Name: isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.
Uploaded: 2015-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts. at JoVE.com

This work was supported by funding received from the National Institutes of Health (1R01AI083269).

המחקרים בעכברים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת צפון קרוליינה בצ&#39;פל היל וכל הטיפול בבעלי החיים היה בהתאם להנחיות IACUC. 1. הכנת היילוד והמבוגרים Thymi <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל חומרים כימיים וציוד לפני הרדמת חסד עכברים תורמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מכשירי ניתוח על ידי מעוקר או שיטות מתאימות אחרות. כל הניתוחים חייבים להתבצע בזרימה למינרית לשמור על תנאים סטריליים ולמנוע זיהום. להרכיב את הכלים דרושים להפקת thymi מעכברי תורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא צלחת 60 מ&quot;מ עם סטרילי 1X PBS (pH 7.4) ומניח על קרח בתוך מכסה המנוע. זה ישמש לthymi חנות בקצרה נכרת מעכברי תורם לפני ההשתלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם להנחיות אתיות, להרדים עכברי תורם יילוד על ידי עכברי עריפת ראש ותורם למבוגרים על ידי CO 2 מחנק ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לremoval של התימוס: הנח את העכבר במצב שכיבה על גב מגבת נייר סופג סטרילית ולרסס עם אתנול 70% לפני ביצוע חתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את חלל הבטן ובית חזה על ידי ביצוע חתך קו האמצע דרך העור. מקפלים את העור מעל החזה וforelimbs כדי לחשוף את חלל בית החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות שני חתכים רוחב דרך הסרעפת ובית החזה כדי לחשוף חלל החזה מעולה וקדמי חלל בית חזה. התימוס צריך להיות גלוי כשתי אונות הלבנות מייד לעיל וצמוד ללב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד את רקמות חיבור המקיפות את בלוטת התימוס עם מלקחיים בסדר, מה שהופך את מסוים לא לשבש את הכמוסה. בעוד מתאפק בית החזה עם מלקחיים, להשתמש זוג שני של מלקחיים כדי לחלץ שתי אונות של בלוטת התימוס ידי מיקום מלקחיים מעוקלים מתחת לאיבר ומושך בצורה אנכית. ניתן לעשות זאת באמצעות היקף ניתוחים לחילוץ thymi מעכברים שזה עתה נולד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התימוס בdi 60 מ&quot;מsh מכיל סטרילי 1X PBS (pH 7.4) על קרח ואונות הרתי נפרדות על ידי חיתוך דרך מצר החיבור. הסר את כל פסולת מהאונות הרתי ביצוע מסוים שלא לפגוע בכמוסה, ולחתוך את התימוס למספר המתאים של חלקים להשתלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל לתפעל thymi התקבל מעכברים שזה עתה נולד. הערה: משמשת למקסימום של שני עכברי נמען (אונה 1 למקבל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתלת thymi התקבל מעכברים בוגרים למקסימום של 4-6 עכברי נמען. בעזרת זוג המלקחיים, לתפוס בזהירות אונת הרתי מבוגר אחד, כפי שמוצג באיור 1, חתך התימוס לשלושה חלקים שווים באמצעות מספריים כירורגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.3-1.4 עבור כל עכבר תורם. על מנת להגביל את הזמן thymi נחשפים, להכין התימוס תורם 1 בכל פעם. </li></ol> 2. קורנית השרשה תחת הקפסולה הכליות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את הציוד מעוקר מראש המפורטים בטבלה 1. ספטית פרופרטכניקה צריכה להיות מנוצלת במהלך ההליך כדי למנוע חשיפת השתלת נמענים לכלים או חומרים כימיים מזוהמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההשתלה, לשקול ולתייג כל עכבר נמען. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מיקרוסקופ לנתח ומעגל הרדמה בזרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש במכונת גילוח חשמלי, לגלח את הצד השמאלי של עכבר הנמען ולהבטיח שאין שיער נשאר מסביב לאזור המשמש לחתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מאדה isofluorane ולהרדים את העכבר באמצעות מינון של בין 1-2%. לברר הרדמה מתאימה לפני תחילת ההליך הכירורגי על ידי בדיקת עדר רפלקס הבא קמצוץ הבוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העכבר הוא הרדים כראוי, להחיל משחה וטרינרים לעיניים של העכבר כדי למנוע יובש ולהכין את העכבר להשתלה באופן הבא: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העכבר תחת מיקרוסקופ לנתח במצב שכיבה לרוחב תקין כך שהצד המגולח פונה כלפי מעלה. Starting במרכז אזור הניתוח, לוותר בתנועה מעגלית באמצעות אתנול 70% פיפטה העברה חד פעמית, ואחריו povidone- יוד (בבטאדין). חזור על הטיפול באתנול / בטאדין 3 פעמים לפני ביצוע חתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספריים לנתח באמצעות לעשות חתך אגף 1-2 סנטימטר ישירות מעל הכליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בינוניים לתפוס רקמות חיבור סמוכות לכליות ועדינות להרים את הכליות, כך שהוא נמצא על גבי השרירים. כדי לשמור על הכליות חשופות ובמקום מעל השרירים, להכניס יד אחת של מלקחיים בינוניים מתחת לכליות, תשומת לב מיוחדת לא לשבש את הכסל הכליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת למנוע התייבשות רקמות, להשקות את הכליות עם סטרילי 1X PBS (pH 7.4) בכל שלב, עד מניפולציה של הקפסולה הכליות וכליות הוא מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר לצבוט ולהרים את הקפסולה בסמוך לקצה של הכליה דיסטלי ביותר לבלוטת יותרת הכליה כדי להפריד אותה מהכליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מד 18מחט לעשות חתך גדול מספיק כדי להכניס את פיסת התימוס תורם (איור 2 א) מוכנה. ודא לשמור חתך קופסית קטן ככל האפשר כדי למנוע פריקה של השתל לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך שמירה על הכמוסה התרחקה מהכליות, להשתמש זוג שני של מלקחיים בסדר להכניס את השתל מתחת לכמוסה ולדחוף את התימוס ככל קדימה מחתך קופסית ככל האפשר (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המלקחיים מתחת לכליה, ובעדינות לחזור הכליות בחזרה למקום דרך החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את השרירים על ידי תפירת קיר הבטן ויישום בטאדין נסגר פעם אחת. לאחר התפירה היא מלאה, להחיל קליפים פצע כדי לסגור את הדרמיס ולהחיל בטאדין לסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את העכבר לכלוב שכבר חימם באמצעות מנורת חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג כל עכבר שלאחר ניתוח עד שהוא חוזר להכרה וניידות מלאה ואל תניח tha עכבריםלא לא התאושש הבא הרדמה לתוך כלוב עם בעלי חיים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את העכברים עם תרופות לאחר ניתוח טיפול בכאבים בהתאם לצורך. לספק עכברים עם משככי כאבים שלאחר ניתוח כגון פרצטמול במי השתייה בריכוז של 1.6 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.3-2.9 עבור כל עכבר נמען. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שתמורת עכברים לפעילות רגילה תוך שלאחר ניתוח 1 שעה. צג משקל לאחר ניתוח, כישורים מוטוריים, כמו גם את פעילות השתייה והאכלה של כל עכבר כדי לקבוע סיבוכים הנובעים כתוצאה מהליך ההשתלה. הערה: ירידה במשקל לאחר ניתוח, בהשוואה למשקל טרום ניתוחי, כמו גם ניידות שינתה או כישלון לאכול או לשתות עשוי להצביע על סיבוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג הכינון מחדש של תאי T בדם היקפי על ידי דימום עכברים באמצעות זנב ניק ואחרי הפרדה של לימפוציטים באמצעות מדיה הפרדת תא Lympholyte על פי המפרט של היצרן. להשיג characteriza תא Ttion על ידי צביעה לימפוציטים עם נוגדנים מצומדות fluorescently ספציפיים לתא T סמני CD3, CD4, CD8 ו, כמו גם מאבחן מת חי כגון succinimidyl אסתר מופעלת fluorescently 8. ניתוח כפי שמוצג באיור 3 ניתן להשיג באמצעות gating על singlets, תאי חיים, ותאים חיוביים CD3. </li></ol>

<ol>
	<li>Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+tolerance+by+clonal+elimination+in+the+thymus.">T cell tolerance by clonal elimination in the thymus.</a> Cell. 49 (2), 273-280 (1987).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).</li><li>Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+and+negative+selection+of+the+T+cell+repertoire:+what+thymocytes+see+(and+don&#8217;t+see).">Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don&#8217;t see).</a> Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).</li><li>Schwartz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+immunologic+self-tolerance.">Acquisition of immunologic self-tolerance.</a> Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).</li><li>Kishimoto, H., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defect+in+central+tolerance+in+NOD+mice.">A defect in central tolerance in NOD mice.</a> Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).</li><li>Anderson, G., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+central+tolerance+with+reaggregate+thymus+organ+cultures.">Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures.</a> Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).</li><li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+development+of+autoreactive+T+cells+in+NOD+mice+is+regulated+in+an+age-dependent+manner.">Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner.</a> J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).</li><li>Stewart, C. C., Stewart, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6.+Immunophenotyping.">Chapter 6. Immunophenotyping.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2001).</li><li>Rice, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+transplantation+for+complete+DiGeorge+syndrome:+medical+and+surgical+considerations.">Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations.</a> J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).</li><li>Markert, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+thymus+tissue+in+complete+DiGeorge+Syndrome.">Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).</li><li>Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymus+transplantation.">Thymus transplantation.</a> Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).</li><li>Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+peripheral+T-cell+depletion+in+transplantation+tolerance.">The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).</li><li>Albuquerque, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+FOXN1-Deficiency+is+associated+with+ab+double-negative+and+FoxP3++T-cell+expansions+that+are+distinctly+modulated+upon+thymic+transplantation.">Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation.</a> PLoS One. 7 (5), e37042 (2012).</li><li>Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymus+transplantation+restores+the+repertoires+of+forkhead+box+protein+3+(FoxP3)++and+FoxP3-+T+cells+in+complete+DiGeorge+anomaly.">Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly.</a> Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).</li><li>Savino, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thymus+is+a+common+target+organ+in+infectious+diseases.">The thymus is a common target organ in infectious diseases.</a> PLoS Pathog. 2 (6), e62 (2006).</li></ol>

The authors do not have any competing financial interests to disclose.

Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge synd...

התימוס הוא איבר שבו אירועים קריטיים בהתפתחות תאי T להתרחש 1. thymocytes התושב, עם סידורו מחדש של הקולטן תא T α (TCR) וגני β, לעבור סדרה של אינטראקציות עם תאי lymphostromal והצגת אנטיגן (APC) באזורים בקליפת המוח והלשדיים של בלוטת התימוס 2. בחירה חיובית הרתי מתווכת על ידי תאי אפיתל הרתי קליפת המוח (TEC) לייצר thymocytes שמכיר פפטידים אנטיגני בהקשר של מעמד מארח גדול המורכב histocompatibility (MHC) I ו- II מולקולות 2-3. סלקציה שלילית הרתי לאחר כרוכה טיהור של thymocytes אוטוריאקטיבים, מונעת על ידי אינטראקציה עם TEC הלשדי או תאים דנדריטים (DC) שפפטידים ההווה נגזרים מחלבונים עצמיים מחויבים אני כיתת MHC והשני מולקולות 3. התוצאה הסופית של תהליכים אלה היא הקמת מאגר של תאים בוגרים מסוג CD4 + CD8 + T ומסוגל להגיב לקשת רחבהשל אנטיגנים זרים ואילו בתערוכת תגובתיות מינימאלית לחלבונים עצמיים 4. היעילות של אירועי בחירת הרתי מושפעת על ידי שורה של גורמים, כולל התבגרות הרתי, תדירות לשדית וTEC בקליפת המוח, הרכב משנה של DC הרתי, והמקור של מבשרי הרתי 3. יש לציין, בחירת הרתי חריגה יכולה לגרום לפתולוגיות אוטואימוניות 5 או immunodeficient, שנובעות מסלקציה שלילית או חיובית פגומה, בהתאמה. האירועים המולקולריים המסדירים בחירת הרתי, לעומת זאת, הם הבינו היטב. במבחנה גישות כגון תרבויות איבר הרתי reaggregate (RTOC) 6, הוכיח להיות שימושי לניתוח אירועים בסיסיים הקשורים לבחירת הרתי, אבל לא מצליחים לשחזר באופן מלא את הדינמיקה של שוטף באירועי vivo. כתוצאה מכך, גישה המבוססת על השתלת הרתי זה הוקמה לאירועי מבחר thymocyte מחקר טובים יותר in vivo 7 </sעד&gt;. פרוטוקול זה מתאר השתלת thymi מעכברי תורם יילוד והמבוגר לעכברים נמען SCID immunodeficient. טכניקה זו מאפשרת לחקר מנגנונים המווסתים את הבחירה חיובית ושלילית הרתי, כמו גם תפוקת הרתי של תת תא T השונים במהלך ontogeny. לאחרונה, גישה זו הייתה בשימוש על מנת להוכיח כי היעילות של בחירת הרתי מוגבלת המוקדמת לאחר הלידה בעכברים המובילה לפיתוח מוגבר של תאי T אוטוריאקטיבים, ורפרטואר של תאי T ספציפי למופחת אנטיגנים זרים 7.

<table><tbody><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Decon Laboratories</td><td>2705HC</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Betadine Solution</td><td>Purdue Products</td><td>67618-150-17</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge needle</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Sutures (1.0 metric)</td><td>Ethicon</td><td>J493G</td><td>18&quot; (45cm)</td></tr><tr><td>AUTOCLIP Wound Clips (9mm)</td><td>Clay Adams&amp;reg; Brand</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td>Sterile, disposable</td></tr><tr><td>Mouse anti-CD3 Ab</td><td>eBioscience</td><td>11-0031-85</td><td>Clone: 1452C11</td></tr><tr><td>Mouse anti-CD4 Ab</td><td>eBioscience</td><td>48-0042-82</td><td>Clone: RM4-5</td></tr><tr><td>Mouse anti-CD8 Ab</td><td>eBioscience</td><td>25-0081-82</td><td>Clone: 53-6.7</td></tr><tr><td>Lancet</td><td>Medipoint</td><td>Goldenrod 4mm</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt</td><td>Invitrogen</td><td>P30253</td><td></td></tr><tr><td>96-well round botton polypropylene plates</td><td>Corning</td><td>3365</td><td></td></tr><tr><td>1.2 ml polypropylene cluster tubes</td><td>Corning</td><td>4401</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polypropylene round-bottom tubes</td><td>BD</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>40uM Nylon Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>15710</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Puralube Optical Ointment</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0138063</td><td></td></tr><tr><td>Lympholyte</td><td>Cedarlane</td><td>CL5030</td><td></td></tr><tr><td>60 mm cell culture dish</td><td>Corning</td><td>430196</td><td>60 mm x 15 mm, Sterile</td></tr></tbody></table>

isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.

המנגנונים המסדירים את היעילות של בחירת הרתי יישארו לא מוגדר. השיטה שהוצגה כאן מאפשרת in vivo ניתוחים של הפיתוח והבחירה של תאי T ספציפיים לעצמית ואנטיגנים זרים. הגישה כרוכה השתלה של שתלי הרתי נגזרים מעכברים בגילים שונים למקבלי SCID immunodeficient. על פני תקופה קצרה יחסית של זמן הנמענים מחדש באופן מלא עם תאי T הנגזרים משתל התימוס המושתל. רק thymocytes זריעת התימוס בעת הבידוד לעבור בחירה ולהתפתח לתאי T בשלים. ככזה, שינויים באופי והספציפיות של תאי T engrafted כפונקציה של אירועי הרתי תלוי גיל ניתן להעריך. למרות שנדרשה מומחיות טכנית להשתלה הרתי מוצלחת, שיטה זו מספקת אסטרטגיה ייחודית ללמוד in vivo מגוון רחב של פתולוגיות המגיעות לי או תוצאה של פונקצית הרתי חריגה ו / או homeostasהוא.

ההצלחה של הליך זה תלויה בטראומה כירורגית מינימאלית, כמו גם את המיקום מדויק של השתל מתחת לכמוסה בכליות. שתל הרתי יש לחתוך כדי להבטיח כראוי בגודל חלקי הרתי להשתלה הבאה, כפי שמוצג באיור 1. בעקבות סכמטי באיור 1, thymi מעכברים שזה עתה נולדו או מבוגר יכול לשמש ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts. at JoVE.com

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

בידוד והשתלה של שתלי הרתי Murine בני שונים.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

isolation-and-transplantation-of-different-aged-murine-thymic-grafts

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.7K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo. 

Video: Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Developmental Biology

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו<em&gt; In Vivo</em&gt; ניטור תא T תוך שימוש במודל Murine MHC התאמה

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

השתלה של עור זנב לחקר תגובות תא Allogeneic T מסוג CD4 בעכברים

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Murine Full-thickness Skin Transplantation

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited application to humans, skin transplantation in mice has been widely employed for transplantation research. The procedure is easy to learn and perform, and it does not require delicate microsurgical techniques nor extensive training. Moreover, graft rejection in this model occurs in a very reproducible immunological reaction and is easily monitored by direct inspection and palpation. In addition, secondary skin transplantation with donor-matched or third-party skin grafts can be performed on more complex transplant models as an alternative and uncomplicated method to assess donor-specific tolerance. The complications are low and are in general limited to anesthesia overdose or respiratory distress after the procedure. Graft failure, on the other hand, occurs commonly as a result of poor preparation of the graft, incorrect positioning in the graft bed, or inappropriate placement of the bandage. In this article, we present a protocol for full-thickness skin transplantation in mice and describe the important steps necessary for a successful procedure.

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established model to study rejection in an alloimmune setting. Here, we provide a tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&#62;C57BL/6 full-thickness skin transplant.

השתלת עור בעובי מלא Murine

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited ...

A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression must be pursued. Employing vascularized bone marrow transplantation and co-transplantation of the thymus have shown promise in this regard in various animal models.1-11 Vascularized bone marrow transplantation allows for the uninterrupted transfer of donor bone marrow cells within the preserved donor microenvironment, and the incorporation of thymus tissue with vascularized bone marrow transplantation has shown to increase T-cell chimerism ultimately playing a supportive role in the induction of immune regulation. The combination of solid organ and vascularized composite allotransplantation can uniquely combine these strategies in the form of a novel transplant model. Murine models serve as an excellent paradigm to explore the mechanisms of acute and chronic rejection, chimerism, and tolerance induction, thus providing the foundation to propagate superior allograft survival strategies for larger animal models and future clinical application. Herein, we developed a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique. The experience in syngeneic and allogeneic transplant settings is described for future broader immunological investigations via an instructional manuscript and video supplement.

To study combined solid organ and vascularized composite allotransplantation, we describe a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique.

Microsurgical דגם חדשני לHeterotopic, כמקשה אחת בחזה קיר, קורנית, ולב השתלה בעכברים

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression ...

Medicine

Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation is an important method for investigating thymic epithelial cell function and T cells maturation in vivo. Here we will describe the experimental methods used within our laboratory to transplant 2&#8217;-deoxyguanosine (to deplete donor&#8217;s lymphocytes) treated embryonic thymus into the renal capsule of an athymic nude mouse. This method is both simple and efficient and does not require special skills or devices. The results obtained via this simple method showed that transplanted thymus can effectively support the recipient&#8217;s T cells production. Additionally, several key points with regards to the protocol will be further elucidated.

We provide a simple and efficient method to transplant 2&#8217;-deoxyguanosine treated E18.5 thymus into the renal capsule of a nude mouse. This method should aide in the study of both thymic epithelial cells function and T cells maturation.

הכליות Subcapsular ההשתלה של 2 '-Deoxyguanosine-התייחסו מורין מורנה בתימוס בעכברים ערומים

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation ...

מיטוב בידוד תאי סטרומה מבלוטת התימוס וממח העצם

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

מחבר זרקור: קידום מחקר המטופויטי באמצעות בידוד תאי סטרומה לריצוף תא בודד

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

בידוד והשתלה של שתלי הרתי Murine בני שונים.

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו

השתלה של עור זנב לחקר תגובות תא Allogeneic T מסוג CD4 בעכברים

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

השתלת עור בעובי מלא Murine

Microsurgical דגם חדשני לHeterotopic, כמקשה אחת בחזה קיר, קורנית, ולב השתלה בעכברים

הכליות Subcapsular ההשתלה של 2 '-Deoxyguanosine-התייחסו מורין מורנה בתימוס בעכברים ערומים

בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים

בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים