עבודה זו מומנה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) (MOP-97774) ואת מדעי הטבע וההנדסה המועצה למחקר בקנדה (NSERC, מענק ע&quot;נ: 480619). KS הוא חתן פרס החוקר KRESCENT חדש (פרס משותף של קרן הכליות של קנדה, קנדי ​​נפרולוגיה חברה קנדית המכון לחקר הבריאות) לבין פרס חוקר מוקדמת ממשרד אונטריו של מחקר וחדשנות. FW נתמך על ידי מלגה לי קה שינג.

1. טרנספורמציה של E. coli עם pGEX-RhoA (G17A) Construct <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן LB-אגר ידי המסת 2.5 גרם ו 1.5 LB אגר גרם 100 מ&quot;ל DH 2 א &#39; החיטוי ו מגניב משוער 50-55 מעלות צלזיוס, אשר ככלל אצבע, כאשר הבקבוק ניתן לקיים בנוחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ampicillin (AMP) מניות על ידי המסת 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ב DH 2 א &#39; מזרק מסנן ולהקפיא aliquots שאינם בשימוש. הוסף 100 μl של המניה Amp (הריכוז הסופי 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ל-אגר LB מ 1.1. מערבולת לערבב ולשפוך לתוך 10 ס&quot;מ צלחות חיידקים (15-20 מ&quot;ל / צלחת). לאפשר לו לגבש (15-30 דקות). ולאחסן צלחות הפוכות שאינם בשימוש ב 4 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את ה קולי, במהירות להפשיר aliquot של תאים המוסמכות DH5α באמבט קרח. הוסף 1 μl של ה-DNA (G17A) pGEXRhoA מדולל ל 25-50 ng / μl. קפיצי צינור לערבב דגירה על קרח במשך 30 דקות. חום הלם על 42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות ומניחים חזרה על קרח במשך 2 דקות. הוספת 900 &amp; mu, אני SOC בינוני לגדול במשך שעה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים 50-100 μl של חיידקים שהפכו בצלחת אגר LB--AMP בעזרת פיפטה פסטר כפוף סטרילית. דגירה בצד הצלחת ישר ב 37 מעלות צלזיוס בחממה במשך 5 דקות ואז להפוך לגדול בין לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבה אחת יהיה נטל מהצלחת להכנת חלבונים GST-מתויג (שלב 2.1). לשימוש עתידי, צלחות לעטוף ולאחסן הפוך על 4 מעלות צלזיוס למשך כ 3 שבועות. בנוסף, מניות חיידקיים יכולים להיות מוכנים אחסון ממושך יותר על ידי מושבות בודדים גדל ב 2 מ&quot;ל סטרילי Amp-LB לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד. מערבבים aliquot עם גליצרול 80% סטרילי ביחס 1:1 ו ההקפאה ב -80 ° C. </li></ol> 2. הכנת GST-RhoA (G17A) חרוזי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן LB על ידי הוספת 25 LB גרם עד 1 L DH 2 0 ו מעוקר. כאשר קריר, הוסף 50 μl Amp ממלאי כדי LB 50 מ&quot;ל (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בריכוז הסופי). לחסן עם col מבודדים היטבony של חיידקים שהפכו בן לילה לגדול ב 37 ° C בהתרגשות. כאשר בצפיפות מלאה (600 OD&gt; 1.0) לדלל עם 450 מ&quot;ל LB-Amp ולגדול למשך 30 דקות נוספות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את 100 המניות mM הפתרון של איזופרופיל BD-thiogalactopyranoside (IPTG) על ידי המסת 0.238 גרם ב 10 מ&quot;ל DH 2 א &#39; חנות aliquots ב -20 ° C. לגרום לחיידקים לייצר חלבון Rho על ידי הוספת 500 μl 100 מ&quot;מ IPTG לתרבות 500 מ&quot;ל (ריכוז סופי של 100 מיקרומטר). להפחית את הטמפרטורה ל 22-24 מעלות צלזיוס ולגדול על ~~~HEAD=NNS 16 שעות ש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התרבות ב 3600 גרם במשך 10 דקות 4 ° C. במידת הצורך, תרבות 500 מ&quot;ל ניתן לחלק 50 מ&quot;ל צינורות עבור צנטריפוגה. הקפאת גלולה (ים) לפחות שעה 1 (או לילה רצוי) ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 200 מ&quot;ל תמוגה מאגר המכיל 20 HEPES מ&quot;מ (0.95 גר &#39;) /-pH 7.5, 150 מ&quot;מ NaCl (1.75 גרם) 5 מ&quot;מ MgCl 2 (0.203 גרם); 1% TX-100 (2 מ&quot;ל). להכין פתרונות המניות של 1M DTT (1.542 גרם 10 מ&quot;ל DH 2 O) ו - 100 מ&quot;מ PMSF (0.174 g/10 EtOH מ&quot;ל). להכין מאגר + תמוגה, להשלים עם 10 מ&quot;ל 1 מ&quot;מ DTT (10 μl המלאי) ו 1 mM PMSF (100 μl המלאי) ואחד מיני השלם פרוטאז Tablet אינהיביטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה על הקרח, מוסיפים 10 מ&quot;ל + תמוגה חיץ על כדורי משלב 2.3. Resuspend באופן יסודי על ידי vortexing עדין pipetting. הימנע קצף. Sonicate על קרח דקה 1 על הגדרת 4 עם דופק 50%. ספין lysate sonicated ב 15,000-20,000 גרם במשך 15 דקות 4 ° C, ולהסיר sonicate הבהיר (supernatant) אל צינור סטרילי 15 כתרים מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Sepharose גלוטתיון ידי ערבוב בעדינות צינור המקורי המכיל slurry 75% ו 335 μl העברת לתוך צינור 15 מ&quot;ל. השתמש קצה נשא רחב פיפטה חרוזים. הוסף 10 מ&quot;ל קר PBS, ומסובב 500 גרם במשך 5 דקות על 4 ° C. מחק supernatant, להוסיף 1 תמוגה מ&quot;ל + חוצץ על חרוזים מסתובבים כמו לשטוף הקודם. מחק למאגר supernatant ולהוסיף תמוגה + לעשות slurry 50%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של equilibrated slurry חרוז כדי supernatant משלב 2.5. סיבוב על 4 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 מ&quot;ל בהרוורד המכיל 20 HEPES מ&quot;מ (2.38 גר &#39;) / pH 7.5 ו 150 מ&quot;מ NaCl (4.38 גר&#39;) ב DH 2 א &#39; להכין פתרונות המניות של MgCl 1M 2 (0.952 גרם ב 10 מ&quot;ל DH 2 O) 1M DTT (1.542 גרם ב 10 מ&quot;ל DH 2 O). להכין בהרוורד +, להשלים 100 מ&quot;ל רק לפני חיבורו 5 מ&quot;מ MgCl 2 (50 μl ממלאי) ו 1 mM DTT (100 μl ממלאי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את החרוזים משלב 2.7 ב 500 גרם במשך 5 דקות על 4 ° C. מחק את החרוזים supernatant ולהתרחץ פי 2 עם 10 + תמוגה מ&quot;ל חיץ, ועל פי 2 עם 10 מ&quot;ל + בהרוורד. לאחר שטיפה של דבר, להפוך את slurry 50% על ידי resuspending את החרוזים ב בהרוורד + השלימו עם BD BaculoGold מעכב פרוטאז (20 μl של 50x BD BaculoGold / ml). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 10 μl של הכנת חרוזים הסופי עם חיץ Laemmli מדגם 2x המכילה β-mercaptoethanol. הפוך את שור אלבומין בסרום (BSA) סטנדרטים. השתמש 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מניות (0.02 גר &#39;של ארגון ה-BSA ב 10 מ&quot;ל DH 2 O). מערבבים 10 μl של המניה עם 10 Laemmli μl (20 מיקרוגרם הסופי); 5 μl של המניה עם μl 5 של DH 2 O ו - 10 Laemmli μl (10 מיקרוגרם הסופי); ו -2.5 מניות μl עם 7.5 μl DH 2 O ו - 10 Laemmli μl (5 מיקרוגרם הסופי). מרתיחים את כל דגימות (5 דקות). ספין מדגם חרוז ולהפעיל supernatant לתקני BSA סמנים משקל מולקולרי על ג&#39;ל SDS-polyacrylamide 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את הכתם הכחול Comassie (0.1 גרם חומצה אצטית 10 מ&quot;ל, 40 מ&quot;ל מתנול ו 50 מ&quot;ל DH 2 O) והפתרון destain (500 מ&quot;ל DH 2 O, מתנול 400 מ&quot;ל ו 100 מ&quot;ל חומצה אצטית). אחסן בטמפרטורת החדר. כתם ג&#39;ל למשך 20-30 דקות, להסיר את הצבע (הוא יכול לעשות בה שימוש חוזר מספר פעמים) ולשטוף עם פתרון destain פעמיים. המשך destain עם הרעידות עדינה במשך כמה שעות עד להקות גלויים לעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את ריכוז GST-RhoA (G17A) מצמידים את החרוזים באמצעות סטנדרטים BSA כהפניה (איור 2). Aliquot נפח שווה של חרוזים המכילים ~ 10-15 מיקרוגרם חלבון לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל צנטריפוגות מיקרו. חנות חרוזים על 4 מעלות צלזיוס להשתמש תוך יום. להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס בהרוורד + / גליצרול ביחס 3:01 להשתמש תוך מספר ימים. </li></ol> 3. GEF Assay הנפתח עם נוקלאוטיד ללא RhoA (G17A) חרוזי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים 10 מנות ס&quot;מ עד המפגש. סרום לשלול לפחות 3 שעות וטיפול כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מאגר תמוגה + כמו בשלב 2.4. הכינו מספיק חיץ תמוגה עבור μl 700 / צלחת בתוספת כמה סכום נוסף כדי לאפשר pipetting שגיאות. מוסיפים את מעכבי הפרוטאז רק לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה על הקרח, הסר בינוני תרבות מן הכלים ולשטוף עם קר כקרח בהרוורד. הסר את כל בהרוורד ולהוסיף 700 + μl חיץ תמוגה על כל מאכל. צלחות עיטורים כדי לכסות את כל האזורים, לגרד ולאסוף lysates לתוך צינורות ממוספרת 1.5 מ&quot;ל. מסובבים גרם 15000 דקות 1 ב 4 ° C. Supernatant ישמש assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מספר הסלולרי שלך שווה הכלהמנות נבדקות, ניתן להשמיט עושה assay חלבון, ועבור לשלב 3.5. אחרת למדוד את ריכוז החלבון של supernatant זה באמצעות ביו רד assay חלבון מהיר להשוות supernatant עבור נפח וריכוז. כמות החלבון הכולל תלוי בסוג התא בשימוש (בדרך כלל 1-1.5 מ&quot;ג חלבון עבור LLC-PK1 תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של 30 μl של supernatant כל ומערבבים עם 2x 30 μl צמצום מאגר Laemmli המדגם, לרתיחה ומניחים בצד לצעד 3.7. הוסף supernatants הנותרים aliquots של GST-RhoA (G17A) חרוזים משלב 2.12. סובב במשך 45 דקות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין חרוזים ב 6800 גר &#39;למשך 10 שניות ב 4 ° C. מחק supernatant ולשטוף את החרוזים פי 3 עם חיץ תמוגה, ספינינג באותו אופן בין הכביסות. להסיר לחלוטין את הכביסה הסופי באמצעות מזרק 1 סמ&quot;ק מצויד במחט G 30 ולהוסיף 20 2x μl צמצום מאגר Laemmli המדגם. מרתיחים במשך 5 דקות. ספין כדי חרוזים גלולה ואו להפעיל supernatant מיד (עדיף) או לשמור אותוt -80 ° C לצורך ניתוח מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלה 20 lysates μl סלולריים סך כל דגימות חלבון שזירזו על ג&#39;ל המתאים אחוז SDS-polyacrylamide בגודל של GEF אתה לומד. זיהוי GEF שלך של בחירה על ידי המערבי סופג באמצעות נוגדן ספציפי. </li></ol> 4. נציג תוצאות חלק 1 ו -2 לפרוטוקול מתאר הכנת GST-RhoA (G17A) מצמידים את GSH-sepharose חרוזים בדיקה על ידי SDS-PAGE (ראו תיאור כללי של הפרוטוקול על איור 1). ג&#39;ל צבעונית טיפוסית Coomassie מוצג באיור 2. המדגם עם חלבון eluted יכילו פס יחיד על כ 50 kDa (איור 2, ליין 6). הריכוז של החלבון ניתן להעריך באמצעות דגימות התייחסות BSA. בדוגמה על איור 2, ריכוז של RhoA (G17A) מוערך 15 μg/10 μl. לכן, aliquots של μl 10 / צינור מוכנים. תשואה אופיינית<html> ביד שלנו הוא 15-20 מיקרוגרם חלבון מן תמוגה 10 מ&quot;ל חיידקים. חלק 3 של הפרוטוקול מתאר את המשקעים זיקה assay (ראה סקירה על איור 1). Assay מוצלח GEF גילוי ההפעלה של גורם החליפין GEF-H1 מוצג איור 3. חלבון (G17A) RhoA כבשו חלק GEF-H1 מהשלט (ללא טיפול) lysates התא, דבר המצביע על כך GEF-H1 יש פעילות הבסיס. כמות זירז עם זאת עולה בתאים שטופלו נמק הגידול ציטוקינים דלקתיים Factor-α (TNF-α), עולה בקנה אחד עם הרעיון TNF-α מפעילה GEF-H1 5,7. חשוב לציין, את lysates סלולריים בסך הכל להראות כמויות דומות של GEF-H1 בשליטה ו מדגם מטופלים, טוען כי הטיפול לא שינה GEF-H1 רמות קלט בשימוש assay שווה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" /> באיור 1. סקירה כללית של פרוטוקול. ove_content &quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" /> איור 2. התוצאה נציג פרוטוקול הכנת חרוז. ג&#39;ל צבעונית Coomassie עם הכנה מוצלחת GST-RhoA חרוז (G17A) מוצג. מדגם ביד סטנדרטים BSA חלבון הופרדו על ידי-SDS באמצעות ג&#39;ל acrylamide 10%. כדי לבדוק את החרוזים, 10 μl של slurry חרוז הסופי המכיל GST-RhoA (G17A) מדוללת 1:01 עם צמצום מאגר Laemmli מדגם מבושל במשך 5 דקות. החרוזים היו הסתובב לרגע supernatant טעון על ג&#39;ל. דגימות הבאים היו עמוסים: ליין 1: סמן משקל מולקולרי (MW) (FroggaBio BLUeye prestained הסולם חלבון); Lanes 2-4: 5, 10 ו - 20 מיקרוגרם אלבומין סרום שור (BSA), ליין 5 הוא ריק; ליין 6: 10 μl של שזה עתה הוכנו RhoA (G17A) חרוזים. לאחר ההפרדה הושלמה, ג&#39;ל מוכתם באמצעות Coomassie כחול ולאחר מכן destained לגלות חלבונים. משקל מולקולרי של חלבון (G17A) GST-RhoA הוא בערך 50<html> kDa והוא פועל סביב רמה של הסמן 48 kDa. הריכוז של חלבון GST-Rho במדגם המסוים הזה מוערך סביב slurry μg/10 15 μl. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" /> 3. איור נציג ההפעלה GEF assay מראה TNF-α-Induced ההפעלה של GEF-H1. Confluent LLC-PK1 התאים טופלו 10 ng / ml TNF-α במשך 5 דקות. לאחר הטיפול התאים היו lysed ו GEFs פעילים נתפסו באמצעות GST-RhoA (G17A) חרוזים קשורים. הנוכחות של GEF-H1 של חלבונים שזירזו (כתם למעלה) סך הכל lysate דגימות תאים (כתם למטה) זוהה באמצעות סופג המערבי עם נוגדנים נגד GEF-H1 (איתות Cell). נא לשים לב לכמות מוגברת של זירז GEF-H1 ב TNF-α-מטופלים לעומת לא מטופלים התאים ביחס התשומות מקבילים, מה שמעיד על תוצאה מוצלחת. 3932/3932fig4.jpg &quot;/&gt; איור 4. &quot;תוצאה גרועה&quot;. למרות assay הנפתח GEF המוצג כאן הביא כמה GEF-H1 בשבי החרוזים, הסכומים זירז מ מלאה TNF-α שטופלו תאים זהים. כך TNF-α, activator מכיר GEF-H1 במקרה זה לא לגרום ההפעלה. לפתרון בעיות הניסוי הזה בפרט לאחר הציע TNF-α בשימוש לא היה טרי מספיק מושפל כנראה.

<ol>
	<li>Jaffe, A. B., Hall, A. R. h. o. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases:+biochemistry+and+biology.">GTPases: biochemistry and biology.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 247-269 (2005).</li><li>Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF+means+go:+turning+on+RHO+GTPases+with+guanine+nucleotide-exchange+factors.">GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 167-180 (2005).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li><li>Garcia-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+activated+GAPs+and+GEFs+in+cell+lysates.">Analysis of activated GAPs and GEFs in cell lysates.</a> Methods Enzymol. 406, 425-437 (2006).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF-H1+Mediates+Tumor+Necrosis+Factor-{alpha}-induced+Rho+Activation+and+Myosin+Phosphorylation:+role+in+the+regulation+of+tubular+paracellular+permeability.">GEF-H1 Mediates Tumor Necrosis Factor-{alpha}-induced Rho Activation and Myosin Phosphorylation: role in the regulation of tubular paracellular permeability.</a> J. Biol. Chem. 284, 11454-11466 (2009).</li><li>Waheed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal+regulated+kinase+and+GEF-H1+mediate+depolarization-induced+Rho+activation+and+paracellular+permeability+increase.">Extracellular signal regulated kinase and GEF-H1 mediate depolarization-induced Rho activation and paracellular permeability increase.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. , (2010).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+mediates+tumor+necrosis+factor-alpha-induced+activation+of+the+ERK/GEF-H1/RhoA+pathway+in+tubular+epithelium.">The epidermal growth factor receptor mediates tumor necrosis factor-alpha-induced activation of the ERK/GEF-H1/RhoA pathway in tubular epithelium.</a> J. Biol. Chem. 286, 9268-9279 (2011).</li><li>Garcia-Mata, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+a+GEF+by+its+tail.">Catching a GEF by its tail.</a> Trends Cell Biol. 17, 36-43 (2007).</li><li>Dubash, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+RhoA+localizes+to+the+nucleus+and+is+activated+by+Net1+and+DNA+damage+signals.">The small GTPase RhoA localizes to the nucleus and is activated by Net1 and DNA damage signals.</a> PLoS One. 6, e17380-e17380 (2011).</li><li>Guilluy, G., Dubash, A. D., Garc&#237;a-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RhoA+and+Rho+GEF+activity+in+whole+cells+and+the+cell+nucleus.">Analysis of RhoA and Rho GEF activity in whole cells and the cell nucleus.</a> Nature Protocols. , (2011).</li><li>Guilluy, C., Swaminathan, V., Garcia-Mata, R., O'Brien, E. T., Superfine, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GEFs+LARG+and+GEF-H1+regulate+the+mechanical+response+to+force+on+integrins.">The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins.</a> Nature Cell Biology. 13, 722-727 (2011).</li><li>Dubash, A. D., Wennerberg, K., Garcia-Mata, R., Menold, M. M., Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Lsc/p115+RhoGEF+and+LARG+in+regulating+RhoA+activity+downstream+of+adhesion+to+fibronectin.">A novel role for Lsc/p115 RhoGEF and LARG in regulating RhoA activity downstream of adhesion to fibronectin.</a> J. Cell Sci. 120, 3989-3998 (2007).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

השיטה המוצגת כאן היא זמינה רק שאינו רדיואקטיבי assay הפעלה עבור GEFs שיכולים לעקוב הבריכה פעילה של GEFs בתאים. Assay דומה מבחני משקעים המשמשים ההפעלה הבאה של GTPases קטנים, כמו גם GEFs נגד RAC ו Cdc42. מבחני אלה להשתמש שונים GST-מתוייגים חלבונים ישנם הבדלים קטנים בין 1 המתואר כאן, לעומת זאת השלבים הבסיסיים זהים. כך, פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מותאמים עבור GTPase קטן אחר מבחני GEF ההפעלה. Assay הציג GEF שונה לאחרונה בקשה שברים גרעיני 9,10. עם שינויים נוספים, בדיקה של הפעלת GEF בתאים subcellular אחרים יכול להיות גם אפשרי. אנו משתמשים בשיטה הציג ללמוד הפעלת GEFs של שורות תאים אפיתל 5,6,7. עם אופטימיזציה כלשהי, assay זה צריך להיות מספיק כדי לזהות GEFs מקו כל תא. כאשר adapting לסוג תא מסוים, למצוא את מספר הנייד האופטימלי, מאגר נפח תמוגה, ואת שיטת הזיהוי של GEF להיבדק (נוגדן טוב המערבי סופג זה חשוב). על ההגדרה הראשונית של assay מומלץ להשתמש גירוי ידוע להפעיל GEF של עניין. בעת שימוש גירוי לא ידוע, תמיד להשתמש שליטה חיובית כדי לוודא assay שלך עובד. Assay זה יכול לשמש כדי לזהות הפעלת GEFs הידועים סופג המערבי. עם זאת, היא גם מספקת לזהות GEFs לא ידועים. לשם כך, GEFs שנתפסו מתוך מלאה דוגמאות מגורה יש לנתח על ג&#39;ל Coomassie מוכתם. להקות שמופיעות רק דגימות מגורה עשוי להכיל GEFs מופעל ניתן לשלוח לזיהוי על ידי ספקטרומטריית מסה (למשל 5). לבסוף, הערה אזהרה. Assay מבוססת על ההנחה כי שינויים posttranslational עיבוד GEFs פעילים נשמרים לאחר תמוגה התא. אכן, מדובר בבירור CASE במשך מספר GEFs, ומאז המפעלים שלה, assay זה נוצל בעבר על ידי קבוצות שונות כדי לזהות הפעלת GEFs שונים, כולל GEF-H1, p115RhoGEF ו XPLN (למשל 5,11,12,13). שימור מצב פעיל אבל לא יכול לקרות במקרה של GEFs כל, ולכן מתקבל על הדעת כי assay זה לא יעבוד עבור כל GEFs. כמו כן, יש לציין, כי GEFs רבים מפעילים פעילות לכיוון אחד או יותר GTPases קטנים. לכן, כאשר GEF ספציפית נלמדת, מומלץ להשלים את assay עם מבחני GEF משקעים עבור GTPases קטנים אחרים, כמו גם מחקרים שבחנו RhoA תפקודית, Rac1 ו Cdc42. צעדים קריטיים פרוטוקול: מושבות של חיידקים שהפכו יש לקח מ, צלחות טריים שהוכנו כראוי על מנת להבטיח מבחר הולם של מגבר, תוצאה תשואה טובה. שינוי תנאים של תאים המוסמכות ממקורות אחרים עשויה להשתנות ויש להתייעץ. </p&gt; כל השלבים של הכנת פרוטוקול חלבון (משלב 2.3) ו assay (משלב 3.2) יש לבצע על 4 מעלות צלזיוס עם פתרונות התקרר צנטריפוגות. תמוגה חיידקי (שלב 2.5) צריך להיות יסודי ושלם על מנת לקבל השעיה הומוגנית. כאשר lysing חיידקים, מערבולת ו פיפטה lysate לסירוגין, תוך שמירה על אותו 4 ° C ולהבטיח sonication נעשה על קרח כדי למנוע denaturing חלבון. אם באמצעות מודל אחר של sonicator, תנאי ייתכן שיהיה צורך להתאים. הדגירה של sonicate עם החרוזים תמיד צריך להיעשות 4 ° C על הכתף כדי להבטיח מחייב מספיק, יש להקפיד לשמור על תזמון עקבי. GST-Rho מוטציות אינם יציבים במידה מסוימת כאשר לידי ביטוי חיידקים, לכן עדיף להשתמש חרוזים מוכנים מיד או בתוך ימים ספורים. Assay משקעים (חלק 3) הוא זמן רגיש טמפרטורה,מכלל GEFs פעילים יכול ללכת לאיבוד בקלות lysate התא, כך צעדים יש לבצע מהר ככל האפשר. הסעיף הבא מכיל כמה בעיות הטיפים. לא או כמות נמוכה מאוד של חלבון Rho מוטציה לקראת החרוז האחרון: זו עשויה להיגרם על ידי גיוס יעיל, תמוגה מספקת של חיידקים, או הפסד של החלבון בתהליך ההכנה או אחסון. כדי לסייע בפתרון חלק מן האפשרויות הללו, דגימות של חיידקים ניתן לנתח לפני ואחרי הגיוס. אם יש אינדוקציה ירודה של חלבון לחזור על התהליך באמצעות המושבה מהצלחת מפוספס טרי או טרנספורמציה מחדש תאים המוסמכות. ריכוזים IPTG שונים ושעות אינדוקציה צריך גם להיבדק. אם תמוגה אינו מספיק (כלומר חלבון נשאר גלולה במקום supernatant) משתנה מלח בריכוז חומר ניקוי במאגר תמוגה אפשר להעמיד לדין. Sonication פעמים חלופיהגדרות יש לשקול, דגימות לפני ואחרי sonication ניתן לבדוק על ידי מיקרוסקופ כדי לקבוע את היעילות של תמוגה. לא זירז GEF, למרות GST-חלבון קיים החרוזים: זה יכול להיות בגלל בעיות טכניות במהלך assay רטיבות, או על ידי היעדר אמיתי של הפעלת GEF למד באמצעות גירוי מיושם. השתמש תמיד גירוי המכונה בקרה חיובית כדי לוודא assay שלך עובד. השתמש חרוזים מוכנים תוך מספר ימים. אם assay משקעים לוכדת כמויות לגילוי של GEF הנלמדים בכל מצב, ודא GEF שלך הוא ההווה ניתן לזהות היטב supernatant לאחר צנטריפוגה זה לשמש assay (שלב 3.3). ודא שכל מאגרים מעכבי פרוטאז טריים, ולבצע את כל הפעולות על הקרח מהר ככל האפשר. להגדיל את כמות החלבון קלט (למשל, באמצעות lysates מ 2 צלחות / לדוגמה). אם assay משקעים מראה precipi הבסיססימטרייה של GEF שלך, אבל אין הבדל בין שליטה נתפסת דגימות מגורה (איור 4), להתחיל פתרון בעיות על ידי אימות כי גירוי להחיל עבד באמצעות אפקטים ידועים אחרים (למשל על ידי איתור ההפעלה של מסלולי איתות אחרים). לשקול לשנות את תנאי הטיפול ו / או ריכוזי. להסתמך על נתוני דיווח בספרות כיצד הגירוי שלך מפעילה רו או אותות אחרים לחזות פעמים נוטים וריכוזים. כאשר אופטימיזציה של זמן טיפול, להשתמש בשתי נקודות זמן קצרות וארוכות, כמו הפעלת GEF עשוי להתגלות הטוב ביותר בנקודת הזמן לפני הפעלת Rho להבחין היטב. לבסוף, אותו גירוי יכול לגרום במידה משתנה של הפעלת עקב שינוי התגובה לתאים הנגרם מספר המעבר, תא confluency וכו &#39;

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (לא חובה) </td></tr><tr><td> pGEX-RhoA (G17A) </td><td> Addgene </td><td> יהיה זמין בקרוב </td><td> שנוצר במעבדה של ד&quot;ר קית Burridge (אוניברסיטת צפון קרוליינה) (נ&quot;צ 3) </td></tr><tr><td> DH5α </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> חנות -80 ° C </td></tr><tr><td> SOC בינוני </td><td> BioShop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> BioShop </td><td> LBL407.1 </td><td> שמור סטרילית </td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> BioShop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> BioShop </td><td> AMP201.25 </td><td> חנות המניה ב -20 ° C </td></tr><tr><td> אגר </td><td> BioShop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (Isopropyl BD-thiogalacto-pyranoside) </td><td> Calbio-Chem </td><td> 420322 </td><td> במלאי החנות פתרון ב -20 ° C </td></tr><tr><td> גלוטתיון Sepharose חרוזים </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> SIGMA </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> SIGMA </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> SIGMA </td><td> M-9272 </td><td> להוסיף ממש לפני השימוש </td></tr><tr><td> TX-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 100 x </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td> להוסיף ממש לפני השימוש </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> SIGMA </td><td> P-7626 </td><td> להוסיף ממש לפני השימוש </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז 50x </td><td> BD Baculo זהב </td><td> 51 21426Z </td><td> להוסיף ממש לפני השימוש </td></tr><tr&gt; <td> השלם מיני, EDTA ללא 10x </td><td> רוש </td><td> 11 836 170 001 </td><td> להוסיף ממש לפני השימוש </td></tr><tr><td> Laemmli לדוגמא מאגר 2x </td><td> ביו רד </td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol </td><td> SIGMA </td><td> M7154 </td><td> להוסיף ממש לפני השימוש </td></tr><tr><td> Coomassie בריליאנט בלו </td><td> ביו רד </td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה אצטית </td><td> Caledon </td><td> 1000-1 </td><td></td></tr><tr><td> מתנול </td><td> Caledon </td><td> 6701-7 </td><td></td></tr><tr><td> ביו רד חלבון Assay </td><td> ביו רד </td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> BLUeye הסולם </td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> ריאגנטים לוח 1. בשימוש. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם ציוד </td><td> חברה </td&gt; <td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (לא חובה) </td></tr><tr><td> RC-5 ב צנטריפוגות </td><td> Sorvall </td><td> SS-34 רוטור </td><td> השתמש ב 4 ° C </td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> Sorvall-Thermo Scientific </td><td> ST-16R </td><td> השתמש ב 4 ° C </td></tr><tr><td> מיקרו צנטריפוגות </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> השתמש ב 4 ° C </td></tr><tr><td> חיידקי שאכר </td><td> INFORS HT Ecotron </td><td> AG-CH-1403 Bottmingen </td><td> השתמש ב 37 ° C או 22 ° C </td></tr><tr><td> Sonicator </td><td> ברנסון </td><td> Sonifier-450 </td><td> השתמש ב RT </td></tr><tr><td> מסובבי </td><td> גלאס-col </td><td> 099A CR4012 </td><td> השתמש ב 4 ° C </td></tr></tbody></table> לוח 2. הציוד המסוים.

affinity precipitation of active rho-gefs using a gst-tagged mutant rho protein (gst-rhoa(g17a)) from epithelial cell lysates

חלבונים ממשפחת Rho של GTPases קטנים הם הרגולטורים המרכזיים של cytoskeleton, ולשלוט מגוון רחב של תהליכים תאיים, כולל נדידת תאים, ביטוי גנים, מחזור התפתחות התא הידבקות התא 1. חלבונים Rho הם מתגים מולקולריים הפועלים GTP הנכנס ללא פעילות במדינה תוצר הנכנס. ההפעלה שלהם מתווכת על ידי משפחה של גואנין נוקלאוטיד-פקטור חליפין (GEF) חלבונים. Rho-GEFs מהווים משפחה גדולה, עם חפיפה ספציפיות 2. למרות הרבה הושגה התקדמות בזיהוי GEFs מופעל על ידי אותות ספציפיים, יש עדיין הרבה שאלות שנותרו לגבי רגולציה מסלול ספציפי של חלבונים אלו. מספר Rho-GEFs עולה על 70, ואת כל תא מבטא יותר חלבון GEF. בנוסף, רבים של חלבונים אלה להפעיל לא רק רו, אבל בני משפחה אחרים, שמוסיפים למורכבות של רשתות רגולטוריות. חשוב לציין, לחקוראיך GEFs מוסדרים דורש שיטה כדי לעקוב אחר הבריכה פעילה של GEFs בודדים בתאים מופעל על ידי גירויים שונים. כאן אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד בשיטה שנועדה לבחון ולכמת את הזמינות פעילים Rho-ספציפיים GEFs באמצעות assay משקעים זיקה. Assay זו פותחה לפני שנים אחדות במעבדה Burridge 3,4 ו השתמשנו בו צינורי בכליות שורות תאים 5,6,7. Assay מנצל &quot;נוקלאוטיד חינם&quot; RhoA מוטציה, עם זיקה גבוהה GEFs פעילים. מוטציה (G17A) הופך את החלבון מסוגל להיקשר, או מהתמ&quot;ג GTP וזה המדינה מחקה את מצב ביניים זה חייב GEF. גרסה GST-מתויג של חלבון זה מוטציה באה לידי ביטוי מטוהרים מן ה coli, המאוגדים חרוזים גלוטתיון sepharose ולהשתמש בהם כדי להאיץ GEFs פעילים מ lysates של תאים שלא טופלו ולא מגורה. כמו רוב GEFs מופעלים באמצעות שינויים posttranslational או שחרור מעכבות כריכות, המדינה הפעילהנשמרת lysates סלולריים, והם יכולים להיות מזוהים על ידי assay זה 8. חלבונים שנתפסו יכול להיות נחקר על GEFs מוכרים על ידי זיהוי עם נוגדנים ספציפיים באמצעות סופג המערבי, או מנותח על ידי ספקטרומטריית מסה לזהות GEFs ידוע מופעל על ידי גירויים מסוימים.

Watch this Scientific Journal Video about Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates at JoVE.com

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

השיטה המוצגת כאן מתארת ​​assay לעקוב אחר ההפעלה של RhoA ספציפיים GDP / GTP גורמים חליפין (GEFs) בתאים בתרבית על ידי שימוש בחלבון RhoA GST היתוך מוטציה שיש לו זיקה גבוהה עבור GEFs מופעל. GEFs הם זירז מ lysates סלולריים, שזוהו על ידי סופג המערבי לכמת ידי צפיפות.

הזיקה של רטיבות פעילים Rho-GEFs שימוש GST-מתויג מוטנטי חלבון Rho (GST-RhoA (G17A)) מ lysates תא אפיתל

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

affinity-precipitation-active-rho-gefs-using-gst-tagged-mutant-rho

Research

JoVE Journal

Biology

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

16.5K Views.  St. Michael's Hospital. השיטה המוצגת כאן מתארת ​​assay לעקוב אחר ההפעלה של RhoA ספציפיים GDP / GTP גורמים חליפין (GEFs) בתאים בתרבית על ידי שימוש בחלבון RhoA GST היתוך מוטציה שיש לו זיקה גבוהה עבור GEFs מופעל. GEFs הם זירז מ lysates סלולריים, שזוהו על ידי סופג המערבי לכמת ידי צפיפות.

Video: Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

ג&#39;ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

טיהור chromatographic של הריבוזומים שמרים מאוד פעיל

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

פרוטוקול לתצוגת הפאג וזיקה בחירה באמצעות פיתיונות חלבון רקומביננטי

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

המהונדס מכרסמים Assay עבור תדר Mutant תאי ניבט זכר כימות

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...