העבודה המתוארת בכתב היד הזה התאפשרה על ידי מימון מקרן פטריק פ טיילור.

1. קציר כרומוזום של תאים חסידים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול סטנדרטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים בהתאם לתנאי culturing התא ספציפיים. כאשר התאים הגיעו שלב לוגריתמים (confluency 80%), להוסיף 10 μl / מיליליטר של Colcemid לבקבוק תרבית תאים. מינימום של 2 x 10 6 תאים מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור במשך 45 דקות. באמצעות פיפטה סטרילית, להעביר מדיה מהתאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. מניח בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את התאים על ידי הוספת 2 מיליליטר של HBSS הצפת לתוך הבקבוק. מערבולת חיץ ולאחר מכן להסיר בעזרת פיפטה. בטל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של טריפסין, מה שמבטיח שהוא מכסה את כל פני השטח של הבקבוק. להשאיר רק את התאים בטריפסין למשך כ -2 דקות. לאחר שרוב התאים יש מנותקים, פיפטה התקשורת בצינור חרוטי חזרה אל התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את ההשעיה התא ב10 aliquots מיליליטר לתוך צינורות חרוטי 15 מיליליטר.צנטריפוגה ב XG 200 10 דקות. הסר supernatant ו resuspend את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של 0.075 M KCl אשר כבר prewarmed ל37 ° C עד גלולה שנותרה בצינור חרוטי. צינור וורטקס במהירות בינונית לערבב KCl ותאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות ב25 ° C. הסר supernatant (עד כ 0.5 מיליליטר שרידים) וגלול resuspend. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף 5 מיליליטר של המקבע של Carnoy הטרי (3:1 יחס של מתנול: חומצה אצטית קרחונית) לתאים תוך vortexing. לאחר מכן להוסיף 5 מיליליטר יותר מקבע בלי vortexing עבור סכום כולל של 10 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 200 למשך 5 דקות. הסרת תאי supernatant ו resuspend. הוסף 5 מיליליטר של מקבע לצינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 200 למשך 5 דקות. הסרת תאי supernatant ו resuspend. הוסף 5 מיליליטר של מקבע לצינור אחד. כעת ניתן לאחסן את התאים ב4 מעלות צלזיוס למשך עד שנה אחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי לפרוטוקול: harvesti כרומוזוםננוגרם של שורות תאי lymphoblastoid <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים בהתאם לתנאי culturing התא ספציפיים. (שימוש בבקבוקון מתאים לכמות של תאים בתרבית). כאשר התאים הגיעו שלב לוגריתמים (כ 2 ימים לאחר התאים מפוצלים), להוסיף 10 μl / מיליליטר של Colcemid לבקבוק תרבית תאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי לפרוטוקול: קצירת כרומוזום מכל דם Phytohemagglutinin (PHA), לקטינים הנגזרים משעועית הכליה האדומה, הוא mitogen עוצמה לתאי T אנושיים 16. 72 שעות לאחר התוספת של PHA לתרבות, על 45% מתאים נמצאים בשלב S. זה מייצג את הפעילות המיטוטי שיא, והוא הנקודה האופטימלית שבו למסוק ללימודי כרומוזום. mitogens אחרת כגון פיטולקה (1-10 מיקרוגרם / מיליליטר) ניתן להשתמש בו בעת ניתוח תאי B 17,18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף לפחות 1 מיליליטר של דם מלא בצינור הפרין סודיום העליון ירוק. השתמש בתוך 3 ימים לאחר גבייה. דם חנות ב RT בלתיtil מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 0.25 מיליליטר של דם מלא ב10 מיליליטר של מדיה מלאה RPMI המכילה L-גלוטמין (20% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, fungizone 1%, וPHA 1%). תרבות על 37 ° C עם 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי לפרוטוקול: קצירת כרומוזום ממח העצם ניתוח ציטוגנטית במח עצם הוא מועיל בפרעות המטולוגיות ממאירות רבות כתצפית של שיבוט chromosomally חריג עשויה להיות אבחון לסוג מסוים של סרטן דם. מחקרי כרומוזום משמשים גם כדי להעריך את התקדמות מחלה, כגון תחילת משבר פיצוץ ותגובה לטיפול. מכיוון שתאי מח העצם באופן פעיל בחלוקה, לא גירוי mitogen הוא 9,19 צורך. לוקמיה חריפה 24 ו48 תרבויות שעה גם להגדיר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף לפחות 1 מיליליטר של מח עצם בצינור הפרין סודיום העליון ירוק. Aliquot 0.25 מיליליטר של מח עצם ב10 מיליליטר של מדיה מלאה RPMI המכילה L-גלוטמין (20% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, fungizone 1%). תרבות על 37 ° C עם 5% CO 2. </li></ol></li></ol> 2. שקופיות הכנה ומכתים מוצק הערכה מהירה של שקופית אחת נציג תספק מידע על איכות היבול לפני שתמשיך להליכים נוספים כגון G-banding, FISH, CGH, או SKY. מעבדות שמעדיפות כתם מוצק התאים לקציר מהיר והערכת כרומוזום. לחלופין, מיקרוסקופ לעומת שלב ניתן להשתמש בניתוח זה. שקופיות מוכנות הטובים ביותר כאשר הלחות היא כ 50% וסביבת הטמפרטורה (20-25 ° C). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות ב25 ° C. הסר את supernatant עד שרק 0.3-0.5 מיליליטר שרידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בעדינות resuspending גלולה, שלוש טיפות פיפטה של ​​ההשעיה התא ממרחק של כ 2 בשקופית אשר נטויה בזווית של כ 45 ° ולאפשר ההשעיהלגלגל על ​​פני השקופית. הוסף טיפה אחת גדולה של המקבע של Carnoy הטרי לשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את הגב של השקופית על מגבת נייר ולאחר מכן לשבת השקופיות לייבוש לפחות 10 דקות. השקופית צריכה להיות יבשה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טרי Giemsa מכתים פתרון (3:1 יחס Gurr הצפת וGiemsa הכתם). מניחים את השקופיות על מדף מכתים. לכסות את השקופית כולה בפתרון מכתים Giemsa. בואו השקופיות יישארו בפתרון מכתים למשך 5 דקות. יש לשטוף את השקופיות עם מים מזוקקים, לטמיון, ולאפשר לאוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 טיפות של Permount ולהחליק את מכסה לשקופית. ודא שאין בועות מתחת coverslip. Permount העודף ניתן להסיר עם מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את התאים עם מיקרוסקופ אור בהגדלה 10X ו100X. אם תאי metaphase נמצאים בשפע וגם התפשטות, השקופיות שנותרו יכולות לשמש לפרוצדורות אחרות. </li></ol> 3. G-Banding באמצעות טריפסין וGiemsa (GTG) &lt;p&gt; טריפסין הוא אנזים פרוטאוליטי הdenatures ההיסטונים euchromatic באזורי DNA עם פעילות תעתיק גבוהה יותר וכתוצאה מכך. בעקבות צביעת Giemsa, אזורים אלה יופיעו כלהקות אור. הכרומטין מרוכז מאוד עם פעילות מועטת או לא תעתיק (heterochromatin) יהיה חלק גדול של ההיסטונים המוגנים מפני טריפסין ולכן כתם כהה הבא מכתים Giemsa. זה חיוני כדי תחילה G-band שקופית אחת כדי לפקח על התנאים ולהתאים את עיתוי טריפסין במידת צורך לשקופיות שלאחר מכן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את הפתרונות הבאים ל4 צנצנות Coplin. # צנצנת 1 = 30 מיליליטר של 1x HBSS ו4 מיליליטר של 10x טריפסין (0.5%) # צנצנת 2 = 50 מיליליטר של 1x HBSS צנצנת # 3 = 45 מיליליטר של 1x HBSS ו5 מיליליטר של סרום שור עוברי # צנצנת 4 = 50 מיליליטר של 1x HBSS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול כל שקופית בצנצנת # 1 במשך 5 שניות, שטיפה מהירה בצנצנת # 2, תעזוב את כל שקופית בצנצנת # 3 לפחות 30 שניות, שטיפה מהירה בצנצנת # 4 לאחר מכן לאפשר שקופיות לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן fresשעות Giemsa מכתים הפתרון (3:1 יחס Gurr הצפת וGiemsa הכתם). מניחים את השקופיות על מדף מכתים. לכסות את השקופית כולה בפתרון מכתים Giemsa. בואו השקופיות יישארו בפתרון מכתים למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את השקופיות במים מזוקקים באותו סדר שהם היו מוכתמים. אפשר השקופיות לייבוש במשך 10 דקות בערך. השקופית צריכה להיות יבשה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 טיפות של Permount ולהחליק את מכסה לשקופית. ודא שאין בועות מתחת coverslip. Permount העודף ניתן להסיר עם מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את התאים עם מיקרוסקופ אור בהגדלה 10X ו100X. התאם עיתוי טריפסין של שאר השקופיות המבוססות על התוצאות של השקופית הראשונה. </li></ol>

<ol>
	<li>Driscoll, D., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+screening+for+aneuploidy.">Prenatal screening for aneuploidy.</a> New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).</li><li>Nussbuam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetics in Medicine: 7th Edition. , 76 (2007).</li><li>Ljunger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities+in+first-trimester+miscarriages.">Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages.</a> Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).</li><li>Kwinecka-Dmitri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+chromosomal+aberrations+in+material+from+abortions.">Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions.</a> Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).</li><li>Reddy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stillbirth+classification&#8212;Developing+an+international+consensus+for+research:+Executive+summary+of+a+national+institute+of+child+health+and+human+development+workshop.">Stillbirth classification&#8212;Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop.</a> Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).</li><li>Pierpoint, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+for+congenital+heart+defects:+Current+knowledge.">Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge.</a> Circulation. 115 (23), 3015 (2007).</li><li>Kaneshiro, N., Zieve, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+Syndrome:+Trisomy+21..">Down Syndrome: Trisomy 21..</a> PubMed Health. , (2010).</li><li>Cin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Human Genetics. , (2003).</li><li>Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+in+cancer+cytogenetics+and+molecular+cytogenetics.">Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics.</a> Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).</li><li>Miura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulated+Chromosomal+Instability+in+Murine+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+Leads+to+Malignant+Transformation.">Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation.</a> Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).</li><li>Izadpanah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+In+vitro+Expansion+Alters+the+Biology+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells.">Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells.</a> Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).</li><li>Dekel-Naftali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+human+pluripotent+stem+cells+using+CGH+and+FISH+reveals+low-grade+mosaic+aneuploidy+and+a+recurrent+amplification+of+chromosome+1q.">Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q.</a> Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).</li><li>Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Technique+for+Chromosomal+Analysis+of+Human+ES+and+iPS+Cells.">An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells.</a> Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).</li><li>Bayani, J., Squire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+banding+of+chromosomes+for+cytogenetic+analysis.">Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).</li><li>Speicher, M. R., Carter, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+cytogenetics:+blurring+the+boundaries+with+molecular+biology.">The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).</li><li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Lymphocyte+Culture+and+Chromosome+Analysis.">Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li><li>Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).</li><li>Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition. , (1997).</li><li>Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J., McClatchey, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+studies+in+neoplastic+hematologic+disorders.">Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders.</a> In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. , 658-685 (2002).</li><li>Kibe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7R&#945;+deficiency+in+p53(null)+mice+exacerbates+thymocyte+telomere+erosion+and+lymphomagenesis.">IL-7R&#945; deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis.</a> Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).</li><li>Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+features+of+a+boy+with+trisomy+of+16q22--&gt;qter+due+to+paternal+Y;+16+translocation.">Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22--&gt;qter due to paternal Y; 16 translocation.</a> Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).</li><li>Tsien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+culture+of+normal+chorionic+villus+cells+yields+ICF+syndrome-like+chromatin+decondensation+and+rearrangements.">Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements.</a> Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).</li><li>McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+conventional+cytogenetics+(G-banding),+comparative+genomic+hybridization+(CGH)+and+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+(i-FISH)+for+the+detection+of+genomic+rearrangements+in+acute+leukemia.">Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia.</a> J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).</li></ol>

יש לנו מנוצלים בהליך הנוכחי לבידוד כרומוזום מהתאים של אורגניזמים שונים, לרבות סוגים שונים של תאים המתקבלים מאדם, קופי רזוס, חולדות, עכברים ו11,20-22. הפרוטוקול הסטנדרטי מסופק, אבל צעדי מפתח מסוימים ומשתנים ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים לסוגים השונים של תאים אלה. כמה ...

ניתוח כרומוזום הוא טכניקה קונבנציונלית מנוצל ברחבי העולם כדי לאבחן חוסר יציבות כרומוזום ושחלופים שמובילות להפרעות גנטיות ו1,2,8,9 ממאירות. בנוסף, ברזולוציה גבוהה יותר לאבחון והמחקר של מומים גנטיים חוקתיים והסרטן רכשה ניתן להשיג עם השילוב של הנהלים הקלאסיים ציטוגנטית ומתודולוגיות ציטוגנטית מולקולריות כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה גנומית השוואתית (CGH) , וkaryotyping ספקטרלי (SKY) 14,15. לאחרונה, טכניקות אלה כבר נוצלו להערכה של חוסר יציבות כרומוזום קשור עם מחקר בתאי גזע. מומים Karyotypic כגון aneuploidy של תאים לטווח ארוך בתרבית עוברית (ES) ותאי גזע בוגרים של אורגניזמים שונים שדווחו על ידי מעבדות מרובות. הראיות אחרונות תומכת שבכמה שורות תאי מטבעם נוטים יותר instabi כרומוזוםlity ללא קשר לתנאי תרבות. מסיבה זו, בעת הקמת ו / או שמירה על אדם, עכבר, או שורות תאי גזע רזוס, ניתוח כרומוזום מומלץ כחלק מתהליך בקרת איכות. דיווחים רבים לתאר את העניין הגובר בשימוש בציטוגנטיקה השגרתית והמולקולרית כדי לפקח על היציבות בכרומוזומים של תאי גזע ותאים ממאירים או אורגניזמים שונים בתרבות 10-13. פרוטוקולים אלה הם יותר ויותר בשימוש על ידי מעבדות לא גנטיות להערכה כרומוזומלית מהירה של התאים בתרבית שלהם 13. אנו מציגים הנהלים הבסיסיים שלנו להכנת כרומוזום מסוגי תאים שונים, אשר יכול להיות מיושמים למטרות מחקריות וקליניות ובתאים שמקורם אורגניזמים שונים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">KaryoMAX Colcemid</td>
			<td style="width:213px;">Gibco</td>
			<td style="width:145px;">15212-012</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5% Trypsin EDTA 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permount</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer Tablets &#34;GURR&#34;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10580-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Geimsa Stain</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3250-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>6700130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Krackeler Scientific Inc.&#160;</td>
			<td>11-9508-05</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromosome preparation from cultured cells

ניתוח כרומוזום (ציטוגנטית) נמצא בשימוש נרחב לגילוי של חוסר יציבות כרומוזום. כאשר אחריו ה-G-פסים וטכניקות מולקולריות כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), יש assay זה את היכולת רבת עוצמה לניתוח תאים בודדים לסטיות שכוללות רווחים או הפסדים מחלקים של הגנום ושחלופים מעורבים כרומוזומים אחד או יותר. בבני אדם, מומים כרומוזום מתרחשים בכ 1 לכל 160 לידה חי 1,2, 60-80% מכלל הפלות 3,4, 10% מלידה מתות 2,5, 13% מאנשים עם מחלת לב מולדת 6, 3-6% מהמקרים בעיות פוריות 2, ואצל חולים רבים עם עיכוב התפתחותי ומומים מולדים 7. ניתוח ציטוגנטית של ממאירות משמש באופן שגרתי על ידי חוקרים וקלינאים, כמו תצפיות של פגמים בכרומוזומים משובטים הוכחו יש גם משמעות דיאגנוסטית ופרוגנוסטית 8,9.60; בידוד כרומוזום לא יסולא בפז עבור ריפוי גנטי ומחקר בתאי גזע של יצורים כוללים פרימטים ומכרסמים 10-13 לא אנושיים. יכולים להיות מבודדים הכרומוזומים מהתאים של רקמות חיות, ובכלל זה לימפוציטים בדם, fibroblasts עור, amniocytes, שליה, מח עצם, ודגימות גידול. כרומוזומים מנותחים בשלב metaphase של מיטוזה, כאשר הם מרוכזים ביותר, ולכן בצורה ברורה יותר לעין. הצעד הראשון של טכניקת בידוד כרומוזום כרוך השיבוש של סיבי הכישור ידי דגירה עם Colcemid, כדי למנוע את התאים מפני שתמשיך לשלב anaphase שלאחר מכן. לאחר מכן טופלו התאים עם פתרון hypotonic והשתמרו במצב הנפוח שלהם עם המקבע של Carnoy. לאחר מכן התאים נפלו על שקופיות ואז יכולים להיות מנוצל עבור מגוון רחב של נהלים. G-banding כרוך טיפול טריפסין ואחרי צביעה עם Giemsa כדי ליצור אור אופייני ופסים כהים. אותו יחסי הציבורocedure לבודד את הכרומוזומים יכול לשמש להכנת תאים להליכים כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה השוואתית גנומית (CGH), וkaryotyping ספקטרלי (SKY) 14,15.

ממרחי metaphase איכות גבוהה חיוניים לניתוח כרומוזום. Assay מוצלח מניב כרומוזומים אשר פרוסים היטב ומורפולוגיה כרומוזום המתאימה. כרומוזומים כראוי התאגדו-G מכילים את האור האופייני ודפוסי פסים כהים. <img alt="איור 1" fo:content-wi...

Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Preparation From Cultured Cells at JoVE.com

Chromosome Preparation From Cultured Cells

יכולים להיות מבודדים הכרומוזומים מתאי חיים כגון לימפוציטים או fibroblasts עור, ומאורגניזמים כולל בני אדם או עכברים. הכנות כרומוזום אלה יכולים להיות מנוצלים נוספים עבור ה-G-פסים שיגרתי ונהלים ציטוגנטית מולקולריים כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה השוואתית גנומית (CGH), וkaryotyping ספקטרלי (SKY).

הכנת כרומוזום מתאים בתרבית

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

chromosome-preparation-from-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Biology

80.3K Views.  Louisiana State University Health Science Center.  יכולים להיות מבודדים הכרומוזומים מתאי חיים כגון לימפוציטים או fibroblasts עור, ומאורגניזמים כולל בני אדם או עכברים. הכנות כרומוזום אלה יכולים להיות מנוצלים נוספים עבור ה-G-פסים שיגרתי ונהלים ציטוגנטית מולקולריים כגון הקרינה הכלאה באתרו (FIS...

Video: Chromosome Preparation From Cultured Cells

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

ספירת ועל קביעת הכדאיות של תאים בתרבית

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

הכנת מועכת תסיסנית Polytene כרומוזום עבור סימון נוגדן

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

מבחני כתב מקבילים מסיבי בתאי יונקים בתרבית

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

כרומוזום מהיר האוויר יבש השמטת הכנת שיטה מתאימה לדגים בצמחים

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on the surface of slides (rather than dropping them from a height), we demonstrate an optimized technique on mouse spermatocytes that was first described in 1997. This method is widely used in laboratories to study mammalian meiosis because it yields a plethora of high quality nuclei undergoing substages of prophase I. Seminiferous tubules are first placed in a hypotonic solution to swell spermatocytes. Then spermatocytes are released into a sucrose solution to create a cell suspension, and nuclei are spread onto fixative-soaked glass slides. Following immunostaining, a diversity of proteins germane to meiotic processes can be examined. For example, proteins of the synaptonemal complex, a tripartite structure that connects the chromosome axes/cores of homologs together can be easily visualized. Meiotic recombination proteins, which are involved in repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination, can also be immunostained to evaluate progression of prophase I. Here we describe and demonstrate in detail a technique widely used to study mammalian meiosis in spermatocytes from juvenile or adult male mice.

Meiosis is the developmental process by which gametes are formed through a single round of DNA replication and two successive rounds of chromosome segregation. Mammalian meiosis can be examined by utilizing a technique to prepare meiotic chromosome spreads. Here, we demonstrate a method of preparing surface-spread nuclei from mouse spermatocytes.

הכנה של כרומוזום Meiotic מתפשטת העכבר Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. HIF-1 consists of a heterodimeric oxygen-regulated &#945; subunit (HIF-1&#945;) and constitutively expressed &#946; subunit (HIF-1&#946;) also known as aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT), regulating genes involved in diverse processes including angiogenesis, erythropoiesis and glycolysis. The identification of HIF-1 interacting proteins is key to the understanding of the hypoxia signaling pathway. Besides the regulation of HIF-1&#945; stability, hypoxia also triggers the nuclear translocation of many transcription factors including HIF-1&#945; and ARNT. Notably, most of the current methods used to study such protein-protein interactions (PPIs) are based on systems where protein levels are artificially increased through protein overexpression. Protein overexpression often leads to non-physiological results arising from temporal and spatial artifacts. Here we describe a modified co-immunoprecipitation protocol following hypoxia treatment using endogenous nuclear proteins, and as a proof of concept, to show the interaction between HIF-1&#945; and ARNT. In this protocol, the hypoxic cells were harvested under hypoxic conditions and the Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) wash buffer was also pre-equilibrated to hypoxic conditions before usage to mitigate protein degradation or protein complex dissociation during reoxygenation. In addition, the nuclear fractions were subsequently extracted to concentrate and stabilize endogenous nuclear proteins and avoid possible spurious results often seen during protein overexpression. This protocol can be used to demonstrate endogenous and native interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators under hypoxic conditions.

Here we describe a co-immunoprecipitation protocol to study protein-protein interactions between endogenous nuclear proteins under hypoxic conditions. This method is suitable for demonstration of the interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators at hypoxia.

Co-immunoprecipitation Assay באמצעות חלבונים גרעיניים אנדוגני מתאי תרבותי בתנאים ובשפתיים

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

הכנת תאי אדיפוס אבות מרקמות שומן אפידימליות עכבר

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...