העבודה המתוארת בכתב היד הזה התאפשרה על ידי מימון מקרן פטריק פ טיילור.

1. קציר כרומוזום של תאים חסידים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול סטנדרטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים בהתאם לתנאי culturing התא ספציפיים. כאשר התאים הגיעו שלב לוגריתמים (confluency 80%), להוסיף 10 μl / מיליליטר של Colcemid לבקבוק תרבית תאים. מינימום של 2 x 10 6 תאים מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור במשך 45 דקות. באמצעות פיפטה סטרילית, להעביר מדיה מהתאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. מניח בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את התאים על ידי הוספת 2 מיליליטר של HBSS הצפת לתוך הבקבוק. מערבולת חיץ ולאחר מכן להסיר בעזרת פיפטה. בטל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של טריפסין, מה שמבטיח שהוא מכסה את כל פני השטח של הבקבוק. להשאיר רק את התאים בטריפסין למשך כ -2 דקות. לאחר שרוב התאים יש מנותקים, פיפטה התקשורת בצינור חרוטי חזרה אל התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את ההשעיה התא ב10 aliquots מיליליטר לתוך צינורות חרוטי 15 מיליליטר.צנטריפוגה ב XG 200 10 דקות. הסר supernatant ו resuspend את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של 0.075 M KCl אשר כבר prewarmed ל37 ° C עד גלולה שנותרה בצינור חרוטי. צינור וורטקס במהירות בינונית לערבב KCl ותאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות ב25 ° C. הסר supernatant (עד כ 0.5 מיליליטר שרידים) וגלול resuspend. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף 5 מיליליטר של המקבע של Carnoy הטרי (3:1 יחס של מתנול: חומצה אצטית קרחונית) לתאים תוך vortexing. לאחר מכן להוסיף 5 מיליליטר יותר מקבע בלי vortexing עבור סכום כולל של 10 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 200 למשך 5 דקות. הסרת תאי supernatant ו resuspend. הוסף 5 מיליליטר של מקבע לצינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 200 למשך 5 דקות. הסרת תאי supernatant ו resuspend. הוסף 5 מיליליטר של מקבע לצינור אחד. כעת ניתן לאחסן את התאים ב4 מעלות צלזיוס למשך עד שנה אחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי לפרוטוקול: harvesti כרומוזוםננוגרם של שורות תאי lymphoblastoid <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים בהתאם לתנאי culturing התא ספציפיים. (שימוש בבקבוקון מתאים לכמות של תאים בתרבית). כאשר התאים הגיעו שלב לוגריתמים (כ 2 ימים לאחר התאים מפוצלים), להוסיף 10 μl / מיליליטר של Colcemid לבקבוק תרבית תאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי לפרוטוקול: קצירת כרומוזום מכל דם Phytohemagglutinin (PHA), לקטינים הנגזרים משעועית הכליה האדומה, הוא mitogen עוצמה לתאי T אנושיים 16. 72 שעות לאחר התוספת של PHA לתרבות, על 45% מתאים נמצאים בשלב S. זה מייצג את הפעילות המיטוטי שיא, והוא הנקודה האופטימלית שבו למסוק ללימודי כרומוזום. mitogens אחרת כגון פיטולקה (1-10 מיקרוגרם / מיליליטר) ניתן להשתמש בו בעת ניתוח תאי B 17,18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף לפחות 1 מיליליטר של דם מלא בצינור הפרין סודיום העליון ירוק. השתמש בתוך 3 ימים לאחר גבייה. דם חנות ב RT בלתיtil מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 0.25 מיליליטר של דם מלא ב10 מיליליטר של מדיה מלאה RPMI המכילה L-גלוטמין (20% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, fungizone 1%, וPHA 1%). תרבות על 37 ° C עם 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי לפרוטוקול: קצירת כרומוזום ממח העצם ניתוח ציטוגנטית במח עצם הוא מועיל בפרעות המטולוגיות ממאירות רבות כתצפית של שיבוט chromosomally חריג עשויה להיות אבחון לסוג מסוים של סרטן דם. מחקרי כרומוזום משמשים גם כדי להעריך את התקדמות מחלה, כגון תחילת משבר פיצוץ ותגובה לטיפול. מכיוון שתאי מח העצם באופן פעיל בחלוקה, לא גירוי mitogen הוא 9,19 צורך. לוקמיה חריפה 24 ו48 תרבויות שעה גם להגדיר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף לפחות 1 מיליליטר של מח עצם בצינור הפרין סודיום העליון ירוק. Aliquot 0.25 מיליליטר של מח עצם ב10 מיליליטר של מדיה מלאה RPMI המכילה L-גלוטמין (20% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, fungizone 1%). תרבות על 37 ° C עם 5% CO 2. </li></ol></li></ol> 2. שקופיות הכנה ומכתים מוצק הערכה מהירה של שקופית אחת נציג תספק מידע על איכות היבול לפני שתמשיך להליכים נוספים כגון G-banding, FISH, CGH, או SKY. מעבדות שמעדיפות כתם מוצק התאים לקציר מהיר והערכת כרומוזום. לחלופין, מיקרוסקופ לעומת שלב ניתן להשתמש בניתוח זה. שקופיות מוכנות הטובים ביותר כאשר הלחות היא כ 50% וסביבת הטמפרטורה (20-25 ° C). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות ב25 ° C. הסר את supernatant עד שרק 0.3-0.5 מיליליטר שרידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בעדינות resuspending גלולה, שלוש טיפות פיפטה של ​​ההשעיה התא ממרחק של כ 2 בשקופית אשר נטויה בזווית של כ 45 ° ולאפשר ההשעיהלגלגל על ​​פני השקופית. הוסף טיפה אחת גדולה של המקבע של Carnoy הטרי לשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את הגב של השקופית על מגבת נייר ולאחר מכן לשבת השקופיות לייבוש לפחות 10 דקות. השקופית צריכה להיות יבשה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טרי Giemsa מכתים פתרון (3:1 יחס Gurr הצפת וGiemsa הכתם). מניחים את השקופיות על מדף מכתים. לכסות את השקופית כולה בפתרון מכתים Giemsa. בואו השקופיות יישארו בפתרון מכתים למשך 5 דקות. יש לשטוף את השקופיות עם מים מזוקקים, לטמיון, ולאפשר לאוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 טיפות של Permount ולהחליק את מכסה לשקופית. ודא שאין בועות מתחת coverslip. Permount העודף ניתן להסיר עם מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את התאים עם מיקרוסקופ אור בהגדלה 10X ו100X. אם תאי metaphase נמצאים בשפע וגם התפשטות, השקופיות שנותרו יכולות לשמש לפרוצדורות אחרות. </li></ol> 3. G-Banding באמצעות טריפסין וGiemsa (GTG) &lt;p&gt; טריפסין הוא אנזים פרוטאוליטי הdenatures ההיסטונים euchromatic באזורי DNA עם פעילות תעתיק גבוהה יותר וכתוצאה מכך. בעקבות צביעת Giemsa, אזורים אלה יופיעו כלהקות אור. הכרומטין מרוכז מאוד עם פעילות מועטת או לא תעתיק (heterochromatin) יהיה חלק גדול של ההיסטונים המוגנים מפני טריפסין ולכן כתם כהה הבא מכתים Giemsa. זה חיוני כדי תחילה G-band שקופית אחת כדי לפקח על התנאים ולהתאים את עיתוי טריפסין במידת צורך לשקופיות שלאחר מכן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את הפתרונות הבאים ל4 צנצנות Coplin. # צנצנת 1 = 30 מיליליטר של 1x HBSS ו4 מיליליטר של 10x טריפסין (0.5%) # צנצנת 2 = 50 מיליליטר של 1x HBSS צנצנת # 3 = 45 מיליליטר של 1x HBSS ו5 מיליליטר של סרום שור עוברי # צנצנת 4 = 50 מיליליטר של 1x HBSS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול כל שקופית בצנצנת # 1 במשך 5 שניות, שטיפה מהירה בצנצנת # 2, תעזוב את כל שקופית בצנצנת # 3 לפחות 30 שניות, שטיפה מהירה בצנצנת # 4 לאחר מכן לאפשר שקופיות לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן fresשעות Giemsa מכתים הפתרון (3:1 יחס Gurr הצפת וGiemsa הכתם). מניחים את השקופיות על מדף מכתים. לכסות את השקופית כולה בפתרון מכתים Giemsa. בואו השקופיות יישארו בפתרון מכתים למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את השקופיות במים מזוקקים באותו סדר שהם היו מוכתמים. אפשר השקופיות לייבוש במשך 10 דקות בערך. השקופית צריכה להיות יבשה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 טיפות של Permount ולהחליק את מכסה לשקופית. ודא שאין בועות מתחת coverslip. Permount העודף ניתן להסיר עם מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את התאים עם מיקרוסקופ אור בהגדלה 10X ו100X. התאם עיתוי טריפסין של שאר השקופיות המבוססות על התוצאות של השקופית הראשונה. </li></ol>

<ol>
	<li>Driscoll, D., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+screening+for+aneuploidy.">Prenatal screening for aneuploidy.</a> New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).</li><li>Nussbuam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetics in Medicine: 7th Edition. , 76 (2007).</li><li>Ljunger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities+in+first-trimester+miscarriages.">Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages.</a> Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).</li><li>Kwinecka-Dmitri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+chromosomal+aberrations+in+material+from+abortions.">Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions.</a> Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).</li><li>Reddy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stillbirth+classification&#8212;Developing+an+international+consensus+for+research:+Executive+summary+of+a+national+institute+of+child+health+and+human+development+workshop.">Stillbirth classification&#8212;Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop.</a> Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).</li><li>Pierpoint, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+for+congenital+heart+defects:+Current+knowledge.">Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge.</a> Circulation. 115 (23), 3015 (2007).</li><li>Kaneshiro, N., Zieve, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+Syndrome:+Trisomy+21..">Down Syndrome: Trisomy 21..</a> PubMed Health. , (2010).</li><li>Cin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Human Genetics. , (2003).</li><li>Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+in+cancer+cytogenetics+and+molecular+cytogenetics.">Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics.</a> Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).</li><li>Miura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulated+Chromosomal+Instability+in+Murine+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+Leads+to+Malignant+Transformation.">Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation.</a> Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).</li><li>Izadpanah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+In+vitro+Expansion+Alters+the+Biology+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells.">Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells.</a> Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).</li><li>Dekel-Naftali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+human+pluripotent+stem+cells+using+CGH+and+FISH+reveals+low-grade+mosaic+aneuploidy+and+a+recurrent+amplification+of+chromosome+1q.">Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q.</a> Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).</li><li>Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Technique+for+Chromosomal+Analysis+of+Human+ES+and+iPS+Cells.">An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells.</a> Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).</li><li>Bayani, J., Squire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+banding+of+chromosomes+for+cytogenetic+analysis.">Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).</li><li>Speicher, M. R., Carter, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+cytogenetics:+blurring+the+boundaries+with+molecular+biology.">The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).</li><li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Lymphocyte+Culture+and+Chromosome+Analysis.">Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li><li>Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).</li><li>Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition. , (1997).</li><li>Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J., McClatchey, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+studies+in+neoplastic+hematologic+disorders.">Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders.</a> In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. , 658-685 (2002).</li><li>Kibe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7R&#945;+deficiency+in+p53(null)+mice+exacerbates+thymocyte+telomere+erosion+and+lymphomagenesis.">IL-7R&#945; deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis.</a> Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).</li><li>Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+features+of+a+boy+with+trisomy+of+16q22--&gt;qter+due+to+paternal+Y;+16+translocation.">Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22--&gt;qter due to paternal Y; 16 translocation.</a> Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).</li><li>Tsien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+culture+of+normal+chorionic+villus+cells+yields+ICF+syndrome-like+chromatin+decondensation+and+rearrangements.">Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements.</a> Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).</li><li>McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+conventional+cytogenetics+(G-banding),+comparative+genomic+hybridization+(CGH)+and+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+(i-FISH)+for+the+detection+of+genomic+rearrangements+in+acute+leukemia.">Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia.</a> J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).</li></ol>

יש לנו מנוצלים בהליך הנוכחי לבידוד כרומוזום מהתאים של אורגניזמים שונים, לרבות סוגים שונים של תאים המתקבלים מאדם, קופי רזוס, חולדות, עכברים ו11,20-22. הפרוטוקול הסטנדרטי מסופק, אבל צעדי מפתח מסוימים ומשתנים ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים לסוגים השונים של תאים אלה. כמה ...

ניתוח כרומוזום הוא טכניקה קונבנציונלית מנוצל ברחבי העולם כדי לאבחן חוסר יציבות כרומוזום ושחלופים שמובילות להפרעות גנטיות ו1,2,8,9 ממאירות. בנוסף, ברזולוציה גבוהה יותר לאבחון והמחקר של מומים גנטיים חוקתיים והסרטן רכשה ניתן להשיג עם השילוב של הנהלים הקלאסיים ציטוגנטית ומתודולוגיות ציטוגנטית מולקולריות כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה גנומית השוואתית (CGH) , וkaryotyping ספקטרלי (SKY) 14,15. לאחרונה, טכניקות אלה כבר נוצלו להערכה של חוסר יציבות כרומוזום קשור עם מחקר בתאי גזע. מומים Karyotypic כגון aneuploidy של תאים לטווח ארוך בתרבית עוברית (ES) ותאי גזע בוגרים של אורגניזמים שונים שדווחו על ידי מעבדות מרובות. הראיות אחרונות תומכת שבכמה שורות תאי מטבעם נוטים יותר instabi כרומוזוםlity ללא קשר לתנאי תרבות. מסיבה זו, בעת הקמת ו / או שמירה על אדם, עכבר, או שורות תאי גזע רזוס, ניתוח כרומוזום מומלץ כחלק מתהליך בקרת איכות. דיווחים רבים לתאר את העניין הגובר בשימוש בציטוגנטיקה השגרתית והמולקולרית כדי לפקח על היציבות בכרומוזומים של תאי גזע ותאים ממאירים או אורגניזמים שונים בתרבות 10-13. פרוטוקולים אלה הם יותר ויותר בשימוש על ידי מעבדות לא גנטיות להערכה כרומוזומלית מהירה של התאים בתרבית שלהם 13. אנו מציגים הנהלים הבסיסיים שלנו להכנת כרומוזום מסוגי תאים שונים, אשר יכול להיות מיושמים למטרות מחקריות וקליניות ובתאים שמקורם אורגניזמים שונים.

<table><tbody><tr><td>KaryoMAX Colcemid</td><td>Gibco</td><td>15212-012</td><td></td></tr><tr><td>HBSS Buffer</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin EDTA 10x</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Tablets &quot;GURR&quot;</td><td>Gibco</td><td>10580-013</td><td></td></tr><tr><td>Geimsa Stain</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3250-16</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Caledon Laboratory Chemicals</td><td>6700130</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Krackeler Scientific Inc.</td><td>11-9508-05</td><td></td></tr></tbody></table>

chromosome preparation from cultured cells

ניתוח כרומוזום (ציטוגנטית) נמצא בשימוש נרחב לגילוי של חוסר יציבות כרומוזום. כאשר אחריו ה-G-פסים וטכניקות מולקולריות כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), יש assay זה את היכולת רבת עוצמה לניתוח תאים בודדים לסטיות שכוללות רווחים או הפסדים מחלקים של הגנום ושחלופים מעורבים כרומוזומים אחד או יותר. בבני אדם, מומים כרומוזום מתרחשים בכ 1 לכל 160 לידה חי 1,2, 60-80% מכלל הפלות 3,4, 10% מלידה מתות 2,5, 13% מאנשים עם מחלת לב מולדת 6, 3-6% מהמקרים בעיות פוריות 2, ואצל חולים רבים עם עיכוב התפתחותי ומומים מולדים 7. ניתוח ציטוגנטית של ממאירות משמש באופן שגרתי על ידי חוקרים וקלינאים, כמו תצפיות של פגמים בכרומוזומים משובטים הוכחו יש גם משמעות דיאגנוסטית ופרוגנוסטית 8,9.60; בידוד כרומוזום לא יסולא בפז עבור ריפוי גנטי ומחקר בתאי גזע של יצורים כוללים פרימטים ומכרסמים 10-13 לא אנושיים. יכולים להיות מבודדים הכרומוזומים מהתאים של רקמות חיות, ובכלל זה לימפוציטים בדם, fibroblasts עור, amniocytes, שליה, מח עצם, ודגימות גידול. כרומוזומים מנותחים בשלב metaphase של מיטוזה, כאשר הם מרוכזים ביותר, ולכן בצורה ברורה יותר לעין. הצעד הראשון של טכניקת בידוד כרומוזום כרוך השיבוש של סיבי הכישור ידי דגירה עם Colcemid, כדי למנוע את התאים מפני שתמשיך לשלב anaphase שלאחר מכן. לאחר מכן טופלו התאים עם פתרון hypotonic והשתמרו במצב הנפוח שלהם עם המקבע של Carnoy. לאחר מכן התאים נפלו על שקופיות ואז יכולים להיות מנוצל עבור מגוון רחב של נהלים. G-banding כרוך טיפול טריפסין ואחרי צביעה עם Giemsa כדי ליצור אור אופייני ופסים כהים. אותו יחסי הציבורocedure לבודד את הכרומוזומים יכול לשמש להכנת תאים להליכים כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה השוואתית גנומית (CGH), וkaryotyping ספקטרלי (SKY) 14,15.

ממרחי metaphase איכות גבוהה חיוניים לניתוח כרומוזום. Assay מוצלח מניב כרומוזומים אשר פרוסים היטב ומורפולוגיה כרומוזום המתאימה. כרומוזומים כראוי התאגדו-G מכילים את האור האופייני ודפוסי פסים כהים. <img alt="איור 1" fo:content-wi...

Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Preparation From Cultured Cells at JoVE.com

Chromosome Preparation From Cultured Cells

יכולים להיות מבודדים הכרומוזומים מתאי חיים כגון לימפוציטים או fibroblasts עור, ומאורגניזמים כולל בני אדם או עכברים. הכנות כרומוזום אלה יכולים להיות מנוצלים נוספים עבור ה-G-פסים שיגרתי ונהלים ציטוגנטית מולקולריים כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה השוואתית גנומית (CGH), וkaryotyping ספקטרלי (SKY).

הכנת כרומוזום מתאים בתרבית

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

chromosome-preparation-from-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Biology

81.0K Views.  Louisiana State University Health Science Center.  יכולים להיות מבודדים הכרומוזומים מתאי חיים כגון לימפוציטים או fibroblasts עור, ומאורגניזמים כולל בני אדם או עכברים. הכנות כרומוזום אלה יכולים להיות מנוצלים נוספים עבור ה-G-פסים שיגרתי ונהלים ציטוגנטית מולקולריים כגון הקרינה הכלאה באתרו (FIS...

Video: Chromosome Preparation From Cultured Cells

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. To assess the impact of PM on nuclear genetic integrity, structural chromosomal aberrations are scored in the metaphase spreads of mouse RAW264.7 macrophage cells. PM is collected from ambient air with a high volume total suspended particles sampler. The collected material is solubilized and filtered to retain the water-soluble, fine portion. The particles are characterized for chemical composition by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Different concentrations of particle suspension are added onto an in vitro culture of RAW264.7 mouse macrophages for a total exposure time of 72 hr, along with untreated control cells. At the end of exposure, the culture is treated with colcemid to arrest cells in metaphase. Cells are then harvested, treated with hypotonic solution, fixed in acetomethanol, dropped onto glass slides and finally stained with Giemsa solution. Slides are examined to assess the structural chromosomal aberrations (CAs) in metaphase spreads at 1,000X magnification using a bright-field microscope. 50 to 100 metaphase spread are scored for each treatment group. This technique is adapted for the detection of structural chromosomal aberrations (CAs), such as chromatid-type breaks, chromatid-type exchanges, acentric fragments, dicentric and ring chromosomes, double minutes, endoreduplication, and Robertsonian translocations in vitro after exposure to PM. It is a powerful method to associate a well-established cytogenetic endpoint to epigenetic alterations.

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

This protocol describes techniques for the quantification and characterization of chromosomal aberrations in vitro in RAW264.7 mouse macrophages after treatment with ambient air particulate matter.

ניתוח של סטיות כרומוזומליות Matter הנגרמת חלקיקי אמביינט שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Genetics

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein interactions in yeast. It allows analysis of a target region of interest without the need for prior knowledge about likely proteins bound to the target region. This, in theory, allows HyCCAPP to be used to analyze any genomic region of interest, and it provides sufficient flexibility to work in different cell systems. This method is not meant to study binding sites of known transcription factors, a task better suited for Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-like methods. The strength of HyCCAPP lies in its ability to explore DNA regions for which there is limited or no knowledge about the proteins bound to it. It can also be a convenient method to avoid biases (present in ChIP-like methods) introduced by protein-based chromatin enrichment using antibodies. Potentially, HyCCAPP can be a powerful tool to uncover truly novel DNA-protein interactions. To date, the technology has been predominantly applied to yeast cells or to high copy repeat sequences in mammalian cells. In order to become the powerful tool we envision, HyCCAPP approaches need to be optimized to efficiently capture single-copy loci in mammalian cells. Here, we present our adaptation of the initial yeast HyCCAPP capture protocol to human cell lines, and show that single-copy chromatin regions can be efficiently isolated with this modified protocol.

This is a method to identify novel DNA-interacting proteins at specific target loci, relying on sequence-specific capture of crosslinked chromatin for subsequent proteomic analyses. No prior knowledge about potential binding proteins, nor cell modifications are required. Initially developed for yeast, the technology has now been adapted for mammalian cells.

עיבוד של הכלאה צלמו של חלבונים הקשורים כרומטין פרוטאומיקס בתרבית של תאים

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to be responsible for carcinogenesis in such tissues. Although proliferative polyploid cells are requisite for analyzing chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is rather challenging. Induction of tetraploidy by chemical agents usually results in a mixture of diploid and tetraploid populations, and most studies employed fluorescence-activated cell sorting or cloning by limiting dilution to separate tetraploid from diploid cells. However, these procedures are time-consuming and laborious. The present report describes a relatively simple protocol to induce proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts with minimum contamination by diploid cells. Briefly, the protocol is comprised of the following steps: arresting cells in mitosis by demecolcine (DC), collecting mitotic cells after shaking off, incubating collected cells with DC for an additional 3 days, and incubating cells in drug-free medium (They resume proliferation as tetraploid cells within several days). Depending on cell type, the collection of mitotic cells by shaking off might be omitted. This protocol provides a simple and feasible method to establish proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Tetraploid cells established by this method could be a useful model for studying chromosome instability and the oncogenic potential of polyploid human cells.

Although proliferative polyploid cells are necessary to analyze chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is not easy. The present report describes relatively simple procedures to establish proliferative tetraploid cells free of a diploid population from normal human fibroblasts.

הקמת תאי tetraploid Proliferative מ Nontransformed אדם פיברובלסטים

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Developmental Biology

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) is used to fix chromatin interactions. Then, chromatin digestion with a restriction enzyme and subsequent religation of fragment ends converts three-dimensional (3D) proximity into unique ligation products. Finally, after reversal of crosslinks, protein removal, and DNA isolation, DNA is sheared and prepared for high-throughput sequencing. The frequency of proximity ligation of pairs of loci is a measure of the frequency of their colocalization in three-dimensional space in a cell population.
A sequenced Hi-C library provides genome-wide information on interaction frequencies between all pairs of loci. The resolution and precision of Hi-C relies on efficient crosslinking that maintains chromatin contacts and frequent and uniform fragmentation of the chromatin. This paper describes an improved in situ Hi-C protocol, Hi-C 3.0, that increases the efficiency of crosslinking by combining two crosslinkers (formaldehyde [FA] and disuccinimidyl glutarate [DSG]), followed by finer digestion using two restriction enzymes (DpnII and DdeI). Hi-C 3.0 is a single protocol for the accurate quantification of genome folding features at smaller scales such as loops and topologically associating domains (TADs), as well as features at larger nucleus-wide scales such as compartments.

Hi-C 3.0 is an improved Hi-C protocol that combines formaldehyde and disuccinimidyl glutarate crosslinkers with a cocktail of DpnII and DdeI restriction enzymes to increase the signal-to-noise ratio and the resolution of chromatin interaction detection.

לכידת קונפורמציה של כרומוזומים על פני סולמות אורך

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

ניתוח מהיר של סטיות כרומוזום בעכבר לימפוציטים מסוג B על ידי הרשות הפלסטינית-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Immunology and Infection

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

הכנת מועכת תסיסנית Polytene כרומוזום עבור סימון נוגדן

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

תא Assay חינם לחקר הכרומטין Decondensation בסוף מיטוזה

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

כרומוזום מהיר האוויר יבש השמטת הכנת שיטה מתאימה לדגים בצמחים

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

הכנת כרומוזום מתאים בתרבית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ניתוח של סטיות כרומוזומליות Matter הנגרמת חלקיקי אמביינט שימוש