עבודה זו מומנה על ידי NIH RO1 AI079253 ומחלקה לענייני יוצאי הצבא.

1. מודלים של בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים: השתמשו p47 phox-/ - עכברים ועכברי גיל ומין בהתאמת C57BL6/DBA. לקבל אישור לניסויים מטיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדה ושימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדמה: השתמש במערכת ממשל isoflurane מתמשכת כדי לגרום הרדמה. מערכת האידוי (VetEquip) מלאה בisoflurane (2-3%). אשר שהעכברים מורדמים באופן מלא על ידי התבוננות בנשימה, תנועה, ורפלקס הקרני בתגובה לגירויים חיצוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוחים: לשפשף את אזור הניתוח (benchtop) עם אתנול 70%. ללבוש כפפות סטריליות וחלוק ניתוחים נקיים ומסכה. הכן את העכברים על ידי גזירת שיער ויישום פולידין לסירוגין עם אתנול 70% לאזור שבו יבוצע החתך. ביצוע ניתוח על משטח סטרילי ולהשתמש בכלים סטריליים. עכברי Monitor לאחר operatively עד ער ולנוע בחופשיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממשל zymosan Intratracheal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל הרדמהכפי שמתואר ב1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את אזור ניתוח (בצוואר) עם פולידין ו70% אתנול ולחשוף את קנה הנשימה על ידי נתיחה כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירס קנה נשימה עם מחט 27-מד ולהזריק zymosan (סנט לואיס, מיזורי) במינון של 1 מיקרוגרם / g באמצעות 0.5 מיקרוגרם / μl פתרון (סך הכל 50 μl נפח לעכבר 25 גרם) מומס בPBS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צוואר עכברים סגור פצע עם 5-0 תפרי משי בתנאים סטריליים אספטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה לאחר 4 שעות ו 24 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקשירה ולנקב Cecal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל הרדמה כמתואר ב1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפ שיער באזור הניתוח (בטן) ולחטא עם פולידין ו70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע laparotomy קו אמצע ולזהות cecum. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור 50% הדיסטלי של cecum נחשף עם תפר משי 4-0 וcecum לנקב דיסטלי לקשירה עם מעבר אחד של מחט 21-מד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתפור את החתך בתפרי משי סטריליים 4-0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה לאחר 4 שעות ו24 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוראלי פחמן טטרא (CCl 4) ממשל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל הרדמה כמתואר ב1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל CCl 4 (2 מיקרוגרם / גרם, סנט לואיס, מיזורי) מומס בשמן תירס ידי gavage האוראלי. ההליך של CCl4 ממשל צריך להתבצע באזור מיועד בהתאם למדיניות IBC / EHS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה לאחר 4 שעות ו 24 שעות. </li></ol></li></ol> 2. רכישת תמונת bioluminescent <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאתחל את מערכת IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) הדמיה, מוגדרת למצב הארה, ולחכות למכשיר תשלום המצמיד (CCD) הטמפרטורה לנעול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר זמן חשיפה, binning (בינוני) וF / עצירה (8) הגדרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי מקום במצב שכיבה בחדר ההדמיה בשלב מחומם כדי לשמור על טמפרטורת גוף תקינה. לנהל הרדמה כמתואר ב1.2 באמצעות חרטום בעוד עכברים נמצאים בחדר הדמית IVIS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל L-012<html> (20 מיקרוגרם / גרם) מומס סטרילי PBS (10 מיקרוגרם / μl) לוריד באמצעות הזרקת רטרו מסלולית בכל נקודת זמן שנבחרה להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות המתחילות ב 2 דקות לאחר-012 ליטר הזרקה. אנו משתמשים בדרך כלל חשיפת 40 שניות. </li></ol> 3. ניתוח נתונים באמצעות אזור של עניין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הנתונים באמצעות תוכנת תמונת חי v.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח תמונה ובחר מדידה של האזור של כלי ריבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר האזור בצורת ריבית וגודל מעל חזה או / ובטן לאחר שכיסה תמונה דיגיטלית פסאודו צבעונית (המייצג זיהוי פוטון) על דימוי מצולם של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת עוצמת אות (פוטון שטף) מהאזור של עניין. </li></ol> 4. סטטיסטיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחבילת תוכנת ניתוח סטטיסטית כדי לבצע ANOVA דו כיוונית עם פוסט בדיקות Bonferroni בנקודתי זמן בודדות. </li></ol>TLE &quot;&gt; 5. נציג תוצאות Zymosan הוא מוצר פרו דלקתי תא שמרים קיר וactivator חזק של מונואמין NADPH 3. אנחנו הראינו בעבר כי zymosan intratracheal גורם דלקת חזקה יותר neutrophilic ריאות וייצור ציטוקינים פרו דלקתי בp47 phox-/ - בהשוואה לעכברי wildtype 1. כאן, המטרה שלנו הייתה להשוות דור ROS ריאות של wildtype וp47 phox-/ - העכברים בעקבות אתגר zymosan. ב 4 שעות לאחר מתן zymosan intratracheal, אנו נצפינו עלייה משמעותית בפליטת פוטון על החזה בעכברים בהשוואה לתחילת המחקר wildtype כמו גם עלייה בפליטת הפוטון בwildtype לעומת p47 phox-/ - עכברים ב4 שעות ו 24 שעות. לעומת זאת, אותות פליטת אור בp47 phox-/ - עכברים נשארו ברמת הבסיס ב 4 שעות לאחר טיפול zymosan (תמונת 1 א.ב.). לפיכך, מונואמין NADPH נראה בדואר המקור העיקרי של דור ROS את הריאות בעקבות ממשל zymosan. בשלב הבא, הערכנו ייצור ROS במודל אלח דם CLP-Induced. אלח דם הוא תסמונת מסכנת חיים קשורים בפגיעת קצה איבר, כולל פציעה אקוטית ריאות (עליי) ותסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) 4, 5. פציעת ROS בתיווך כבר נחשב לגורם חשוב בתפקוד נהיגת אלח דם מושרה מרובי איברים. מצאנו כי ROS הוגדלו באופן משמעותי על החזה (4 שעות) ועל הבטן (24 שעות) לאחר CLP בעכברי wildtype לעומת תחילת מחקר. עם זאת, רמות ROS בp47 phox-/ - עכברים היו דומות לרמת הבסיס בשתי נקודתי זמן (Fig.2 AC). תוצאות אלו מראות כי דור ROS במודל עכבר אלח דם CLP-Induced הוא NADPH אוקסידאז תלוי. לבסוף, השתמש הדמית bioluminescent לזהות ייצור ROS במצב פגיעה בכבד 4-מושרה CClאני. CCl 4 גורם נימק hepatocellular, ומאז משמש למודל גם פגיעה בכבד חריף וסיסטיק הכבד 6. בניגוד למודלים שתוארו לעיל של דלקת ופגיעה, מצא כי ייצור ROS בבטן היה בצניעות (כ 35%) עלה מעל קו הבסיס בp47 phox-/ - עכברים ב4 שעות לאחר 4 ממשל CCl. עם זאת, סדר הגודל של 4-CCl המושרה ROS הדור היה גדול באופן משמעותי בעכברי wildtype מאשר בp47 phox-/ - עכברים (איור .3 א.ב.). נתונים אלה מצביעים על כך שגם דור ROS p47 phox המכיל NADPH תלוי-אוקסידאז ועצמאי מתרחשים בCCl האקוטי פגיעה בכבד 4-מושרה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig1.jpg" /> איור 1. ייצור ROS בריאות לאחר טיפול zymosan. א) הנציג bioluminescence הדמיה של ייצור ROS. שים לב שבנוסף לחזה, הארה ניתן לזהות על הבטן ובהן wildtype p47 phox-/ - עכברים והארת בטן היא ללא שינוי על ידי טיפול zymosan. B) ספירת פוטון מהחזה של wildtype וp47 phox-/ - עכברים לאחר זריקה אחת intratracheal (IT) של zymosan. הדמית פליטת אור בוצעה בתחילת מחקר, 4 שעות, 24 שעות ו. פליטת אור מהאזור של עניין על החזה זוהתה באמצעות סולם המצוין פסאודו צבע. תוצאות מוצגות כממוצע ± SE, n = 6-9 לקבוצה, * = p &lt;0.05. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לקבלת דמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig2.jpg" /> איור 2. איתור ROS בעקבות CLP. ) הדמית פליטת אור נציג של ROS ייצור, Bספירה) פוטון מהחזה, ו-C) ספירת פוטון מהבטן של wildtype וp47 phox-/ - העכברים בתחילת מחקר, 4 השעות, 24 שעות ולאחר CLP. תוצאות מוצגות כממוצע ± SE, n = 4-5 לקבוצה, * = p &lt;0.05. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לקבלת דמות גדולה.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig3.jpg" /> איור 3. ייצור ROS בבטן לאחר CCl פגיעה בכבד 4-מושרה. ) הדמית פליטת אור נציג ייצור ROS וB) ספירת פוטון מהבטן של wildtype וp47 phox-/ - עכברים בתחילת מחקר, 4 שעות, 24 שעות ולאחר 4 טיפול CCl אוראלי. תוצאות מוצגות כממוצע ± SE;. N = 4-5 לקבוצה, * = p &lt;0.05 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לקבלת דמות גדולה</a> </&gt;.

<ol>
	<li>Segal, B., Han, W., Bushey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+limits+innate+immune+response+in+the+lungs+in+mice.">NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice.</a> PLoS ONE. 5, e9631 (2010).</li><li>Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p47phox+mouse+knock-out+model+of+chronic+granulomatous+disease.">The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease.</a> J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995).</li><li>Gantner, B. N., Simmons, R. M., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+induction+of+inflammatory+responses+by+dectin-1+and+Toll-like+receptor+2.">Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2.</a> J. Exp. Med. 197, 1107-1117 (2003).</li><li>Dejager, L., Pinheiro, I., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cecal+ligation+and+puncture:+the+gold+standard+model+for+polymicrobial+sepsis.">Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis.</a> Trends Microbiol. 19, 198-208 (2011).</li><li>Tsiotou, A. G., Sakorafas, G. H., Bramis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septic+shock;+current+pathogenetic+concepts+from+a+clinical+perspective.">Septic shock; current pathogenetic concepts from a clinical perspective.</a> Med. Sci. Monit. 11, 76-85 (2005).</li><li>Fujii, T., Fuchs, B. C., Tanabe, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+carbon+tetrachloride+induced+liver+fibrosis:+Histopathological+changes+and+expression+of+CD133+and+epidermal+growth+factor.">Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor.</a> BMC Gastroenterology. 10, 79-90 (2010).</li><li>Kubo, H., Morgensterm, D., Doerschuk, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+complement-induced+lung+injury+in+mice+with+deficiency+of+NADPH+oxidase.">Preservation of complement-induced lung injury in mice with deficiency of NADPH oxidase.</a> J. Clin. Invest. 97, 2680-2684 (1996).</li><li>Segal, B., Sakamoto, N., Bulkley, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthine+oxidase+contributes+to+host+defense+against+Burkholderia+cepacia+in+the+p47(phox-/-)+mouse+model+of+chronic+granulomatous+disease.">Xanthine oxidase contributes to host defense against Burkholderia cepacia in the p47(phox-/-) mouse model of chronic granulomatous disease.</a> Infect Immun. 68, 2374-2378 (2000).</li><li>Droge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+in+the+physiological+control+of+cell+function.">Free radicals in the physiological control of cell function.</a> Physiological reviews. 82, 47-95 (2002).</li><li>Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radical-free+biology+of+oxidative+stress.+American+journal+of+physiology.">Radical-free biology of oxidative stress. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 295, C849-C868 (2008).</li><li>Hubbard, W. J., Choudhry, M., Chaudry, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cecal+ligation+and+puncture.">Cecal ligation and puncture.</a> Shock. 24, 52-57 .</li><li>Wardman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+and+luminescent+probes+for+measurement+of+oxidative+and+nitrosative+species+in+cells+and+tissues:+progress,+pitfalls,+and+prospects.">Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects.</a> Free Radic. Biol. Med. 43, 995-1022 (2007).</li><li>Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+X-linked+chronic+granulomatous+disease,+an+inherited+defect+in+phagocyte+superoxide+production.">Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production.</a> Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).</li><li>Aramaki, Y., Y, ., Yoshida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+sensitive+chemiluminescence+probe,+L-012,+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells.">A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 554-559 (1993).</li><li>Daiber, A., Oelze, M., August, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+superoxide+and+peroxynitrite+in+model+systems+and+mitochondria+by+the+luminol+analogue+L-012.">Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012.</a> Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).</li><li>Kielland, A., Blom, T., Nandakumar, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+inflammation+using+the+luminescent+probe+L-012.">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012.</a> Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

מדידה &quot;בזמן אמת&quot; של מיני חמצן תגובתי (ROS) בבעלי חי חיים יכולה להיות מושגת על ידי שימוש בבדיקות ניאון וchemiluminescent. בעוד בדיקות ניאון סובלות מצורך יחסי אות לרעש חלשים 12, טכניקת ההדמיה תארה היא רגישה יותר לזיהוי של פליטת אור בעקבות תגובה כימית של ROS עם מצע לומינול ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> L-012 </td><td> Wako כימיקלי ארה&quot;ב, Inc </td><td> 120-04891 </td><td></td></tr><tr><td> Zymosan </td><td> סיגמא, סנט לואיס, מיזורי </td><td> Z4250 </td><td></td></tr><tr><td> פחמן טטרא </td><td> סיגמא, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 289116 </td><td></td></tr></tbody></table>

bioluminescence imaging of nadph oxidase activity in different animal models

מונואמין NADPH הוא אנזים שמתווך הגנה מארחת ואנטיבקטריאלי נגד פטריות. בנוסף לתפקידה בהגנה מארחת מיקרוביאלית, מונואמין NADPH יש פונקציות קריטיות איתות המווסתות את התגובה הדלקתית 1. לכן, הפיתוח של שיטה למדידה ב&quot; בזמן אמת &quot;קינטיקה של דור ROS אוקסידאז המופק NADPH צפוי להיות כלי מחקר חשוב להבנת מנגנונים רלוונטיים לארח הגנה, דלקת, ופציעה. מחלה כרונית granulomatous (CGD) היא הפרעה תורשתית של מונואמין NADPH מתאפיין זיהומים קשים ודלקות מוגזמות. הפעלה של מונואמין NADPH תא בלען דורשת טרנסלוקציה של יחידות המשנה שלה cytosolic (p47 phox, P67 phox, וp40 phox) וRAC לflavocytochrome קרום נכנס (מורכב מgp91 phox וp22 phox heterodimer). פסדפונקציה של מוטציות בכל אחד מאלה תוצאת רכיבי מונואמין NADPH בCGD. בדומה לחולים עם CGD, gp91 עכברים phox-p47 לקויים ועכברים phox-חסרים לי פגום פעילות תא בלען NADPH אוקסידאז ומארח לקוי הגנה 13, 14. בנוסף לphagocytes, המכיל את רכיבי מונואמין NADPH שתוארו לעיל, מגוון של סוגי תאים אחרים להביע isoforms השונה של מונואמין NADPH. כאן, אנו מתארים שיטה לכמת ייצור ROS בעכברים חיים ולהתוות את התרומה של מונואמין NADPH לדור ROS במודלים של דלקת ופגיעה. שיטה זו מבוססת על ROS מגיב עם L-012 (אנלוגי של לומינול) לפלוט הארה שנרשמה על ידי מכשיר תשלום מצמיד (CCD). בתיאור המקורי של חללית L-012, L-012 chemiluminescence תלוי בוטל לחלוטין על ידי dismutase superoxide, המציין כי ROS העיקרי זוהה בתגובה זה היה סופראניון תחמוצת 15. מחקרים מאוחרים יותר הראו כי L-012 יכולים לזהות רדיקלים חופשיים אחרים, כולל מינים תגובתי חנקן 16, 17. Kielland et al. 17 הראה כי יישום המקומי של יצטט phorbol myristate, activator החזק של מונואמין NADPH, הוביל לדור מונואמין NADPH התלוי ROS שניתן היה לזהות בעכברים באמצעות חללית זורח L-012. במודל זה, הם הראו כי הארת L-012-תלויה בוטלה בעכברי p47 phox-לקויים. אנחנו לעומת דור ROS בעכברי wildtype וNADPH אוקסידאז-p47 לקוי phox-/ - עכברים 2 בשלושת הדגמים הבאים: 1) ממשל intratracheal של zymosan, תא פרו דלקתי פטרייתי המופק מקיר מוצר שיכול להפעיל מונואמין NADPH: 2) קשירת cecal ולנקב (CLP), מודל של אלח דם תוך בטנים עם דלקת ריאות חריפות משניות ופציעה; ו3) פחמן טטראכלורי האוראלי(CCl 4), מודל של פגיעה כבדית ROS תלויה. מודלים אלה נבחרו במיוחד כדי לבדוק את דור ROS מונואמין NADPH תלוי בהקשר של דלקת שאינה זיהומית, אלח דם polymicrobial, ופציעת איבר רעל מושרה, בהתאמה. השוואת פליטת אור בעכברי wildtype לp47 phox-/ - עכברים מאפשר לנו להתוות את התרומה הספציפית של ROS שנוצרה על ידי p47 מונואמין NADPH phox המכיל לאות bioluminescent בדגמים אלה. תוצאות הדמית פליטת אור שהפגינו רמות גבוהות ROS בעכברי wildtype לעומת p47 phox-/ - עכברים הצביעו על כך שמונואמין NADPH הוא המקור העיקרי של דור ROS בתגובה לגירויים דלקתיים. שיטה זו מספקת גישה זעירה פולשנית לניטור &quot;בזמן אמת&quot; של דור ROS במהלך הדלקת בגוף חי.

Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models at JoVE.com

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

מונואמין NADPH הוא המקור העיקרי של מיני חמצן תגובתי (ROS) בphagocytes. בשל האופי הארעי של ROS, קשה למדוד ולעקוב אחר רמות ROS חי חיות. שיטה פולשנית לכימות סידורית של ROS בעכברים חיים מתוארת.

הדמית פליטת אור של פעילות מונואמין NADPH במודלים של בעלי חיים שונים

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

bioluminescence-imaging-nadph-oxidase-activity-different-animal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.1K Views.  Vanderbilt University School of Medicine. מונואמין NADPH הוא המקור העיקרי של מיני חמצן תגובתי (ROS) בphagocytes. בשל האופי הארעי של ROS, קשה למדוד ולעקוב אחר רמות ROS חי חיות. שיטה פולשנית לכימות סידורית של ROS בעכברים חיים מתוארת.

Video: Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice

Internal and external parasites remain a significant concern in laboratory rodent facilities, and many research facilities harbor some parasitized animals. Before embarking on an examination of animals for parasites, two things should be considered. One: what use will be made of the information collected, and two: which test is the most appropriate. Knowing that animals are parasitized may be something that the facility accepts, but there is often a need to treat animals and then to determine the efficacy of treatment. Parasites may be detected in animals through various techniques, including samples taken from live or euthanized animals. Historically, the tests with the greatest diagnostic sensitivity required euthanasia of the animal, although PCR has allowed high-sensitivity testing for several types of parasite. This article demonstrates procedures for the detection of endo- and ectoparasites in mice and rats. The same procedures are applicable to other rodents, although the species of parasites found will differ.

This article describes various procedures for screening rats and mice to detect endo- or ectoparasitism. Several diagnostic assays will be demonstrated, both those suitable for use on live animals and those used after euthanasia of the animal. Photographs to aid in identification of rat and mouse parasites will be included.

אבחון חיצוני ו Endoparasites בחולדות מעבדה ועכברים

Internal and external parasites remain a significant concern in laboratory rodent facilities, and many research facilities harbor some parasitized ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

לטווח ארוך Intravital multiphoton מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיסוני בבריאים וחולה כבד באמצעות עכברים CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

בידוד והשתלה של שתלי הרתי Murine בני שונים.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

הדמיה פליטת אור כדי לזהות זיהום בשלב מאוחר של מחלת השינה

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to the frequent failure of traditional antibiotic treatments. Alternative therapeutics are urgently needed to tackle MDR bacteria.
An innovative non-antibiotic approach, antimicrobial blue light (aBL), has shown promising effectiveness against MDR infections. The mechanism of action of aBL is not yet well understood. It is commonly hypothesized that naturally occurring endogenous photosensitizing chromophores in bacteria (e.g., iron-free porphyrins, flavins, etc.) are excited by aBL, which in turn produces cytotoxic reactive oxygen species (ROS) through a photochemical process.
Unlike another light-based antimicrobial approach, antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), aBL therapy does not require the involvement of an exogenous photosensitizer. All it needs to take effect is the irradiation of blue light; therefore, it is simple and inexpensive. The aBL receptors are the endogenous cellular photosensitizers in bacteria, rather than the DNA. Thus, aBL is believed to be much less genotoxic to host cells than ultraviolet-C (UVC) irradiation, which directly causes DNA damage in host cells.
In this paper, we present a protocol to assess the effectiveness of aBL therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in a mouse model of burn injury. By using an engineered bioluminescent strain, we were able to noninvasively monitor the extent of infection in real time in living animals. This technique is also an effective tool for monitoring the spatial distribution of infections in animals.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

In vivo חקירת טיפול באור כחול אנטימיקרוביים multidrug עמידים baumannii Acinetobacter צרוב דלקות באמצעות הדמיה פליטת אור

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo fluorescence optical imaging (OI), in two different mouse models of inflammation: a rheumatoid arthritis (RA) and a contact hypersensitivity reaction (CHR) model. Light with a wavelength in the near infrared (NIR) window (650 - 950 nm) allows a deeper tissue penetration and minimal signal absorption compared to wavelengths below 650 nm. The major advantages using fluorescence OI is that it is cheap, fast and easy to implement in different animal models.
Activatable fluorescent probes are optically silent in their inactivated states, but become highly fluorescent when activated by a protease. Activated MMPs lead to tissue destruction and play an important role for disease progression in delayed-type hypersensitivity reactions (DTHRs) such as RA and CHR. Furthermore, MMPs are the key proteases for cartilage and bone degradation and are induced by macrophages, fibroblasts and chondrocytes in response to pro-inflammatory cytokines. Here we use a probe that is activated by the key MMPs like MMP-2, -3, -9 and -13 and describe an imaging protocol for near infrared fluorescence OI of MMP activity in RA and control mice 6 days after disease induction as well as in mice with acute (1x challenge) and chronic (5x challenge) CHR on the right ear compared to healthy ears.

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper explains the application of fluorescent imaging using an activatable optical imaging probe to visualize the in vivo activity of key matrix metalloproteinases in two different experimental models of inflammation.

לא פולשני<em&gt; בויבו</em&gt; פלואורסצנטי הדמיה אופטית של פעילות MMP דלקתית באמצעות Activatable פלואורסצנטי סוכן הדמיה

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

הדמיה חיה של פעילות אנטי פטרייתי על ידי אדם מן המעלה הראשונה נויטרופילים ומונוציטים בתגובה<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

זיהוי של כיבוש Escherichia Coli Enterohemorrhagic מאתר מארח על-ידי המערכת לא פולשנית In Vivo ביולומינסנציה

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...