שיפרנו את שיטת RiboTag שפורסמה בעבר כדי להפחית באופן משמעותי את הרקע. זה הופך את היישום למודלים מורכבים כמו מערכת מוטנטים לפשוט יותר מנקודת מבט של ניתוח והרבה פחות יקר. מלבד ייצור בעלי חיים ניסיוניים, שיטת RiboTag היא הרבה יותר קלה וישירה מאשר שיטות אחרות לנתח mRNAs הקשורים ריבוזום.
כמו כל ניסויי RNA, תנאים חופשיים מחמירים RNase הם היסוד להצלחה. אם יש לך ניסיון מוגבל עם RNA, לבדוק את התנאים שלך על ידי ביצוע תחילה מיצוי RNA בסיסי ואז להמשיך הלאה. הפגנת ההליך תהיה לורן צ'וקראללה, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.
כדי להכין חיץ הומוגניזציה, להוסיף 2.5 מיליליטר של טריס טוחן אחד ב pH 7.4, חמישה מיליליטר של אשלגן כלורי אחד טוחן, 600 microliters של אחד מגנזיום כלוריד טוחן, ו 500 microliters של MP40 לצינור 50 מיליליטר. מוסיפים מים שטופלו בפירוקרבונט לצינור כדי להביא את הנפח ל-50 מיליליטר ומערבבים עד שכל הרכיבים משולבים. להכנת חיץ שטיפת מלח גבוה, הוסיפו 2.5 מיליליטר של טריס טוחן אחד ב-pH 7.4, 15 מיליליטר של אשלגן כלורי טוחן אחד, 600 מיקרוליטר של מגנזיום כלוריד אחד, ו-500 מיקרוליטר של MP40 לצינור 50 מיליליטר.
מביאים אותו לנפח של 50 מיליליטר במים שטופלו דיטיל פירוקרבונט ומערבבים עד שכל הרכיבים משולבים. לפני לשקול את כל צינורות מדגם, להקליט את המשקל, מראש מגניב חנקן נוזלי. מרגמה סטרילית טרום קרירה, עלה, ומשקל מרית על קרח יבש.
לאחר מכן על קרח יבש, להשתמש מרגמה סטרילית מקורר מראש ועלי לשבור דגימות רקמה קפואה פלאש לחתיכות גדולות לטחון אותו לאט לתוך אבקה דקה. באמצעות מרית מקורר מראש, לגרד את האבקה מן המרגמה לתוך צינור איסוף מקורר מראש דואג לשמור על קרח יבש במידת האפשר. לשקול את הצינור עם אבקת הרקמה.
לחשב את המסה של רקמה על ידי חיסור המשקל הראשוני של הצינור מן המשקל של הצינור עם המדגם בו. רשום ערך זה עבור חישוב מאוחר יותר של אמצעי אחסון של מאגר תיזה. הכן חיץ תמוגה על ידי הוספת לתוך 10 מיליליטר של דיתיותריטול מאגר הומוגניזציה, מעכבי RNase, Cycloheximide, הפרין, וטבליה מעכבת פרוטאז אחת.
מערבבים עד שכל הרכיבים משולבים ולשמור על קרח עד השימוש. עבור כל 100 מיליגרם של מדגם, להוסיף מיליליטר אחד של מאגר תיזה. עם אותה פיפטה המשמשת להוספת מאגר התיזה, בזהירות pipette lysate וכתוצאה מכך למעלה ולמטה כדי לפצל את התאים ולערבב.
המשך צינורות עבור בדרך כלל 25 עד 30 משיכות עד המדגם כבר לא צמיג. מניחים את הדגימות על קרח במשך 10 דקות כדי lyse. ואז לסובב את הדגימות בצנטריפוגה מקורר מראש בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 10, 000 פעמים גרם.
גלולה גדולה ומעוננת רופפת נוצרת בתחתית הצינור. נזהר לא להפריע גלולה, לאסוף את lysate לתוך צינור חדש ולהקליט את עוצמת הקול עבור כל מדגם. כדי למנוע השפלה מדגם, להבטיח כי הדגימות להישאר קריר לאורך כל הפרוטוקול הנותר אחסון על קרח או בארבע מעלות צלזיוס בכל הזדמנות אפשרית.
עכשיו, לחשב את הנפח הנדרש של חרוזים מגנטיים יחד עם חלבון מחייב נוגדנים המתאים, חלבון G.For מיליליטר אחד של ליסאט, להשתמש 375 microliters של גם G חלבון כדי להגיע 30 מיליגרם למיליליטר. מניחים את פתרון חרוז בצינור 1.7 מיליליטר על מתלה צינור מגנטי. הסר את ממס חרוזים ולהוסיף נפח שווה של מאגר תיזה טרי לחרוזים.
על מסובב צינור ספסל להגדיר 20 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס, לסובב את הצינור חמש דקות לשטוף. מניחים את הצינור על מתלה הצינור המגנטי ומסירים את חיץ הכביסה. לאחר חזרה על לשטוף פעמיים נוספות, להוסיף מאגר תזה בנפח המקורי כדי לצייד את חרוזים.
יש לאחסן בארבע מעלות צלזיוס או על קרח עד לשימוש. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של חרוזים שיווי משקל עבור כל מיליליטר של ליט ולסובב בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. ואז למקם את הצינור על מתלה מגנט ולאסוף את lysate לתוך צינור טרי.
השלך את חרוזים משומשים. לליזט, מוסיפים 25 מיקרוליטרים של חרוזים שקוויבלים לכל מיליליטר ומסתובבים בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה. יש לאחסן את שאר גם חטיף החלבון G ב-4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
בבוקר, מניחים את הצינור על מתלה המגנט ולאסוף את lysate לתוך צינור טרי. השלך את חרוזים משומשים. מן lysate פינה, לשמור 50 microliters כבקרת קלט מדגם.
יש לאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. לכל מיליליטר של ליאזט פינה, להוסיף חמישה מיקרוגרם של נוגדן נגד HA. כדי למנוע אובדן מדגם, לאטום את כובע הצינור עם סרט מעבדה ולסובב את הדגימות 16 עד 18 שעות בארבע מעלות צלזיוס.
לכל מיליליטר של ליאזט פינה, להוסיף 300 microliters של חטוזי חלבון G. סותמים מחדש את מכסה הצינור עם סרט מעבדה ומסתובבים במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. מניחים את צינור הדגימה על מתלה המגנט כדי לאפשר לחרוזים להיפרד מהליזת IPed.
פיפטה את זרימה דרך ליאזט ולהשליך, שמירה על חרוזים. מוסיפים 800 מיקרוליטרים של מאגר שטיפת מלח גבוה ללח. מניחים את הצינור על מסובב במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
מניחים את צינור המדגם על מתלה המגנט ומאפשרים לחרוזים להיפרד מהכביסה. הסר והשליך את הכביסה. מוסיפים עוד 800 מיקרוליטרים של מאגר שטיפת מלח גבוה ללח.
סגור את הצינור ולאפשר לו להסתובב במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. מניחים את צינור המדגם על מתלה המגנט ומאפשרים לחרוזים להיפרד מהכביסה. הסר והשליך את הכביסה.
חזור על השטיפה פעם נוספת. לאחר הכביסה, מוסיפים 3.5 מיקרוליטר של 14.2 בטא-mercaptoethanol טוחן לחרוזים ומערבבים על ידי מערבולת במשך 15 שניות. יש לחלץ RNA באמצעות ערכת טיהור RNA מסחרית בהתאם להוראות היצרן.
אלוט המדגם ב 30 microliters של מים חינם RNase. אחסן את הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס. במחקר זה, מעט מאוד RNA היה מבודד מן הדגימות חסרות גם Cre או Rpl22HA המדגים את האפקטיביות של פרוטוקול זה כדי להפחית את רקע ה-IP ולבודד אמיתי HA מתויג RNAs ריבוזומלי.
סדרה של נוגדנים בפרוטוקולי בידוד RNA נבדקו בדגימות חיוביות Cre ו- Rpl22HA. תוצאות אלה מראות שלבחירת סוגים של ריג'נטים יכולה להיות השפעה משמעותית על יעילות ה-IP. נבדקה האפקטיביות של מערכת RiboTag לבידוד RNA הקשור לריבוזום.
הן עבור קלט סוג פראי והן עבור גנוטיפים של IP, ריכוז הקלט היה גבוה משמעותית מריכוז ה- IP המציין כי היה יותר RNA בדגימה הקלט. בסך הכל מאגרי RNA, ערכי מספר שלמות RNA היו צפויים להיות קרובים 10 עם RIN גבוה יותר בקורלציה גבוהה יותר להסיק שלמות מדגם ואיכות גבוהה יותר. בעוד שלדגימות ה- IP היה RIN נמוך יותר מהקלטות, ה- RINs היו עדיין בטווח קביל ולא היו תלויים ב- genotype לדוגמה.
מלבד הרבייה ושמירה על תנאים חופשיים RNase, החוקרים צריכים לוודא שהם אוספים ולשמור כל מדגם הציע. RNA הקלט במיוחד הוא המפתח עבור סוגים מרובים של ניתוחים במורד הזרם. עבור המעבדה שלנו, אנו מבצעים בדרך כלל ריצוף RNA לאחר immunoprecipitation.
זה מאפשר לנו לתבוע את כל כיפת התמליל עבור אסוציאציה ריבוזום. חלופות יכללו ניתוח microarray או RT-PCR כמותי. עבורנו, מערכת זו מאפשרת לנו לזהות שינויים ב- RNAs הקשורים לריבוזום עם מוטציה של חלבונים מחייבים RNA ספציפיים.
