Bu çalışma Sağlık Araştırma Kanada Enstitüsü (CIHR) (MOP-97.774) ve Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Kurumu (: 480.619 NSERC, hibe nr) tarafından finanse edildi. KS KRESCENT Yeni Araştırmacı Ödülü (Kanada, Kanada Nefroloji Derneği ve Sağlık Araştırması Kanada Enstitüsü Böbrek Vakfı ortak bir ödül) Araştırma ve Yenilik Ontario Bakanlığı Erken Araştırmacı Ödülü&#39;nü almıştır. FW Li Ka Shing burs tarafından desteklenmektedir.

1. E. Dönüşüm pGEX-RhoA (G17A) Construct ile coli <ol><li> 100 ml dH 2 O da 2.5 g LB ve 1,5 g Agar eriterek LB-Agar hazırlayın Otoklav ve bir kural olarak, şişeyi rahatlıkla tutulabilir zaman bir tahmini 50-55 ° C, serin. </li><li> DH 2 O 50 mg / ml eriterek ampisilin (Amp) stok hazırlayın Şırınga filtre ve kullanılmayan alikotları dondurma. 1.1 LB-Agar Amp stoğu 100 ul (nihai konsantrasyon 50 ug / ml) eklenir. Karıştırın ve 10 cm bakteriyel yemekleri (15-20 ml / çanak) boşaltılıp girdap. Katılaşmaya (15-30 dak.) Ve 2-3 hafta boyunca 4 de ters kullanılmayan tabak ° C saklamak için izin verin. </li><li> E. dönüştürmek için Coli, hızlı bir şekilde, bir buz banyosu içinde DH5α yetkin bir hücre porsiyonunun çözünmesi. 25-50 ng / ml &#39;ye seyreltilerek pGEXRhoA (G17A) DNA&#39;nın 1 ul ekleyin. 30 dakika buz üzerinde karıştırmak ve inkübe için tüp hafifçe vurun. 45 saniye ile 2 dakika için geri buz üzerinde yer için 42 ° C de ısı şok. Ekle 900 &amp; mu; L SOC orta ve çalkalanarak 37 ° C&#39;de bir saat boyunca büyür. </li><li> Boynu bükük steril Pasteur pipeti kullanarak LB-Agar-Amp plaka üzerinde dönüştürülmüş bakteri 50-100 ul yayıldı. 5 dakika 37 ° C inkübatör içinde plaka sağ tarafı yukarı inkübe edin ve sonra ters ve geceleme büyür. </li><li> Tek bir koloni GST-etiketli protein (adım 2.1) hazırlanması için plakadan alınacak. Gelecekte kullanmak için, şal ve plakları yaklaşık 3 hafta boyunca 4 ° C de ters. Buna ek olarak, bakteriyel stokları çalkalama ile 37 ° C de bir gece 2 ml steril LB-Amp büyüyen bireysel koloniler daha uzun süreli depolama için hazırlanabilir. -80 Azından 1:1 oranında ve dondurucuda steril% 80 gliserol ile bir alikotu karıştırın ° C. </li></ol> 2. GST-RhoA (G17A) Boncuk hazırlanması <ol><li> 1 L dH 2 0 ile 25 g LB ekleyerek ve otoklavlayarak LB hazırlayın. Soğuyunca stoktan 50 ml LB (50 mg / ml son konsantrasyon) için 50 ul Amp ekleyin. Iyi izole col ile inoküledönüştürülmüş bakteri ony ve ajitasyon ile 37 ° C&#39;de gece boyunca büyür. Tam yoğunluk (OD 600&gt; 1.0) az 450 ml LB-Amp ile sulandırmak ve 37 ek bir 30 dakika Büyüyünce ° C </li><li> 10 ml dH 2 O içinde 0.238 g eriterek İzopropil BD-thiogalactopyranoside (IPTG) bir 100 mM stok solüsyonu hazırlayın -20 ° C&#39;de alikotları Mağaza 500 ml&#39;lik kültür (100 uM&#39;lik bir son konsantrasyon) ile IPTG 500 ul 100 mM ekleyerek Rho protein Bakteriler üretmek için indüklemek. 22-24 sıcaklık azaltın ° C ~ 16 saat saat boyunca büyür. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle 3600 g&#39;de kültürü Spin Gerekirse, 500 ml kültürü santrifüj için 50 ml&#39;lik tüplere ayrılabilir. -80 En az 1 saat (ya da tercihan bir gece boyunca) için donma pelet (ler) i ° C. </li><li> 20 mM HEPES (0.95 g) / pH 7.5 ihtiva eden 200 ml lizis tamponu hazırlamak; 150 mM NaCl (1,75 g), 5 mM MgCl2 (0,203 g),% 1 TX-100 (2 ml) eklenmiştir. 1M DTT (10 ml dH 2 O içinde 1.542 g stok çözeltileri hazırlayın) Ve 100 mM PMSF (0,174 g/10 mL EtOH). Lizis tamponu + hazırlamak için, 1 mM DTT (stok 10 ul) ve 1 mM PMSF (stok 100 ul) ve bir Komple Mini Proteaz İnhibitör tablet ile 10 ml&#39;ye tamamlayacak. </li><li> Buz üzerinde çalışarak, 10 ml lizis tamponu eklemek + adım 2.3 &#39;peletlerine. Nazik vortekslendi, pipetleme iyice süspanse edin. Köpük kaçının. % 50 darbe ile 4 ayarı 1 dakika için buz üzerinde sonikasyon. 4 ° C&#39;de 15 dakika süreyle 15.000-20.000 g&#39;de sonike lizat dönerler ve steril bir kapatılmış 15 ml tüpüne açıklık sonikasyon (süpernatan) kaldırın. </li><li> Yavaşça 15 ml tüp içine% 75 bulamaç ve transfer 335 ul içeren orijinal tüp karıştırarak Glutatyon Sepharose hazırlayın. Boncuk Pipeti için geniş bir delik ucu kullanın. 10 ml soğuk PBS ekleyin ve 4, 5 dakika boyunca 500 g dönmeye ° C. , Süpernatant atın boncuk 1 ml lizis tamponu + eklemek ve önceki yıkama gibi dönerler. % 50 bulamaç yapmak için süpernatan ve eklenti lizis tamponu + atın. </li><li> Equil 250 ul ekleAdım 2.5 den süpernatan için boncuk bulamaç ibrated. 45 dakika boyunca 4 ° C&#39;de dönerler. </li><li> 20 mM HEPES (2.38 g) ihtiva eden 500 ml HBS / pH 7.5 ve 2 dH O., 150 mM NaCl (4.38 g) hazırlanmak 1M MgCl2 (10 ml dH 2 O 0,952 g) ve 1 M DTT (10 ml dH 2 O 1,542 g) bir stok çözelti hazırlamak. HBS + hazırlamak için, 100 ml takviye sadece 5 mM MgCl2 (stoktan 50 ul) ve 1 mM DTT (stoktan 100 ul) ile kullanmadan önce. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 g&#39;de adım 2.7 den boncuklar Spin 10 ml lizis tamponu + 2x süpernatan ve yıkama boncuk atın ve 10 ml HBS + ile 2x. Nihai yıkamadan sonra, HBS olarak boncuklar + BD BaculoGold proteaz inhibitörü (BD 50x BaculoGold / ml, 20 ul) ile desteklenmiş resuspending bir 50% bulamaç. </li><li> Β-merkaptoetanol içeren 2x Laemmli numune tamponu ile son boncuk hazırlık 10 ul sulandırınız. Bovine Serum Albumin (BSA) standartlarına olun. 2 mg / ml stok (1 BSA 0.02 g kullanın0 ml dH 2 O). DH 2 O ve 10 ul Laemmli (son 10 mikrogram) 5 ul stoku 5 ul; ve 7.5 ul dH 2 O ve 10 ul Laemmli 2.5 ul stoku 10 ul Laemmli (son 20 mikrogram) ile stok 10 ul Mix (5 ug final). Tüm örnekler (5 dakika) kaynatın. Boncuk örnek Spin ve% 10&#39;luk SDS-poliakrilamid jel BSA standartları ve molekül ağırlığı işaretleri ile süpernatant çalıştırın. </li><li> Ve destain çözeltisi (500 ml dH 2 O, 400 ml metanol ve 100 ml asetik asit) (10 ml asetik asit, 40 ml metanol ve 50 ml dH 2 O 0.1 g) Comassie mavi boya hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın. 20-30 dakika jel leke, boya kaldırın (birden çok kez tekrar kullanılabilir) ve iki kez destain çözümü ile durulayın. Bantlar net bir şekilde görülebiliyor kadar birkaç saat hafif sarsıntı ile destain devam edin. </li><li> Referans (Şekil 2) olarak BSA kullanılarak standart boncuklar akuple GST-RhoA (G17A) konsantrasyonunu tahmin. Aliquo1.5 ml mikro santrifüj tüplerine ~ 10-15 mikrogram protein içeren boncuk t eşit hacimde. Deposunda boncuklar 4 ° C sıcaklıkta bir gün içinde kullanıma. -80 ° C&#39;de donarken HBS C birkaç gün içinde kullanıma 3:1 oranında + / gliserol. </li></ol> 3. Nükleotid-free RhoA (G17A) Boncuk ile GEF Pulldown Testi <ol><li> Birleştiği 10 cm yemekleri hücreleri büyümek. Serum en az 3 saat boyunca mahrum ve gerektiği gibi davranın. </li><li> Lizis tamponu hazırlayın + adım 2.4 gibi. 700 ul / çanak artı hataları pipetleme sağlamak için bazı ekstra miktarı kadar lizis tamponu hazırlayın. Kullanmadan önce proteaz inhibitörleri ekleyin. </li><li> Buz üzerinde çalışarak, yemeklerin kültür ortamı çıkarın ve buz gibi soğuk HBS ile yıkayın. Bütün HBS çıkarın ve her yemek için 700 ul lizis tamponu + ekleyin. Tüm alanlarını kapsayacak girdap plakalar, kazıyorum ve numaralı 1.5 ml tüpler içine lizatları toplamak. 4 az 1 dakika ° C için 15,000 g Spin Süpernatant deneyi için kullanılacaktır. </li><li> Cep numarası tüm eşdeğer iseyemekleri test ediliyor, bir protein testi yapıyor atlarsanız, ve 3.5 adıma taşıyabilirsiniz. Aksi takdirde Bio-Rad hızlı protein metodu kullanarak her süpernatan protein konsantrasyonu ölçmek ve hacim ve konsantrasyon için supernatant eşitlemek. Toplam protein miktarı (LLC-PK1 hücrelerinde için tipik olarak 1-1,5 mg protein) kullanılır hücre tipleri bağlıdır. </li><li> Laemmli numune tamponu, kaynatın azaltarak 30 ul 2x her süpernatan ve karıştırın 30 ul çıkarın ve adım 3.7 için bir kenara koyun. Adım 2.12 GST-RhoA (G17A) boncuk hacimde kalan süpernatantlar ekleyin. 4 ° C&#39;de 45 dakika süreyle döndürmek </li><li> 4 ° C&#39;de 10 saniye süreyle 6800 g boncuk Spin Süpernatant atın ve yıkama arasında aynı şekilde iplik, lizis tamponu ile 3x boncuklar yıkayın. Tamamen bir 30 G iğne ile donatılmış bir 1 cc şırınga kullanarak nihai yıkama kaldırmak ve Laemmli örnek arabelleğini azaltarak 20 ul 2x ekleyin. 5 dakika kaynatın. Pelet boncuk Spin ve ya hemen süpernatant çalıştırın (tercihen) veya saklayabilirsinizt -80 ° C daha sonra analiz için. </li><li> Eğer okuyan GEF boyutu için uygun bir yüzdesi SDS-poliakrilamid jel üzerinde, 20 ul toplam hücre lizatları ve çöken protein numunelerin hepsi çalıştırın. Batı spesifik bir antikor kullanarak blotting ile seçtiğiniz GEF algıla. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Kısım 1 ve protokolün 2 SDS-PAGE ile (Şekil 1 protokolünün anahat bkz) tarafından GSH-Sepharose boncuklar ve test akuple GST-RhoA (G17A) hazırlanması açıklanmaktadır. Tipik bir Coomassie lekeli jel Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Elüsyonlanan protein ile numune yaklaşık 50 kDa (Şekil 2, şeritli 6) tek bir şerit içermelidir. Protein konsantrasyonu BSA referans örnekleri kullanılarak tahmin edilebilir. Şekil 2, örnek olarak, RhoA (G17A) konsantrasyonu 15 ul μg/10 olduğu tahmin edilmektedir. Böylece, 10 ul / tüp alikotları hazırlandı. Tipik verim<html> Elimizde 10 ml bakteriyel lizis 15-20 mikrogram proteindir. Protokol Bölüm 3 afinite yağış assay (Şekil 1 genel bakış) açıklar. Değişim faktörü GEF-H1 aktivasyonu tespit başarılı GEF tahlil Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. RhoA (G17A) proteini GEF-H1 bazal aktivite olduğunu düşündüren, kontrolü (işlenmemiş) hücre lizatları bazı GEF-H1 ele geçirdi. Miktarı ise TNF-α GEF-H1 5,7 aktive olduğu görüşüyle ​​tutarlı inflamatuvar sitokin TNF-α (TNF-α) ile tedavi edilen hücrelerde artış, hızlandırdı. Önemlisi, toplam hücre lizatları tedavi GEF-H1 seviyelerini değiştirebilir olmadığını düşündüren, kontrol ve tedavi örnek GEF-H1 benzer miktarlarda göstermek ve analizinde kullanılan girdi eşittir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" /> Şekil 1. Protokol bakış. ove_content &quot;&gt; <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" /> Şekil 2. Boncuk hazırlık protokolü Temsilcisi sonucu. Başarılı GST-RhoA (G17A) boncuk hazırlanması ile bir Coomassie lekeli jel gösterilmiştir. Boncuk örnek ve BSA protein standartları% 10 akrilamid jel kullanılarak SDS-PAGE ile ayrıldı. Boncuklar test etmek için, GST-RhoA (G17A) ihtiva eden nihai bulamaç boncuk 10 ul 5 dakika boyunca Laemmli numune tamponu ve kaynatılmış azaltılması ile 01:01 seyreltilir. Boncuklar kısaca eğrilmiş ve süpernatan jel üzerinde yüklendi. Aşağıdaki örnekler yüklendi: Hat 1: moleküler ağırlık belirteci (MW) (FroggaBio BLUeye protein merdiven prestained); Lanes 2-4: 5, 10 ve 20 mikrogram (BSA) Bovine Serum Albumin; Lane 5 boş; Lane 6: 10 taze hazırlanmış RhoA (G17A) boncuk ul. Ayırma işlemi tamamlandıktan sonra, jel Coomassie Blue kullanılarak lekelenmektedir ve daha sonra proteinler ortaya çıkarmak için destained edilir. GST-RhoA (G17A) proteini moleküler ağırlığı yaklaşık olarak 50<html> 48 kDa marker seviyesi civarında kDa ve çalışır. Bu özel örnekte GST-Rho protein konsantrasyonu 15 ul μg/10 bulamaç olduğu tahmin edilmektedir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" /> GEF-H1 TNF-α-indüklenen aktivasyonu gösteren Şekil 3. Temsilcisi GEF aktivasyon testi. Konfluent LLC-PK1 hücrelerinde 5 dakika için 10 ng / ml TNF-α ile muamele edildi. Tedavi sonrası hücreleri parçalanır edildi ve aktif gefs GST-RhoA (G17A) bağlı boncuklar kullanılarak çekilen. Çöken proteinler (üst leke) ve total hücre lizatı örnekleri (alt leke) olarak GEF-H1 varlığı Batılı bir anti-GEF-H1 antikor (Hücre Sinyalizasyonu) ile kurutma ile tespit edildi. Başarılı bir sonuç gösteren, eşdeğer girişlerine göre arıtılmamış hücreleri karşı TNF-α-tedavi edilen çöken GEF-H1 artan miktarda unutmayın. 3932/3932fig4.jpg &quot;/&gt; Şekil 4. Bir &quot;kötü sonuç&quot;. GEF açılan assay burada gösterildiği boncuklar tarafından yakalanan bazı GEF-H1 sonuçlanmıştır rağmen, miktarda kumandadan çöktürüldü ve TNF-α-tedavi edilen hücreler aynıdır. Böylece, TNF-α, bu durumda GEF-H1 bir Know aktivatörü aktivasyon neden olmadı. Bu özel deney sonraki sorun giderme kullanılan TNF-α yeterince taze ve muhtemelen bozuk olmadığını ileri sürdü.

<ol>
	<li>Jaffe, A. B., Hall, A. R. h. o. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases:+biochemistry+and+biology.">GTPases: biochemistry and biology.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 247-269 (2005).</li><li>Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF+means+go:+turning+on+RHO+GTPases+with+guanine+nucleotide-exchange+factors.">GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 167-180 (2005).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li><li>Garcia-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+activated+GAPs+and+GEFs+in+cell+lysates.">Analysis of activated GAPs and GEFs in cell lysates.</a> Methods Enzymol. 406, 425-437 (2006).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF-H1+Mediates+Tumor+Necrosis+Factor-{alpha}-induced+Rho+Activation+and+Myosin+Phosphorylation:+role+in+the+regulation+of+tubular+paracellular+permeability.">GEF-H1 Mediates Tumor Necrosis Factor-{alpha}-induced Rho Activation and Myosin Phosphorylation: role in the regulation of tubular paracellular permeability.</a> J. Biol. Chem. 284, 11454-11466 (2009).</li><li>Waheed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal+regulated+kinase+and+GEF-H1+mediate+depolarization-induced+Rho+activation+and+paracellular+permeability+increase.">Extracellular signal regulated kinase and GEF-H1 mediate depolarization-induced Rho activation and paracellular permeability increase.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. , (2010).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+mediates+tumor+necrosis+factor-alpha-induced+activation+of+the+ERK/GEF-H1/RhoA+pathway+in+tubular+epithelium.">The epidermal growth factor receptor mediates tumor necrosis factor-alpha-induced activation of the ERK/GEF-H1/RhoA pathway in tubular epithelium.</a> J. Biol. Chem. 286, 9268-9279 (2011).</li><li>Garcia-Mata, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+a+GEF+by+its+tail.">Catching a GEF by its tail.</a> Trends Cell Biol. 17, 36-43 (2007).</li><li>Dubash, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+RhoA+localizes+to+the+nucleus+and+is+activated+by+Net1+and+DNA+damage+signals.">The small GTPase RhoA localizes to the nucleus and is activated by Net1 and DNA damage signals.</a> PLoS One. 6, e17380-e17380 (2011).</li><li>Guilluy, G., Dubash, A. D., Garc&#237;a-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RhoA+and+Rho+GEF+activity+in+whole+cells+and+the+cell+nucleus.">Analysis of RhoA and Rho GEF activity in whole cells and the cell nucleus.</a> Nature Protocols. , (2011).</li><li>Guilluy, C., Swaminathan, V., Garcia-Mata, R., O'Brien, E. T., Superfine, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GEFs+LARG+and+GEF-H1+regulate+the+mechanical+response+to+force+on+integrins.">The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins.</a> Nature Cell Biology. 13, 722-727 (2011).</li><li>Dubash, A. D., Wennerberg, K., Garcia-Mata, R., Menold, M. M., Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Lsc/p115+RhoGEF+and+LARG+in+regulating+RhoA+activity+downstream+of+adhesion+to+fibronectin.">A novel role for Lsc/p115 RhoGEF and LARG in regulating RhoA activity downstream of adhesion to fibronectin.</a> J. Cell Sci. 120, 3989-3998 (2007).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada anlatılan yöntem hücrelerinde gefs aktif havuz takip edebilir gefs için kullanılabilir radyoaktif olmayan aktivasyon tahlil oluşturmaktadır. Aşağıdaki deney, küçük GTPases aktivasyon gibi Rac ve Cdc42 karşı gefs için kullanılan çöktürme deneyleri ile benzerdir. Bu testler, farklı GST-etiketlenmiş proteinleri kullanmak ve burada açıklanan birinden ufak farklar vardır, ancak bazik adımları aynıdır. Dolayısıyla, bu protokol kolayca diğer küçük GTPaz ve GEF aktivasyon deneyleri için adapte edilebilir. Sunulan GEF deneyi son zamanlarda nükleer kesirler 9,10 başvurusu için güncellenmiştir. Daha fazla değişiklik ile, diğer Subselüler bölümlerinde GEF aktivasyon testi de mümkün olabilir. Biz epitel hücre hatları 5,6,7 yılında gefs aktivasyonunu incelemek için sunulan yöntemini kullanın. Bazı iyileştirme sayesinde, bu tahlilde herhangi bir hücre hattından gefs tespit etmek için yeterli olmalıdır. Zaman adaptiBelirli bir hücre türüne ng, test edilecek GEF için optimum hücre sayısı, lizis tamponu hacmi ve algılama yöntemi (Western blot için iyi bir antikor önemli edilir) bulabilirsiniz. Testin ilk kurulum için bu ilgi GEF etkinleştirmek için bilinen bir uyarıcı kullanımı önerilir. Bilinmeyen bir uyaran kullanırken, her zaman tahlil çalıştığını doğrulamak için, pozitif kontrol kullanın. Bu testte Western blot ile bilinen gefs aktivasyonu tespit etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu bilinmeyen gefs tanımlamak için de uygundur. Bunun için, kontrol ve teşvik örneklerinden yakalanan gefs bir Coomassie lekeli jel üzerinde analiz edilmelidir. Sadece uyarılan örnekleri görünür Gruplar aktive gefs içerebilir ve kütle spektrometresi (örneğin 5) tanınmanız için gönderilebilir. Son olarak, uyarıcı bir not. Testi aktif gefs render posttranslasyonel değişiklikler hücre parçalama sonra korunmuş olduğu varsayımına dayanmaktadır. Nitekim, bu açıkça cagefs bir dizi se, ve kuruluşlar, çünkü bu tahlilde GEF-H1, p115RhoGEF ve XPLN (örn. 5,11,12,13) ​​dahil olmak üzere farklı gefs, aktivasyonu tespit etmek için çeşitli gruplar tarafından kullanılmaktadır. Etkin devlet korunması ancak tüm gefs durumunda olay değildir ve bu nedenle bu testte tüm gefs için işe yaramaz olduğunu düşünülebilir. Ayrıca, çok sayıda gefs birden fazla küçük GTPases doğru aktivitesinin olduğu, not edilmelidir. Bu nedenle, belirli bir GEF, incelendiğinde, bu RhoA, Rac1 ve Cdc42 inceleyerek diğer küçük GTPases gibi fonksiyonel çalışmalar için GEF çöktürme deneyleri ile bu tahlilde tamamlamak üzere tavsiye edilir. Protokol Kritik adımlar: Dönüştürülmüş bakteri kolonileri Amp, iyi üremeyi ve verim tarafından yeterli seçimini sağlamak için taze, düzgün hazırlanmış plakalar aldı edilmelidir. Diğer kaynaklardan alınan yetkin hücreleri için bir dönüşüm koşullarına göre değişebilir ve danışılmalıdır. </p&gt; Protein hazırlanması protokolü (adım 2.3 &#39;) ve deney (adım 3.2) her adım ° C&#39;ye soğutulmuş çözeltiler ve santrifüj ile 4 yapılmalıdır. Bakteriyel lizis (adım 2.5) homojen bir süspansiyon elde etmek için tam ve eksiksiz olmalıdır. Bakteriler, vorteks parçalama ve 4 ° C&#39;de muhafaza ederken bu, dönüşümlü olarak lizat pipet ve sonikasyon protein denatüre önlemek için buz üzerinde yapılır temin zaman. Sonikatör farklı bir model kullanılarak ise, koşulları ayarlanabilir gerekebilir. Boncuklar ile sonikasyon inkübasyonu her zaman yeterli bağlayıcı sağlamak için bir rotator üzerine 4 ° C de yapılmalı ve bakım zamanlaması tutarlı olmasına dikkat edilmelidir. GST-Rho mutant bakteri ifade zaman biraz kararsız, bu yüzden hemen veya birkaç gün içinde hazır boncuk kullanmak en iyisidir. Yağış assay (Bölüm 3), zaman ve sıcaklık duyarlı biraktif GEFS kolayca hücre lizatı kayıp olabilir, bu nedenle adımları en kısa sürede yapılmalıdır. Aşağıdaki bölümde, bazı sorun giderme ipuçları içermektedir. No veya nihai boncuk hazırlanmasında mutant Rho proteininin çok düşük bir miktarda: Bu verimsiz bir indüksiyon, bakteri yeterli parçalanma veya hazırlama işlemi veya depolama sırasında protein kaybına neden olabilir. Bu olasılıkların bazı gidermek için, bakteri örnekleri indüksiyondan önce ve sonra analiz edilebilir. Protein taze çizikli plakadan veya yeniden dönüştürülmüş yetkili hücrelerinden bir koloni kullanarak işlemi tekrarlayın kötü indüksiyon varsa. Farklı IPTG konsantrasyonları ve indüksiyon kez de test edilmelidir. Lizis lizis tamponu içinde tuz ve deterjan konsantrasyonları değişen (yani proteini yerine süpernatan pelet içinde kalır) yetersiz ise denenebilir. Alternatif sonikasyon süreleri veayarları düşünülmelidir ve sonication önce ve sonra numuneler erimesinin etkinliğini belirlemek için mikroskop ile kontrol edilebilir. Hayır GST-protein boncuklar üzerinde mevcut olmasına rağmen, GEF çöktürülür: Bu yağış tahlil sırasında teknik sorunlar nedeniyle, ya da uygulanan teşvik kullanarak okudu GEF aktivasyon gerçek yokluğu olabilir. Her zaman tahlil çalıştığını doğrulamak için pozitif kontrol olarak bilinen bir uyarıcı kullanın. Birkaç gün içinde hazır boncuk kullanın. Çöktürme assay tüm koşullarda çalışılan GEF saptanamaz miktarda yakalar durumunda, GEF bulunur ve assay (adım 3.3) için kullanılacak olan santrifüjlemeden sonra üstte yüzen madde içindeki kadar, algılanabilir olduğunu doğrulamak. Tüm tamponları ve proteaz inhibitörleri taze ve mümkün olduğunca hızlı buz tüm adımları uygulayın emin olun. Giriş protein (2 tabak / örnekten lizatları kullanarak gibi) miktarını artırın. Yağış tahlil bazal çökelme gösteriyorsaLütfen GEF kalmış, ama hiçbir fark kontrolü ve uyarılan örnekleri (Şekil 4) arasında görülür, uygulanan teşvik bilinen diğer etkileri (diğer sinyal yollarının aktivasyonu tespit ederek örneğin) kullanarak çalıştı doğrulayarak gidermeye başlamak. Tedavi şartları ve / ya da konsantrasyonları değişen düşünün. Lütfen uyaran olasılıkla süreleri ve konsantrasyonları tahmin Rho veya diğer sinyal aktive nasıl edebiyat raporlama verilerine güvenin. GEF aktivasyon iyi tespit Rho aktivasyon öncesinde bir zaman noktasında iyi tespit olabileceği gibi tedavi süresi optimize ederken, hem kısa hem de uzun zaman noktalarını kullanın. Son olarak, aynı uyaran kanal adedi sebep olduğu hücre duyarlılığında bir değişiklik nedeniyle aktivasyonunun bir değişken derecesi, konfluent hücresi, vs sonuçlanabilir

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> pGEX-RhoA (G17A) </td><td> Addgene </td><td> Yakında hazır olacak </td><td> Dr Keith Burridge (North Carolina Üniversitesi) (ref 3) laboratuvarı oluşturuldu </td></tr><tr><td> DH5α </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> Mağaza -80 ° C </td></tr><tr><td> SOC orta </td><td> BioShop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> BioShop </td><td> LBL407.1 </td><td> Steril tutun </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> BioShop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td> Ampisilin </td><td> BioShop </td><td> AMP201.25 </td><td> -20 ° C&#39;de Mağaza stok </td></tr><tr><td> Agar </td><td> BioShop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (Isopropil BD-thiogalacto-pyranoside) </td><td> Calbio-kimya </td><td> 420322 </td><td> -20 ° C&#39;de deposunda stok solüsyonu </td></tr><tr><td> Glutatyon Sepharose boncuk </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> SIGMA </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> SIGMA </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> SIGMA </td><td> M-9272 </td><td> Hemen önce kullanın ekle </td></tr><tr><td> TX-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td> Hemen önce kullanın ekle </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> SIGMA </td><td> P-7626 </td><td> Hemen önce kullanın ekle </td></tr><tr><td> Proteaz İnhibitör 50x </td><td> BD Baculo-Altın </td><td> 51-21426Z </td><td> Hemen önce kullanın ekle </td></tr><tr&gt; <td> Komple Mini, EDTA serbest 10x </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td> Hemen önce kullanın ekle </td></tr><tr><td> Laemmli Örnek Tampon 2x </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> SIGMA </td><td> M7154 </td><td> Hemen önce kullanın ekle </td></tr><tr><td> Coomassie Brillant Blue </td><td> Bio-Rad </td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td> Asetik asit </td><td> Caledon </td><td> 1000-1 </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Caledon </td><td> 6701-7 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Rad Protein Testi </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> BLUeye merdiveni </td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Reaktifler kullanılır. <table border="1"><tbody><tr><td> Ekipman Adı </td><td> Şirket </td&gt; <td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> RC-5B santrifüj </td><td> Sorvall </td><td> SS-34 Rotor </td><td> 4 az kullanın ° C </td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Sorvall-Thermo Scientific </td><td> ST-16R </td><td> 4 az kullanın ° C </td></tr><tr><td> Mikro santrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> 4 az kullanın ° C </td></tr><tr><td> Bakteriyel çalkalayıcı </td><td> INFORS HT Ecotron </td><td> AG, CH-1403 Bottmingen </td><td> 37 ° C&#39;de 22 ya da kullanmak ° C </td></tr><tr><td> Sonicator </td><td> Branson </td><td> Sonifier-450 </td><td> RT de kullanın </td></tr><tr><td> Rotator </td><td> Glas-Col </td><td> 099A CR4012 </td><td> 4 az kullanın ° C </td></tr></tbody></table> Kullanılan Tablo 2. Özel ekipmanları.

affinity precipitation of active rho-gefs using a gst-tagged mutant rho protein (gst-rhoa(g17a)) from epithelial cell lysates

Küçük GTPases ve Rho ailesinin Proteinler hücre iskeletinin merkezi düzenleyiciler, ve hücre göçü, gen ekspresyonu, hücre döngüsü sürecinde ve hücre yapışması 1 gibi hücresel süreçleri büyük bir çeşitlilik, kontrol. Rho proteinleri GSYİH bağlı devlet GTP bağlı ve inaktif aktif olan moleküler anahtarları vardır. Onların aktivasyon Guanin nükleotid Değişim Faktörü (GEF) bir protein ailesi tarafından aracılık edilir. Rho-GEFS özgüllük 2 örtüşen, büyük bir aile oluşturur. Pek çok gelişme belirli sinyalleri aktive gefs belirleme yapılmış olmasına rağmen, bu proteinlerin yol özgü düzenlenmesi ile ilgili kalan birçok soru hala vardır. Rho-gefs sayısı 70 aşar, ve her bir hücre, birden fazla GEF proteini ifade eder. Ayrıca, bu proteinlerin birçok Rho sadece etkinleştirmek, ancak ailenin diğer üyeleri, düzenleyici ağların karmaşıklığı daha fazla katkıda bulunacak. Önemlisi, keşfetmeknasıl gefs düzenlenir farklı stimuli ile aktif hale hücrelerinin tek tek gefs aktif havuz izlemek için bir yöntemi gerektirmektedir. Burada bir yakınlık yağış testi kullanılarak kullanılabilir aktif Rho özgü gefs değerlendirmek ve ölçmek için kullanılan bir yöntem için bir adım-adım protokol sağlar. Bu tahlil Burridge laboratuar 3,4 birkaç yıl önce geliştirilen ve böbrek tübüler hücre hatları 5,6,7 kullanmıştır. Testi aktif gefs için yüksek afiniteli bir &quot;nükleotid özgür&quot; mutant RhoA yararlanır. Mutasyon (G17A) GSYİH veya GTP ve bu devletin GEF bağlı ara durumda taklit bağlamak için protein yapamaz hale getirir. Bu mutan protein A GST-etiketli versiyonu ifade ve E. arındırılan coli, glutatyon Sepharose boncuk bağlı ve tedavi edilmezse ve uyarılmış hücre lizatları aktif gefs çöktürmek için kullanılır. En GEFS inhibitör bağlamaları gelen posttranslasyonel değişiklikler veya yayın, onların aktif devlet aracılığıyla aktive olarakHücre lizatlarının muhafaza edilir, ve bunlar bu tahlilde 8 ile tespit edilebilir. Yakalanan proteinler Western blot kullanarak spesifik antikorların saptanması ile bilinen gefs için probed, ya da belirli uyaranlarla aktive bilinmeyen gefs tanımlamak için kütle spektrometresi ile analiz edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates at JoVE.com

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

Burada anlatılan yöntem aktive gefs için yüksek afinitesi olan bir mutantı RhoA GST füzyon proteini yararlanarak kültürlenmiş hücrelerde RhoA spesifik GDP / GTP Değişim Faktörleri (gefs) aktivasyonu takip etmek için bir ölçüm açıklanmaktadır. GEFS Western blot ve dansitometreyi miktarı tespit hücre lizatları, çöktürülmesi ile elde edilir.

Epitel Hücre lizatları bir GST-etiketli Mutant Rho Protein (GST-RhoA (G17A)) Kullanarak Active Rho-gefs ve Affinity Yağış

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

affinity-precipitation-active-rho-gefs-using-gst-tagged-mutant-rho

Research

JoVE Journal

Biology

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

16.5K Görüntüleme.  St. Michael's Hospital. Burada anlatılan yöntem aktive gefs için yüksek afinitesi olan bir mutantı RhoA GST füzyon proteini yararlanarak kültürlenmiş hücrelerde RhoA spesifik GDP / GTP Değişim Faktörleri (gefs) aktivasyonu takip etmek için bir ölçüm açıklanmaktadır. GEFS Western blot ve dansitometreyi miktarı tespit hücre lizatları, çöktürülmesi ile elde edilir.