate+KCNQ+ion+channels.">Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels.</a> Science. 314, 1454-1457 (2006).</li><li>Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapidly+inducible+changes+in+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate+levels+influence+multiple+regulatory+functions+of+the+lipid+in+intact+living+cells.">Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells.</a> J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos uma técnica que utiliza um novo composto engaiolados em conjunto com o sistema de heterodimerização FKBP-FRB, a fim de manipular Rho actividade GTPase a uma localização precisa subcelular numa escala de tempo de segundos. Há três limitações da presente abordagem. Em primeiro lugar, porque o método baseia-se na prevenção ou permitindo a difusão de dimerizer através da membrana plasmática, a localização do alvo celular necessita de ser membrana plasmática ou ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Rapamicina </td><td> Tecoland </td><td> RAPA99 </td></tr><tr><td> FuGENE HD </td><td> Roche </td><td> 04709691001 </td></tr><tr><td> Avidina </td><td> Sigma </td><td> A9275-10MG </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650-5X5ML </td></tr><tr><td> Coluna de exclusão de tamanho </td><td> GE Healthcare </td><td> Giro Armadilha G-25 </td></tr><tr><td> Com fundo de vidro câmara de 8-bem </td><td> Thermo Scientific </td><td> 12-565-47 </td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência invertido </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert200M </td></tr><tr><td> UV fonte de luz LED </td><td> Rapp Opto Eletrônica </td><td> UVILED </td></tr><tr><td> Disco giratório Confocal </td><td> Yokogawa Electric Corp </td><td> CSU10 </td></tr><tr><td> CCD da câmera </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> ORCA-ER </td></tr><tr><td> Da Objectiva 100x </td><td> Zeiss </td><td> Apochromat Plano </td></tr></tbody></table> Esquema sintético do crb (Copyright ACS2011) 6 <a href="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1.jpg" alt="Esquema 1" /></a> Condições sintéticas: (a) BnBr, K 2 CO 3, DMF (b) f.HNO 3, AcOH (c) TFA (d) propargil-Br, K 2 CO 3, DMF, (e) gato glicerol,. PTSA, tolueno (f) NaBH3CN, TiCl4, MeCN (g) Tf 2 O, piridin (h) de metanol HCl, (i) LiAlH 4, THF (j) TsCl, piridina, CH 2 Cl 2 (k) NaN 3, DMF (l) 8, 2,6-di-t-butilpiridina, 2 CH Cl 2 (m) 13, CuSO4, ascorbato, 2-propanol, H2O, CH 2 Cl 2.

spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells

Regulação dinâmica da família Rho de trifosfatases guanosina pequenas (GTPases) com precisão espaço-temporal grande é essencial para várias funções celulares e eventos 1, 2. A sua natureza dinâmica spatiotemporally foi revelada pela visualização da sua actividade e localização em tempo real 3. A fim de obter uma compreensão mais profunda dos seus papéis em diversas funções celulares a nível molecular, o próximo passo deve ser perturbação das actividades de proteína a uma localização precisa subcelular e de temporização. Para atingir este objectivo, desenvolvemos um método para a induzida pela luz, num espaço-temporal activação controlada de GTPases pequenas pela combinação de duas técnicas: (1) rapamicina induzida heterodimerização FKBP-FRB e (2) um método de foto-enjaulamento de rapamicina. Com o uso de rapamicina mediada heterodimerização FKBP FRB-, desenvolvemos um método para rapidamente induzível activação ou inactivação de pequeno GTPases including Rac 4, Cdc42 4, RhoA 4 e 5 Ras, em que a rapamicina induz a translocação de FKBP-fundidos GTPases, ou os seus activadores, para a membrana plasmática, onde está ancorada FRB. Para o acoplamento com o presente sistema de heterodimerização, também desenvolvido um sistema foto-enjaulamento de análogos de rapamicina. Um composto de foto-engaiolados é uma molécula pequena, cuja actividade é suprimida com um grupo fotocliváveis ​​proteger conhecido como um grupo de encarceramento. Para suprimir a actividade heterodimerização completamente, foi elaborado um rapamicina engaiolados que está preso a uma macromolécula tal que o complexo resultante grande não pode atravessar a membrana plasmática, levando a virtualmente nenhum fundo actividade como um dimerizer química no interior das células 6. A Figura 1 ilustra um esquema do nosso sistema. Com a combinação destes dois sistemas, é localmente recrutado um activador Rac para a membrana plasmática num espaço de tempo de segundos, e conseguido induzida pela luz de activação Rac no lev subcelularel 6.

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Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Um método para espácio-temporal controlo da actividade GTPase pequena pela luz é descrito. Este método baseia-se em rapamicina induzida heterodimerização FKBP-FRB e foto-enjaulamento sistemas. Otimização de luz irradiação permite a ativação espaço-temporalmente controlada de pequenas GTPases no nível subcelular.

Espaço-Temporal Manipulação de Atividade GTPase Pequeno em nível subcelular e em escala de tempo de segundos em células vivas

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

spatio-temporal-manipulation-small-gtpase-activity-at-subcellular

Research

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Bioengineering

10.7K visualizações.  Johns Hopkins University. Um método para espácio-temporal controlo da actividade GTPase pequena pela luz é descrito. Este método baseia-se em rapamicina induzida heterodimerização FKBP-FRB e foto-enjaulamento sistemas. Otimização de luz irradiação permite a ativação espaço-temporalmente controlada de pequenas GTPases no nível subcelular.