המחברים מבקשים להודות לגלן סלוקום (ספר לרפואה של ויסקונסין) וקולין א לאבין (מכשירי Nikon Inc) לקבלת סיוע טכני מעולה עם ניסויים במיקרוסקופ. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות מעניקים R01 HL108880 (לAS), R01 DK095029 (לOPO) וK99 HL116603 (לכפית), קרן הלאומית לכליות IG1724 (לכפית), איגוד לב האמריקאי 13GRNT16220002 (לOPO) ו בן ג &#39;יפס מחקר המלגה מהאגודה האמריקנית לנפרולוגיה (ל- DVI).

הפרוצדורות המתוארות להלן אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים בבית הספר לרפואה של ויסקונסין ואוניברסיטת מרכז מדע בריאות טקסס ביוסטון והיו בהתאם למכונים הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. איור 1 מדגים את שלבים עיקריים של בידוד הרקמות והליך עיבוד. בקצרה, כליות מחולדות PCK או SD משמשות לבידוד ידני של monolayers אפיתל של איסוף צינורות או מצינוריות-חייג אינן בריאה או ציסטות. כאן למדנו כליות 4-16 שבועות חולדות PCK ישנים 10,13. 1. צינוריות מגזרי בידוד של ציסטות בכליות וקשיות חיבור (CNT) / איסוף (CD) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים בעלי חיים ניסיוניים עם isoflurane (אינדוקציה 5%, 1.5 עד 2.5% אחזקה) / O כיתה רפואי 2 או שיטה שאושרה עוד. בעלי חיים חייבים להיות במעקב רציף על מנת להבטיח le ההולםvel של הרדמה. תגובת קמצוץ שיעור ובוהן נשימה יציבה משמשות כדי לאשר הרדמה מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע laparotomy ולשטוף את הכליות עם מי מלח פוספט (PBS) דרך אב העורקים בבטן 17. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קטטר צינורות פוליאתילן (PE50) ולחבר אותו למשאבת מזרק מלאה PBS. חותך את העור וקיר בטן לאורך Linea alba, ואז לעשות חתך רוחבי בבטן פני הבטן מצד לצד ולהעביר את אברי בטן עם צמר גפן כדי לקבל גישה לאב העורקים היורדים עם הסתעפות עורקי mesenteric וצליאק. להרטיב את האיברים הפנימיים עם מי מלח חם במהלך הליכים נוספים כדי למנוע היובש שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מייתר אחד (מס &#39;1) סביב עורקי mesenteric וצליאק ומייתר אחר (מס&#39; 2) סביב אב העורקים מתחת לסרעפת (לא לקשור). בעדינות להפריד. abdominalis ידי להקהות לנתח רקמות חיבור סביבו עם מלקחיים דקים ומניח את שני חיבורים אותיות ~ 3מ&quot;מ מתחת לעורק הכליה השמאלי (# 3) ומעל הסתעפות עורקי הכסל (מס &#39;4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור # מייתר 4 ולצרף מהדק כלי סביב אב העורקים בין עורק הכליה השמאלי ומייתר # 3. עושה חתך בין המהדק ו# מייתר 4 לצנתר את אב העורקים, להשתמש מייתר # 3 כדי לתקן את הצנתר בתקיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את המהדק ולוודא כי דופק הדם גלוי בקטטר כדי להבטיח התקנה נכונה. התחל זלוף בשיעור של 6 מיליליטר / דקה, לקשור ליגטורה # 1 ומס &#39;2, ולחתוך את וריד הכליה השמאלי. המשך שטיפה במשך 1-2 דקות, עד שהאיברים החווירו לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים כלי דם כליות, שופכה ורקמות חיבור ושומן סביב במספריים כדי לאסוף את הכליות. לאחר מכן לבצע דמעה קצרה בכמוסה בכליות ולקלף את הכליות לdecapsulate. מניחים את הכליות לPBS קר כקרח. המתת חסד הוא אושר על ידי פתיחת בית החזה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5 X 5 שבבי זכוכית כיסוי מ&quot;מ מצופים בפולי-L ליזין. לחתוך בשטח בנוי כיסויss עם עיפרון יהלומים ומקום כ 20 μl של 0.01% פתרון פולי-L ליזין מסונן סטרילי על כל שבב זכוכית. הכן מלוח ושני זוגות מלקחיים שען לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הכליות בסכין גילוח במישור הקדמי לפרוסות של ~ 1-2 מ&quot;מ עובי. מניחים את הפרוסות אחת תחת סטראו. בידוד של רקמות צריך להיעשות במלוח קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר ציסטות תחת סטראו כחללים עגולה צורה (איור 2 א); הקירות שלהם לעתים קרובות מכילים רשת בולטת של כלי דם התרבו. קצו מלקחיים העדין באמצעות לנתח את שכבת האפיתל הפנימית של ציסטה דקה ככל האפשר כדי להשיג שטח שכבה. לצרף אותו לשבב זכוכית מכוסה בפולי-L ליזין. משטח פולי-L ליזין דביק מאפשר לחוקר למקם את שכבת ציסטה הפנימית על זכוכית בחוזקה. לחשוף את ציסטה עם הצד עד הפסגה כדי לספק גישה לטפטפות (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בילד PCK או החולדה SDפרוסות מרכזיות ניי מכילות papilla לבידוד של CNT / CCDsegments אינו מורחב 18-21. הערה: רקמות papillary הן עמידות יותר מקליפה ועל ידי החזקת להקות צינורי פפילרי עם מלקחיים וקריעות רדיאלי ציר פרוסה ניתן ביקעו לדק מגזרים. tubules פרט גלוי ויכול להיות שלף להיות ממוקם על שבבי זכוכית כיסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את מגזרי CNT / CCD ידי הסתעפויות, שקיפות גבוהה מצינוריות הפרוקסימלי ותאים גדולים בולטת לעין (איור 2 ג). מניחים את שבב מכסה זכוכית עם צינוריות המצורפות תחת מיקרוסקופ מצויד בmicromanipulators המתאימה לנהיגת micropipettes. שימוש micropipettes החד tubules מפוצל פתוח ולצרפם לקצות הזכוכית כדי להפוך את משטח הפסגה נגיש (איור 2 ד). </li></ol> אלקטרופיזיולוגיה 2. ערוץ יחיד תיקון מהדק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את תא תיקון- clamp עם פתרון אמבטיה ולהעביר את שבב מכסה הזכוכיתעם רקמות מבודדות לתא. ודא שיש לי micropipettes תיקון מהדק התנגדות של 7-10 MΩ למדידות אמינות בתאים (מצורף תא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדידות מצורפים תא, להגדיר את יחס רווח המגבר ל20x ונמוך לעבור הזרמים ב 300 הרץ על ידי מסנן שמונה-מוט בסל. לניטור ערוצי ENaC, להשתמש בפתרון אמבטיה, במ&quot;מ: 150 NaCl, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES (pH 7.4); פיפטה: 140 LiCl, 2 MgCl 2 ו -10 HEPES (pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל ניסוי תיקון- clamp קונבנציונלי במצב 10-מצורף תא. בחר תא בשכבת האפיתל ומתקרב לפיפטה קרום הפסגה. ליצור חותם גבוהה התנגדות בין פיפטה וקרום תא על ידי יישום שאיבה עדינה. ברגע שחותם gigaOhm עמיד גבוהה נוצר, פרוטוקול ללא פער בפוטנציאל החזקה יש להתחיל לפעילות ניטור של הערוץ של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתונים חנות פער ללא יחידים ערוץ הנוכחי מגיגהחותמות אוהם לניתוח שלאחר מכן. לנתח את אירועי הערוץ באמצעות חבילת תוכנה בדרך כלל מסופקת עם הגדרות תיקון מהדק 18. חישוב פעילות ערוץ כעמותה שבי N מתייחס למספר הערוצים הפעילים בo התיקון וP היא הסתברות פתוחה ממוצעת של הערוצים. הערה: השתמש בציסטות או צינוריות בודדות בניסויי תיקון מהדק לא יותר מ -30 דקות. </li></ol> 3. מדידות ratiometric epifluorescence של ריכוז סידן תוך תאים בתאי אפיתל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 5 מ&quot;מ פורע-2:00 מומסים DMSO. פתרון מניות Aliquot לתוך צינורות חרוטי 500 μl בודדים (כ -10 μl). להגן מפני אור ולאחסן במקפיא ב -20 מעלות עד שישה חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ציסטות מבודדות וtubules המפוצל פתוחה במשך 30-40 דקות בPSS (מ&quot;מ: 145 NaCl, 4.5 KCl, 2 MgCl 2, 2 CaCl 2 ו -10 HEPES ב- pH 7.35) המכיל 5 מיקרומטר צבע פורע-2 בבוקר ו0.05% חומצת pluronic כדי לעזור לפזר את אסטרים acetoxymethyl. לשם כך, רקמות מקום בצלחת 3.5 סנטימטר המכילות קוקטייל טעינה, להגן מפני אור ודגירה על שייקר איטי בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות פורע-2:00 מכיל תקשורת לנקות PSS לאחר דגירה ולמקם את הרקמה תחת מיקרוסקופ כדי לבצע הדמיה epifluorescence נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מצלמת CCD ומקור יציב אור (מערכת monochromator) מצויד בגלגל מסנן (כל עמדת מסנן יכולה להיות קשורה לרמה שלו הנחתה, שנבחרה בכל פעם שהמסנן נקרא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את הרקמה בשדה בהיר. לעבור לזיהוי של אותות הקרינה ולהתאים את עוצמת מקור האור באמצעות מסנני צפיפות ניטראליים ומנורת כוח כדי למנוע הרוויה של האות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג הפורע-2 הקרינה בבוקר בדגימת הרקמה עם עירור ratiometric בננומטר 340/380 בתדירות של 0.125 הרץ ומעלה. השתמש 40 × / עדשה אובייקטיבית NA 1.3 או דומה לresolu הנכוןתמונת tion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעיבוד תמונה וחישובים לייבא תמונה ברצף. ודא לפצל את הערוצים ולהשתמש בגווני אפור מצב hyperstack. בחר כמה אזורים של עניין (תאי ציסטה בודדת או אזורים נבחרים של רקמת פיברוזיס) ולחשב ערכי עוצמה לכל ערוץ (340 ו -380 ננומטר) לתוך תוכנת ניתוח נתונים העדיפה; ערכי עוצמת רקע לחסר מכל נקודת נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל נקודת זמן לחשב את היחס של עוצמות של 340-380 ערוצי הפורע-2 בבוקר. פיזור עלילה / קו שינויי נקודה-זמן של חולף Ca 2 + לכל איזור ולחשב ערכים / SE ממוצעים. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

שתארנו כאן יישומים של טכניקת תיקון- clamp הקונבנציונלית וסידן הדמיה epifluorescence לmonolayers אפיתל פיברוזיס נגזר ממודל גנטי בעכברים של ARPKD. הפרוטוקול מורכב משלושה שלבים, שרוב תשומת הלב צריך להיות משולם על הבידוד של ציסטות (שלב 1.5 של סעיף הפרוטוקולים) ומחקרי אלקטרו. נהלי מפתח אלה ?...

תעלות יונים לשחק תפקיד משמעותי בהרבה פונקציות פיסיולוגיות, כוללים צמיחת תאים והתמיינות. מחלות אוטוזומלית דומיננטיות ורצסיבי פוליציסטיות כליות (ADPKD וARPKD, בהתאמה) הן הפרעות גנטיות המתאפיינות בפיתוח של שלפוחיות מלאות נוזל כליות של מקור תאי אפיתל צינורי. ADPKD נגרמים על ידי מוטציות של גני PKD1 או PKD2 קידוד polycystins 1 ו -2 חלבונים, קרום מעורב בוויסות של התפשטות תאים והתמיינות. PKD2 על ידי עצמו או כמורכב עם PKD1 גם לתפקד כערוץ קטיון -permeable Ca 2 + 1. מוטציות של fibrocystin PKHD1 גן המקודד (חלבון כמו קולט-הקשורים cilia המעורב בtubulogenesis ו / או התחזוקה של קוטביות של אפיתל) הן הדחף הגנטי של ARPKD 2. צמיחת ציסטה היא תופעה מורכבת בליווי התפשטות מופרעת 3,4, אנגיוגנזה 5, dedifferentiation ואובדן הקוטבity של תאי צינורי 6-8. ספיגה פגומה והפרשה מוגברת באפיתל פיברוזיס לתרום להצטברות נוזלים בהרחבת הלום וציסטה 9,10. זרימה תלויה פגום [Ca 2 +] איתות אני כבר קשור גם לcystogenesis במהלך PKD 11-15. כאן, אנו מתארים שיטה מתאימה למדידות תיקון מהדק של פעילות ערוץ אחד וCa 2 + רמות תאיות בmonolayers אפיתל פיברוזיס מבודד מחולדות PCK. שיטה זו יושמה בהצלחה על ידינו לאפיין פעילות של ערוץ אפיתל Na + (ENaC) 10 ו[ Ca 2 +] אני -dependent תהליכים הנגרמים על ידי Ca 2 + TRPV4 -permeable ומפל איתות purinergic 13. במחקרים אלה השתמשנו חולדות PCK, מודל של ARPKD נגרמים על ידי מוטציה ספונטנית בגן PKHD1. זן PCK היה originally נובע מSprague-Dawley (SD) חולדות 16 חולדות ובכך SD משמשות כבקרה נאותה להשוואה עם מתח PCK. כתוצאה מכך, שני מגזרי SD עכברוש נפרון וצינורות איסוף מורחב שאינם מבודדים מאותו חולדות PCK יכולים לשמש כשתי קבוצות השוואה שונות לניסויים באפיתל פיברוזיס.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1015">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Fura-2 AM</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:183px;">F-14185</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Flou-8</td>
			<td style="width:219px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:183px;">21091</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">P4707</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Pluronic acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">F-68&#160;</td>
			<td style="width:333px;">solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Shaker</td>
			<td style="width:219px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:183px;">260350</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Light source</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">Lambda XL</td>
			<td style="width:333px;">with integrated shutter/filter wheel driver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Neutral density filters</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">ND4, ND8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Objective</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SFluo&#160;</td>
			<td style="width:333px;">40/1.3 DIC WD 0.22&#160;&#160; oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Camera</td>
			<td style="width:219px;">Andor Technologies</td>
			<td style="width:183px;">Zyla sCMOS</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:283px;">Nikon&#160; microscope (inverted)</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon Eclipse TE2000-S</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:183px;">6661B52</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Diamond pencil</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">22268912</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon NIS-Elements&#160;</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:219px;">ImageJ</td>
			<td style="width:183px;">http://imagej.nih.gov/</td>
			<td style="width:333px;">ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Patch Clamp amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Data Acquisition System</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:333px;">Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Low Pass Filter</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">LPF-8</td>
			<td style="width:333px;">8 pole Bessel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:219px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:183px;">1B150F-4</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:283px;">Micropipette Puller</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">P-97</td>
			<td style="width:333px;">Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microforge</td>
			<td style="width:219px;">Narishige</td>
			<td style="width:183px;">MF-830</td>
			<td style="width:333px;">Japan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Motorized Micromanipulator</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">MP-225</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Eclipse Ti</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microvibration isolation table</td>
			<td style="width:219px;">TMC</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">equipped with Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Multichannel valve perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">AutoMake Scientific</td>
			<td style="width:183px;">Valve Bank II</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Software</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">pClamp 10 . 2</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Temperature controlled surgical table&#160;</td>
			<td style="width:219px;">MCW core</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">for rodents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Binocular stereomicroscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SMZ745</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Syringe pump-based perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">polyethylene tubing</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">PE50</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Isofluorane anesthesia</td>
			<td style="width:219px;"><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a></td>
			<td style="width:183px;">911103</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Other basic reagents</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium

ייזום ציסטה והתרחבות במחלת כליות פוליציסטיות הוא תהליך מורכב המתאפיין בהפרעות בשגשוג תאי צינורי, הצטברות נוזלים והיווצרות luminal מטריקס. פעילות של תעלות יונים ואיתות סידן תוך תאי פרמטרים פיסיולוגיים מפתח הקובעים פונקציות של האפיתל צינורי. אנחנו פיתחנו שיטה מתאימה לתצפית בזמן אמת של פעילות תעלות יונים עם טכניקת תיקון מהדק ורישום של Ca 2 + רמה תאית בmonolayers אפיתל המבודדים טרי מציסטות כליות. חולדות PCK, מודל גנטי של מחלה אוטוזומלית רצסיבית פוליציסטיות כליות (ARPKD), שמשו כאן לניתוח vivo לשעבר של תעלות יונים ושטף סידן. שתואר כאן הוא הליך צעד-אחר-צעד מפורט שנועד לבודד את monolayers פיברוזיס וצינוריות-מורחב שאינם מPCK או חולדות נורמליות ספראג Dawley (SD), ולעקוב אחר פעילות ערוץ אחד וCa 2 + דינמיקה תאית.שיטה זו אינה דורשת עיבוד האנזימטית ומאפשרת ניתוח בהגדרת יליד monolayer אפיתל מבודד טרי. יתר על כן, טכניקה זו היא רגישה מאוד לשינויי סידן תוך תאי ויוצרת תמונות ברזולוציה גבוהות למדידות מדויקות. לבסוף, האפיתל פיברוזיס המבודד יכול לשמש עוד לצביעה עם נוגדנים או צבעים, הכנת תרבויות עיקריות וטיהור למבחנים ביוכימיים שונים.

מעורבות ENaC פוטנציאלית בcystogenesis הודגמה על ידי מספר מחקרים שנצפו גורם גדילה באפידרמיס שיבש (EGF) איתות בהתקדמות PKD 22-25 וספיג החוזר של סודיום חריג בARPKD מודלים עכברי ותרביות רקמת 26-28. לדוגמא, Veizis et al. הראה כי קליטת amiloride רגישה Na + היא ירידה בתאי CD ממודל הע?...

Watch this Scientific Journal Video about Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium at JoVE.com

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

תעלות יונים מתבטאות באפיתל צינורי הכליות לשחק תפקיד משמעותי בפתולוגיה של מחלת כליות פוליציסטיות. כאן אנו מתארים פרוטוקולי ניסוי המשמשים לביצוע מדידות וניתוח רמת סידן תוך תאי תיקון מהדק באפיתל פיברוזיס המבודדים טרי מכליות מכרסמים.

יישום הצמד תיקון והחי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפקח על מאפיינים פונקציונליים של מבודד טרי PKD האפיתל

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

implementing-patch-clamp-live-fluorescence-microscopy-to-monitor

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Views.  Medical College of Wisconsin.  תעלות יונים מתבטאות באפיתל צינורי הכליות לשחק תפקיד משמעותי בפתולוגיה של מחלת כליות פוליציסטיות. כאן אנו מתארים פרוטוקולי ניסוי המשמשים לביצוע מדידות וניתוח רמת סידן תוך תאי תיקון מהדק באפיתל פיברוזיס המבודדים טרי מכליות מכרסמים. 

Video: Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

שיטות הצמד תיקון הקלטות קיבול מן Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

לחץ לליטוש pipettes עבור Patch-clamp הקלטה משופרים

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

הכנת Liposome ענקית הדמיה ותיקון מהדק Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

כינונה מחדש של חלבון טראנסממברנלי, יון ערוץ מתח מגודרת, KvAP, לענק Unilamellar שלפוחית ​​למיקרוסקופי וצמד תיקון ללימודים

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

ערוץ יחיד הדמיה ניתוח וסידן בPodocytes של glomeruli מבודדת טרי

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...