وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة تمويل بحوث (DK090868 وGM092930 إلى TI). هناك براءة اختراع معلقة على التناظرية rapamycin في قفص.

1. ترنسفكأيشن من البلازميد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة السلطات الوطنية المعينة بلازميد، 0.5 ميكروغرام غشاء المربوطة FRB (المشار إليه فيما LDR) و 0.5 ميكروغرام FKBP-Tiam1 (T-سرطان الغدد الليمفاوية الخلية الغزو والانبثاث الذي يحفز البروتين 1: طلب المنشط) الموسومة ب بروتين فلوري إلى 37.5 ميكرولتر O. 2 درهم إضافة 1 ميكروليتر FuGENE HD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. في هذه الأثناء، انتقل إلى خطوات 1،3-1،8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل كل بئر من غرفة 8-جيدا مع 50 ميكرولتر بولي ليسين-D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل مركز كل جيدا مع DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين 80-85٪ متكدسة المعاهد الوطنية للصحة، 3T3 الخلايا وتضعف إلى 10 مل الثقافة المتوسطة (DMEM مع FBS 10٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 375 ميكرولتر من التعليق والطرد المركزي في 1750 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في وسائل الإعلام، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 750 ميكرولتر من FBS DMEM ث / 10٪ وresuspend. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة تعليق إلى خلية درهم 2 O / DNA / FuGENE حل HD وتخلط بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250ميكرولتر من خلية / الحمض النووي تعليق على كل بئر (سوف تملأ ما يصل الى 3 آبار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا transfected عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 ل15-18 ساعة. </li></ol> 2. إعداد CRB-الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليف في قفص rapamycin-البيوتين معقد إضافي (CRB). انظر &quot;مخطط الاصطناعية من CRB&quot; للحصول على التفاصيل. لفترة وجيزة، على استعداد الحبس والبيوتين الأنصاف بشكل منفصل. شاردة الحبس بعد ذلك مترافق إلى rapamycin (LC مختبر)، والمنتج بالإضافة إلى وقت لاحق على شاردة من البيوتين بواسطة وسيلة للتفاعل فوق 7 إلى تحمل CRB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد الأوراق المالية 1 ميكرومتر حل CRB في DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل أفيدين 1mg في 250 ميكروليتر من PBS في أنبوب 0،5 مل إيبندورف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر من محلول المخزون CRB أفيدين إلى حل. مزيج من قبل عدة مرات قلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ليحقق CRB-أفيدين المتقارن (CRB-A) حل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبعاد جزيئات صغيرة غير منضم وتنقية CRB-A. باستخدام عمود الحجم الاستبعاد </li></ol> 3. المجهري والإضاءة الخفيفة على المستوى التحت خلوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مصل تجويع الخلايا transfected في DMEM بدون FBS لمدة 12 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بلطف وسائل الإعلام خارج الخلايا وإضافة 250 ميكرولتر من 400 نانومتر استعدادا CRB-A حل (من الخطوة 2.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور ديناميات البروتين في الخلايا الحية في قرار التحت خلوية قبل وبعد العلاج ضوء، تم استخدام المجهر الغزل القرص (الشكل 2A). وقد تحقق إضاءة الأشعة فوق البنفسجية من قبل اقتران البصريات للأشعة فوق البنفسجية ضوء الصمام (365 نانومتر) مع برنامج التحصين الموسع ومضان ضوء (الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد استخدم MetaMorph البرمجيات لالتقاط الصور مضان من الخلايا transfected كل 15 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد إحداثيات وحجم بقعة الإضاءة باستخدام لوحة من الزجاج المطلي مع الأصباغ الفلورية ولع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. يمكن أن حجمأن تختلف عن طريق تطبيق عدسة تكبير الهدف مع مختلف وبتحديد الألياف البصرية مع حجم الأساسية المختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تحديد مستويات أساسية من الإزعاج غشاء، أشرق ضوء الأشعة فوق البنفسجية في محيط الخلايا. التاليين الخطوات هي على النقيض السابقة الآثار المحلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أشرق على الصعيد العالمي مع خلايا ضوء 365 نانومتر المقدمة من مصباح الزئبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل uncaged، وبالتالي rapamycin الأصلي في DMSO ومن ثم في برنامج تلفزيوني (400 نيوتن متر نهائي)، وإضافة إلى حل للغرفة التصوير للحث على الآثار العالمية. </li></ol> 4. ممثل النتائج ويرد مثال على نتائج ممثل في الشكل (3). الأشعة فوق البنفسجية أشعة الضوء في منطقة صغيرة بالقرب من حافة الخلوية التي يسببها بسرعة تشكيل المترجمة الكشكشة فقط في وبالقرب من منطقة المشع. لتأكيد أن هذا هو في الواقع نشاط محلي، ونحن بعد ذلك المشع على الصعيد العالمي مع خلايا للأشعة فوق البنفسجية، أو إضافة rapamycin إلى وسائل الإعلام بالجملة، وكلا من مبادرة الخوذ البيضاءالفصل العالمية الناجمة تشكيل كشكش في جميع أنحاء غشاء. عن التحليل الكمي، وتنقسم نحن الخلايا المستهدفة إلى أربعة أجزاء، وعدها وتيرة تشكيل كشكش في كل رباعي على المحلية، وكذلك في أعقاب التحفيز العالمية في ظل ظروف مختلفة بما في ذلك الضوابط (الشكل 4). أنها ليست سوى هذا المزيج من الأشعة فوق البنفسجية، CRB-A، ومناسبة FKBP-FRB بنيات الذي يسبب الإزعاج المحلية. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig1.jpg" /> الشكل 1. تخطيطي من dimerization بروتين تقتصر مكانيا باستخدام قفص rapamycin-أفيدين المتقارن (CRB-A) والأشعة فوق البنفسجية. اشعة فوق البنفسجية يشق رابط بين rapamycin والبيوتين، مما أدى إلى الإفراج عن dimerizer الكيميائية (سعادة، رابا، C40-O-(2-هيدروكسي إيثيل) rapamycin)، ولها من قبل المنتج. وdimerizer سراح ينشر بعد ذلك في الخلايا ويؤدي dimerization بين FKBP-البوي (بروتين من الفائدة) وmemb البلازمارست RANE FRB فقط في المناطق القريبة من المنطقة المعرضة للإشعاع (الدائرة الزرقاء). من دون أشعة فوق البنفسجية، وFKBP FRB عدم الربط بين (الصليب الأحمر)، وتنتج بالتالي أي تأثير. (حقوق الطبع والنشر @ ACS2011) 6 <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig2.jpg" /> الشكل 2. صورة من المجهر مخصصة مضان مبائر. (أ) عرض أمامي من المجهر متحد البؤر (مقلوب Axiovert 200، زييس). (ب) عن قرب، رأي كبار من وحدة توصيل لمضان برنامج التحصين الموسع والإضاءة فوق البنفسجية. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig3.jpg" /> الشكل 3. تشكيل كشكش تقتصر مكانيا في زنزانة NIH3T3 transfected الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية المترجمة. وخضع الصور مضان مبائر خلية الليفية NIH3T3 التي يتم transfected مع YFP الموسومة FKBP-Tiam1 (RAC المنشط) وLDR (غشاء الراسية FRB) إشعاع في منطقة مغلقة بالقرب من حافته مع Lالضعف الجنسي في ضوء 365 نيوتن متر لمدة 15 ثانية ابتداء من الساعة الثانية 210 في وجود CRB-المتقارن في وسائل الإعلام الجزء الأكبر. وأعقب هذا العلاج بواسطة الإضاءة العالمية مع مصباح الزئبق في 1 ثانية في إضافة ثانية والعالمية 1063 نيوتن متر من rapamycin 400 في نهائي 1560 في الثانية. وأظهرت خلية تقريبا أي نشاط الإزعاج في بداية (أ) لكنه أظهر تقتصر مكانيا الإزعاج بعد إضاءة مترجم (دائرة صفراء) (ب). وأظهرت الخلية عالمي تشكيل كشكش بعد الإضاءة العالمية، وبالإضافة إلى ذلك من rapamycin (CD)، مشيرا إلى أن السبب في تشكيل كشكش المحلية عن طريق تفعيل تقتصر مكانيا من طلب. شريط الحجم: 10 ميكرون. (حقوق الطبع والنشر @ ACS2011) 6 <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig4.jpg" /> الشكل 4. تردد من تشكيل كشكش في الأرباع من الخلايا NIH3T3 transfected. المحلية للاشعة فوق البنفسجية مع CRB-A تم تنفيذها والتالية للاشعة فوق البنفسجية العالمي في 13 الخلايا. CRB-A </sترونج&gt; بالإضافة إلى ذلك (لا توجد أشعة فوق البنفسجية)، ونفذت المحلية للاشعة فوق البنفسجية مع أو بدون أفيدين على خلايا 13، 5 و 6، على التوالي. لم يظهر أي من الخلايا المرصودة تشكيل كشكش مع CRB-A من دون أشعة فوق البنفسجية، أو الأشعة فوق البنفسجية المحلية مع أو بدون أفيدين في وسائل الإعلام الجزء الأكبر. جمعنا البيانات من الخلايا مع انخفاض خلفية تشكيل كشكش لكن التي لديها القدرة على تشكيل كشكش rapamycin التي يسببها، والتي دققت نحن بعد كل تجربة من خلال التأكد عالمي تشكيل كشكش نتيجة لإضافة rapamycin (نهائي 400 نيوتن متر). وأظهرت هذه النتائج أن CRB-A والمحلية للاشعة فوق البنفسجية ضرورية لتشكيل كشكش المحلية في الخلايا. (حقوق الطبع والنشر @ ACS2011) 6 الاختصارات: FKBP: FK506 ملزم بروتين FRB: FKBP-rapamycin ملزم بروتين Tiam1: تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية الغزو والانبثاث الذي يحفز بروتين 1 (RAC GEF) LDR: لين، DSAG رابط، FRB (لين: N-11 محطة من الأحماض الأمينية كيناز لين) سعادة ورابا: C40-O - (2-هيدروكسي إيثيل) rapamycin CRB: rapamycin في قفص مع شاردة البيوتين CRB-A: CRB مترافق إلى أفيدين

<ol>
	<li>Etienne-Manneville, S., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+in+cell+biology.">Rho GTPases in cell biology.</a> Nature. 420, 629-635 (2002).</li><li>Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTP-binding+proteins.">Small GTP-binding proteins.</a> Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).</li><li>Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+regulation+of+small+GTPases+as+revealed+by+probes+based+on+the+principle+of+Forster+Resonance+Energy+Transfer+(FRET):+Implications+for+signaling+and+pharmacology.">Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).</li><li>Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+translocation+strategy+to+rapidly+activate+and+inhibit+small+GTPase+signaling+pathways.">An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways.</a> Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).</li><li>Komatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific,+rapid+induction+of+molecular+activities+and+membrane+tethering.">Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering.</a> Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).</li><li>Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photocleavable+rapamycin+conjugate+for+spatiotemporal+control+of+small+GTPase+activity.">A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity.</a> J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).</li><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry:+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions.">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li><li>Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells.">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li><li>Wu, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li><li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light.">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).</li><li>Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+controlled+protein+assembly:+techniques+and+applications.">Chemically controlled protein assembly: techniques and applications.</a> Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).</li><li>Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemically+induced+changes+of+PtdIns(4,5)P2+gate+KCNQ+ion+channels.">Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels.</a> Science. 314, 1454-1457 (2006).</li><li>Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapidly+inducible+changes+in+phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate+levels+influence+multiple+regulatory+functions+of+the+lipid+in+intact+living+cells.">Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells.</a> J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ووصف لدينا التقنية التي توظف رواية قفص مركب جنبا إلى جنب مع نظام heterodimerization FKBP-FRB من أجل التعامل مع رو GTPase النشاط في مكان وجود التحت خلوية دقيق على نطاق ومرة ​​ثانية. هناك ثلاثة أوجه القصور في النهج الحالي. أولا، لأنه يعتمد الأسلوب...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف / معدات </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> Rapamycin </td><td> Tecoland </td><td> RAPA99 </td></tr><tr><td> FuGENE HD </td><td> روش </td><td> 04709691001 </td></tr><tr><td> أفيدين </td><td> سيغما </td><td> A9275-10MG </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> سيغما </td><td> D2650-5X5ML </td></tr><tr><td> الحجم استبعاد عمود </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> تدور فخ G-25 </td></tr><tr><td> زجاج أسفل 8-جيدا غرفة </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 12-565-47 </td></tr><tr><td> الإسفار المجهر المقلوب </td><td> زييس </td><td> Axiovert200M </td></tr><tr><td> الصمام الأشعة فوق البنفسجية مصدر للضوء </td><td> راب علم البصريات إلكترونيات </td><td> UVILED </td></tr><tr><td> الغزل قرص مبائر </td><td> يوكوجاوا الكتريك كورب </td><td> CSU10 </td></tr><tr><td> كاميرا CCD </td><td> هاماماتسو الضوئيات </td><td> ORCA-ER </td></tr><tr><td> الهدف عدسة 100X </td><td> زييس </td><td> خطة لامزيغ </td></tr></tbody></table> الاصطناعية مخطط CRB (حقوق الطبع والنشر ACS2011) 6 <a href="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1.jpg" alt="مخطط 1" /></a> الاصطناعية الشروط: (أ) BnBr، K 2 CO 3، DMF (ب) f.HNO 3، AcOH (ج) TFA (د) Propargyl-BR، K 2 CO 3، DMF، (ه) والجلسرين والقط. pTsA، التولوين (و) NABH 3 CN، TiCl 4، MeCN (ز) TF 2 O، Pyridin (ح) وحمض الهيدروكلوريك والميثانول، (ط) LiAlH 4، THF (ي) TsCl، بيريدين، CH 2 كلور 2 (ك) نان 3، DMF (ل) 8، 2،6-DI-T-butylpyridine، CH 2 كلور 2 (م) 13، CUSO 4، أسكوربات، 2 بروبانول، H 2 O، CH 2 كلور 2.

spatio-temporal manipulation of small gtpase activity at subcellular level and on timescale of seconds in living cells

تنظيم دينامية الأسرة رو من triphosphatases فسفات الصغيرة (GTPases) مع الدقة المكانية كبير أمر ضروري للوظائف الخلوية المختلفة والمناسبات 1 و 2. وقد كشفت عن طبيعتها الديناميكية spatiotemporally التي تصور من نشاطهم والتوطين في 3 في الوقت الحقيقي. من اجل الحصول على فهم أعمق لدورهم في الوظائف الخلوية المختلفة على المستوى الجزيئي، ينبغي أن تكون الخطوة التالية اضطراب الأنشطة في مكان وجود بروتين التحت خلوية دقيقة وتوقيت. لتحقيق هذا الهدف، قمنا بتطوير طريقة لصنع ضوء، المكانية والزمان تفعيل رقابة من GTPases الصغيرة من خلال الجمع بين اثنين من التقنيات: (1) rapamycin التي يسببها FKBP-FRB heterodimerization و (2) طريقة الصور والحبس من rapamycin. مع استخدام heterodimerization FKBP-FRB rapamycin بوساطة، وقد طورنا طريقة لقابل للتحريض بسرعة تفعيل أو تعطيل من includi GTPases صغيرنانوغرام RAC 4، Cdc42 4، 4 ورأس RhoA 5، الذي يدفع rapamycin إزفاء من FKBP-تنصهر GTPases، أو تفعيل لها، إلى غشاء البلازما حيث يرتكز FRB. لاقتران مع هذا النظام heterodimerization، وضعنا أيضا نظام الصور والحبس من rapamycin النظير. مجمع الصور في قفص هو جزيء صغير النشاط الذي يتم قمع مع مجموعة photocleavable حماية المعروفة باسم مجموعة الحبس. لقمع نشاط heterodimerization تماما، قمنا بتصميم rapamycin قفص التي يتم مربوط الى جزيء مثل هذا المجمع الناتج كبير لا يستطيعون عبور غشاء البلازما، مما يؤدي إلى نشاط عمليا خلفية لا بوصفها dimerizer الكيميائية داخل الخلايا 6. ويوضح الشكل 1 مخطط لدينا نظام. مع مزيج من هذين النظامين، ونحن المعينين محليا منشط طلب إلى غشاء البلازما في فترة زمنية من ثانية، وحقق الضوء الناجم عن تفعيل طلب في ليف التحت خلويةش 6.

Watch this Scientific Journal Video about Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells at JoVE.com

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

وصفت طريقة لالمكانية والزمانية السيطرة على نشاط GTPase صغيرة من الضوء. ويستند هذا الأسلوب على heterodimerization FKBP-FRB rapamycin التي يسببها ونظم الصور الحبس. تعظيم الاستفادة من أشعة الضوء تمكن من تفعيل المكانية والزمان التحكم من GTPases الصغيرة على مستوى التحت خلوية.

المكانية والزمانية التلاعب من نشاط GTPase الصغيرة على المستوى التحت خلوية وعلى المقياس الزمني من ثانية في الخلايا الحية

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

spatio-temporal-manipulation-small-gtpase-activity-at-subcellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.7K Views.  Johns Hopkins University. وصفت طريقة لالمكانية والزمانية السيطرة على نشاط GTPase صغيرة من الضوء. ويستند هذا الأسلوب على heterodimerization FKBP-FRB rapamycin التي يسببها ونظم الصور الحبس. تعظيم الاستفادة من أشعة الضوء تمكن من تفعيل المكانية والزمان التحكم من GTPases الصغيرة على مستوى التحت خلوية.

Video: Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

مضان التصوير عمر الدوار الجزيئية في الخلايا الحية

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

قياس الخواص الميكانيكية للخلايا الحية باستخدام المجهر القوة الذرية

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological states of islet hypoxia, especially in transplant environments. Standard hypoxic chamber techniques cannot modulate both stimulations at the same time nor provide real-time monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors. To address these difficulties, we applied a multilayered microfluidic technique to integrate both aqueous and gas phase modulations via a diffusion membrane. This creates a stimulation sandwich around the microscaled islets within the transparent polydimethylsiloxane (PDMS) device, enabling monitoring of the aforementioned coupling factors via fluorescence microscopy. Additionally, the gas input is controlled by a pair of microdispensers, providing quantitative, sub-minute modulations of oxygen between 0-21%. This intermittent hypoxia is applied to investigate a new phenomenon of islet preconditioning. Moreover, armed with multimodal microscopy, we were able to look at detailed calcium and KATP channel dynamics during these hypoxic events. We envision microfluidic hypoxia, especially this simultaneous dual phase technique, as a valuable tool in studying islets as well as many ex vivo tissues.

Microfluidic oxygen control confers more than just convenience and speed over hypoxic chambers for biological experiments. Especially when implemented via diffusion through a membrane, microfluidic oxygen can provide simultaneous liquid and gas phase modulations at the microscale-level. This technique enables dynamic multi-parametric experiments critical for studying islet pathophysiology.

التحكم الكمي والزمني للأكسجين المكروية في جزيرة واحدة المستوى

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

عزل خلايا ورم القولون الإنسان الأساسية من الأنسجة الجراحية وزراعة بشكل مباشر على لينة مرنة ركائز للالجر الخلوي

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

تقنية تسمية خالية لتصوير المكانية والزمانية لإفرازات خلية واحدة

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

مراقبة البصرية من الخلايا الحية النشاط الكهربائي من قبل مترافق البوليمرات

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

شارك في ثقافة المعيشة Microbiome مع المعوية الزوائد Microengineered الإنسان في الوتر على واحد في رقاقة ميكروفلويديك الأجهزة

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من السمحاق السنخية البشرية وآثار فيتامين د على نشاط الخلايا المستمدة من السمحاق أوستيوجينيك

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

قياس ديناميات حساسة لقوة البروتين في الخلايا الحية باستخدام مزيج من التقنيات الفلورسنت

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

زخرفه هندسه مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية علي ركائز متوافقة للتحكم في ميكانيكا مستوي الانسجه

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...