המחברים מודים לצוות המחלקה לביוטכנולוגיה התרופות לביולוגיה מולקולרית ובמיוחד מוניק דה Pelsmacker להכנת וירוס מסומן רדיואקטיבית. אנו מודים אלן Merckx ו Hadewych Halewyck על דבריו המעניינים שלהם ודיונים וכדי חריט דה Bleeser על עזרתו במעבדה. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי מענק של OZR מהאוניברסיטה Vrije בריסל (OZR1807), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek פלנדריה (G.0168.10N) ואת ארגון הבריאות העולמי (ה-TSA 200410791). ליזה Schotte הוא עמית predoctoral של Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek פלנדריה (FWO).

העיקרון (A) סקירה של השיטה (ב &#39;) מתוארים באיור 1. 1. הכנת מאגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את עקידת / Wash חיץ ידי המסת סודיום פוספט dihydrogen (50 מ&quot;מ), סודיום כלוריד (300 מ&quot;מ) במים ולהתאים את ה-pH ל 8.0. בנוסף להוסיף Tween 20 (0.01% (מ &#39;/ V) הריכוז הסופי), מתיונין (2% (m / v) ריכוז סופי) ו אלבומין (0.1% (ז / נ) הריכוז הסופי) ולהתאים את עוצמת הקול הנדרשת. </li></ol> 2. הכנת החרוזים מגנטיים הכינו את החרוזים מגנטי על פי להוראות במדריך. בקצרה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים מגנטי באמצעות מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה, עבור מדגם זה, 10 μl של חרוזים מגנטיים resuspended (40 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לתוך צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את החרוזים מגנטי באמצעות מגנט, עד supernatant ברור (+ / - 30 שניות) ולהסיר supernatant בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף אתחרוזים מגנטיים פעמיים: resuspend את החרוזים ב μl 150 של המאגר המאוחד / Wash. להעביר את החרוזים מגנטי לצד אחד של הצינור באמצעות מגנט עד supernatant ברור ובזהירות להסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 40 μl של המאגר המאוחד / Wash, עבור מדגם זה, כדי resuspend את החרוזים (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל). </li></ol> 3. זיקה Assay לכידת הערה: כדי למדוד את הקרינה (הקוסמית) הרקע (0% רדיואקטיביות), אין וירוסים radiolabeled נוסף מדגם שליטה 1. במקום זאת, נפח אותו איגוד / Wash חיץ נוסף. הערה: רדיואקטיביות 100% מוגדר על ידי 2 השליטה מדגם שבו כל הרכיבים פרט נוסף Nanobody. במקום זאת, נפח אותו איגוד / Wash חיץ נוסף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא 2000 עותקים לדקה של 35 שכותרתו S (β-קרינה) poliovirus סבין זן מסוג 1, 9, מדולל המאגר המאוחד / רחצה μl 80 לתוך צלחת 96-גם microtiter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 &amp; MU, L של דילול Nanobody על וולס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים במשך 10 שניות באמצעות שאכר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר דגימות כדי לדגור במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של ההשעיה חרוזים שטף מגנטי דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, תחת ברציפות רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את חרוזים supernatant באמצעות מגנט ולהעביר supernatant פינה לתוך הצינור. </li></ol> 4. מדידה של רדיואקטיביות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 50 μl של supernatant משלב 3.6 לתוך הבקבוק לספור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של נוזל נצנץ ומערבבים. מדוד את הרדיואקטיביות ב counter-β נצנץ. </li></ol> 5. מיחזור החרוזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את החרוזים מגנטיים המשמשים בתוך צינור ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 2 דקות או עד supernatant ברור מתקבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים ב 6 מ&quot;ל 0.5 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה כדי multiplדואר צינורות דגירה באמבטיה קולי במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מגנטים לאסוף את החרוזים מגנטיים ולהסיר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל 2% SDS-פתרון צינור כל resuspend באמצעות מערבולת. מרתיחים במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את החרוזים ולהסיר supernatant. Resuspend החרוזים של 1 מ&quot;ל 0.2 M EDTA (pH = 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות באמבטיה קולי במשך 5 דקות ושוב, להסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של מים בצינור כל resuspend את החרוזים. לאסוף את החרוזים ולהסיר supernatant. חזור על פעולה זו פעמיים בכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים ב 1 מ&quot;ל 10 הפתרון CoCl 2 מ&quot;מ. לשים על שייקר במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant באמצעות מגנט לאסוף את החרוזים ואת resuspend מ&quot;ל 1 מתוך המאגר המאוחד / Wash. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולשטוף את החרוזים פעמיים באמצעות 1 מ&quot;ל של 20% (V / V) אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים בכמות המקורית של 20% (V / V) ethanol להשיג חרוזים שהתחדשו בריכוז של 40 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li></ol> 6. הפרשנות של התוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימת בקרה 1, בו לא וירוס radiolabeled נוסף, ישמש לתיקון רדיואקטיביות רקע כדי לקבוע את ערך רדיואקטיביות 0%. דגימת בקרה 2, אשר אינו מכיל Nanobody והיכן ולכן כל וירוס radiolabeled נשאר supernatant, מוגדר כערך רדיואקטיביות 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיעור הרדיואקטיביות ב supernatant (=%) הוא מדד של כמות המשקעים הכוללת (= 100 -%) של הנגיף radiolabeled ידי Nanobody. </li></ol> 7. נציג תוצאות התוצאות מייצגות עבור assay זה לכידת זיקה מוצגים איורים 2, 3 ו -4. באיור 2, הזיקה של PVSS38C, ספציפית עבור Nanobody poliovirus, יוצג. הזיקה של PVSS38C נבדק במשך שלושה אנטיגנים שונים של poliovאירוס הארגמן: אנטיגן Native-(N-אנטיגן), אנטיגן מחוממת-(H-antigen) ו יחידות משנה 14S. N-האנטיגן הוא וירוס ללא פגע, כי הוא מדבק. כאשר הנגיף מחומם (20 דקות ב 56 מעלות צלזיוס) או מצורף משטח יציב (תוצאות שלא פורסמו), קונפורמציה השינויים קפסיד, וכתוצאה מכך אובדן (חלקי) של RNA נגיפיים חלבון capsid VP4, וריק capsids נוצרים אשר נקראים כך H-אנטיגנים. יחידות משנה 14S הם ביניים הרכבה. אנטיגנים אלה מוכרים על ידי קבוצות שונות של נוגדנים לאחר חיסון 10 ובעלי אפיטופים שונים ולכן ואתרי אנטיגני. באיור אחוז של קרינה רדיואקטיבית נמצאו supernatant מיוצג כפונקציה של ריכוז של Nanobody. ניתן לראות כי בשנת supernatant הרדיואקטיביות של דגימות המכילות יחידות משנה 14S radiolabeled יורדת עם ריכוזים עולים של PVSS38C Nanobody. זה יכול להיות מתורגם כ גידול בסך של poliovirus 14S קון יחידות משנהnected כדי PVSS38C Nanobody ובעקיפין על חרוזים מגנטיים. Titer לכידת (= ריכוז Nanobody צורך ללכוד 50% של הנגיף radiolabeled) ניתן לחשב באופן גרפי כפי 0.099 ננומטר. אין זיקה של PVSS38C עבור אנטיגני-N ו-H-אנטיגני צורה של poliovirus הוא ציין. מנתונים אלה הוא מפורש כי PVSS38C מקיימת יחסי גומלין עם epitope כי קיים אך ורק על למקטע 14S ולא על שתי צורות אחרות של אנטיגני poliovirus. על מנת להוכיח כי אובדן הרדיואקטיביות supernatant רק בשל זיקה מסוימת של Nanobody כלפי אנטיגנים שלו, אותו assay בוצע Nb1, Nanobody שנוצר נגד הרגולטור תעתיק lrpB של sulfataricus Sulfolobus וידוע אין אינטראקציה עם כל אנטיגן poliovirus. התוצאה של assay זה מוצגת באיור 3. כל וירוס radiolabeled נשאר את supernatants מראה כי אין תגובתיות שלNb1 נגד שלוש צורות אנטיגני של poliovirus. שחזור של התוצאות נבדק על ידי חזרה על הניסוי עבור סכום כולל של פי שמונה על 1 Nanobody נתון (כלומר, PVSP29F) בשעה בימים שונים ועל ידי אנשים שונים. התוצאות מוצגות באיור 4. הערך הממוצע של רדיואקטיביות אחוז supernatant חושב על ריכוז כל Nanobody והיא מיוצגת התכתבות עם סטיית התקן שלה. <img alt="באיור 1." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig1.jpg" /> באיור 1. סקירה כללית של עקרון (א &#39;) והשיטה (ב) assay. א &#39;שלו מתויג Nanobodies ספציפית לזהות אנטיגן poliovirus מסוימת יוכלו לתקשר עם קובלט מצופים חרוזים מגנטיים יהיה להאיץ את הנגיף שכותרתו רדיואקטיבית. Nanobodies ב &#39;שלו מתוייגים נוספים poliovirus מסומן רדיואקטיבית ו מודגרות. קובלט מצופים חרוזים מגנטיים הםנוסף והפרדה המגנטי של אנטיגן / מאוגד מאוגד מתבצע. הרדיואקטיביות של supernatant נמדד כמות האנטיגן בשבי ניתן לגזור. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig2.jpg" /> איור 2. זיקה חרוזים מגנטי לכידתו של אנטיגנים שונים poliovirus ידי Nanobody PVSS38C. אחוז של קרינה רדיואקטיבית נמצאו supernatant מיוצג כפונקציה של ריכוז של PVSS38C. עבור 14S יחסים ריכוז התגובה ניתן למצוא, מראה את האינטראקציה של PVSS38C עם epitope כיום באופן בלעדי על 14S. ללא אינטראקציה משמעותית עם N-ולא H-אנטיגן ניתן להבחין, אם כי זניח שאינו ספציפי לכידת בריכוזים גבוהים מאוד, הוא הבחין. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig3.jpg" /> איור 3. זיקה חרוזים מגנטי לכידתו של אנטיגנים שונים poliovirus ידי Nanobody Nb1 </stronז&gt;. אחוז של קרינה רדיואקטיבית נמצאו supernatant מיוצג כפונקציה של ריכוז של Nb1. Nb1 ידוע אין אינטראקציה עם האנטיגן-poliovirus או-למקטע. מאז 100% של קרינה רדיואקטיבית נמצא supernatant, הווירוס לא היה כבול לא במיוחד כדי Nb1. אובדן רדיואקטיביות באיור 2 ולכן רק בשל זיקה מסוימת של Nanobody כלפי אנטיגנים שלה. <img alt="באיור 4." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig4.jpg" /> באיור 4. שחזור של assay. הערך הממוצע של רדיואקטיביות אחוז supernatant מיוצג כפונקציה של ריכוז של Nanobody. הניסוי חזר על עצמו שמונה פעמים בימים שונים ועל ידי אנשים שונים. סטיית התקן מיוצג קווים אנכיים.

<ol>
	<li>Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antiviral+activity+of+single+domain+antibody+fragments+against+poliovirus.">In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus.</a> Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).</li><li>Meloen, R. H., Briaire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+cross-reacting+antigens+on+the+intact+foot-and-mouth+disease+virus+and+its+12S+subunits+with+antisera+against+the+structural+proteins.">A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins.</a> J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).</li><li>Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+quantitative+protein+A+micro-immunoprecipitation+method:+assay+of+antibodies+to+the+N+and+H+antigens+of+poliovirus.">A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus.</a> J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).</li><li>Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+competition+immunoprecipitation+assay+of+unlabeled+poliovirus+antigens.">A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens.</a> J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).</li><li>Kessler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+antigens+from+cells+with+a+staphylococcal+protein+A-antibody+adsorbent:+parameters+of+the+interaction+of+antibody-antigen+complexes+with+protein+A.">Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A.</a> J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).</li><li>Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. a. j. y. a. n. a., Bendahman, E., N, ., Hamers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li><li>Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+identification+of+single+domain+antibody+fragments+from+camel+heavy-chain+antibodies.">Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.</a> FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+domain+camel+antibodies:+current+status.">Single domain camel antibodies: current status.</a> Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).</li><li>Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+evolution+in+poliovirus+maturation.">Epitope evolution in poliovirus maturation.</a> Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).</li><li>Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybridoma+antibodies+to+poliovirus+N+and+H+antigen.">Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen.</a> Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).</li><li>Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+quantitative+affinity+capturing+assay+of+poliovirus+antigens+and+subviral+particles+by+single-domain+antibodies+using+magnetic+beads.">A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads.</a> J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).</li><li>Wild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immunoassay Handbook. , (2005).</li><li>Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+of+human+rhinovirus+capsid+and+analysis+by+capillary+electrophoresis.">Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis.</a> Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).</li><li>Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolar+endocytosis+of+simian+virus+40+reveals+a+new+two-step+vesicular-transport+pathway+to+the+ER.">Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER.</a> Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

בפרוטוקול, רדיואקטיביות של אנטיגן אינטראקציה עם Nanobody מוגדר כאובדן של וירוס radiolabeled מ supernatant. לכן כמות רדיואקטיביות זירז (= 100 -%) (חייב את החרוזים מגנטיים) ניתן להעריך בצורה עקיפה על ידי רדיואקטיביות ב supernatant (=%). מצד שני, אפשר גם למדוד את הרדיואקטיביות של חלק כרוך זירז של ה...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; שם מגיב</strong</td&gt;<td<strong&gt; החברה</strong</td&gt;<td<strong&gt; מספר קטלוגי</strong</td&gt;<td<strong&gt; תגובות</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dynabeads תג שלו בידוד הנפתח</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 101.03D</td&gt;<td&gt; חרוזים מגנטיים</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; &quot;HiSafe&quot; Optiphase 2</td&gt;<td&gt; פרקין אלמר</td&gt;<td&gt; 1200 - 436</td&gt;<td&gt; נוזל נצנץ</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

a liquid phase affinity capture assay using magnetic beads to study protein-protein interaction: the poliovirus-nanobody example

במאמר זה, פשוט, כמותי, שלב נוזלי זיקה assay לכידת מוצג. ובלבד חלבון אחד יכול להיות מתויג חלבון אחר הנקרא, שיטה זו יכולה להיות מיושמת לחקירת אינטראקציות בין חלבונים. היא מבוססת מצד אחד על ההכרה של חלבון מסומן על ידי קובלט חרוזים מגנטיים מצופה ומצד שני על יחסי הגומלין בין חלבון מתויג חלבון מסוים 2, כי הוא מסומן. ראשית, חלבונים שכותרתו מתויג מעורבבים ו מודגרות בטמפרטורת החדר. חרוזים המגנטי, המזהים את תג מתווספות ואת חלק כפות של חלבון הנקרא מופרד חלק מאוגד באמצעות מגנטים. כמות של חלבון הנקרא, כי הוא נתפס ניתן לקבוע באופן עקיף על ידי מדידת אותות של חלבון הנקרא נשאר חלק לא מאוגד. בשלב תיאר נוזל assay זיקה מאוד שימושי כאשר חלבונים המרה קונפורמציה רגישים בתחתעאייד. פיתוח ויישום של assay באה לידי ביטוי לאינטראקציה בין poliovirus ו poliovirus הכרה Nanobodies 1. מאחר שנגיף הפוליו רגיש המרה קונפורמציה 2 כאשר מצורף משטח יציב (תוצאות שלא פורסמו), שימוש ELISA מוגבלת ומערכת שלב נוזלי מבוסס לפיכך יש להעדיף. דוגמה של מערכת השלב נוזלי מבוסס בדרך כלל משתמשים בו polioresearch 3,4 הוא חלבון מיקרו-immunoprecipitation הבדיקה 5. אף על פי בדיקה זו הוכיחה את ישימותה, זה דורש FC-מבנה, אשר נעדרת את Nanobodies 6,7. עם זאת, הזדמנות נוספת, מעניינת ויציבה האלה יחיד תחום נוגדנים 8 יכול להיות מהונדסים בקלות עם תגים שונים. בשימוש נרחב (שלו) 6 תג מראה זיקה יונים דו ערכי, כגון ניקל או קובלט, אשר יכול על לתורם להיות מצופה בקלות על חרוזים מגנטיים. לפיכך, אנו פיתחו את זה כמותית פשוטהלכידת assay זיקה על בסיס קובלט חרוזים מצופים מגנטיים. Poliovirus סומן עם S 35 כדי לאפשר אינטראקציה עם Nanobodies באין מפריע ולעשות גילוי כמותי ריאלי. השיטה קלה לביצוע, ניתן להקים עם עלות נמוכה, אשר נתמך גם על ידי האפשרות של התחדשות ביעילות את החרוזים מגנטיים.

Watch this Scientific Journal Video about A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example at JoVE.com

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

במאמר זה, פשוט, כמותי, שלב נוזלי זיקה assay לכידת מוצג. זוהי טכניקה אמין מבוסס על אינטראקציה בין חרוזים מגנטיים החלבונים המתויגים (למשל Nanobodies) מצד אחד, את הזיקה בין חלבון מתויג החלבון השני, שכותרתו (poliovirus למשל) מצד שני.

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

a-liquid-phase-affinity-capture-assay-using-magnetic-beads-to-study

Research

JoVE Journal

Biology

11.8K Views.  Vrije Universiteit Brussel. במאמר זה, פשוט, כמותי, שלב נוזלי זיקה assay לכידת מוצג. זוהי טכניקה אמין מבוסס על אינטראקציה בין חרוזים מגנטיים החלבונים המתויגים (למשל Nanobodies) מצד אחד, את הזיקה בין חלבון מתויג החלבון השני, שכותרתו (poliovirus למשל) מצד שני.

Video: A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

המרת ELISA ללכוד Assay Luminex Xmap באמצעות נוגדן Multiplex שיטת הקרנה

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron regulatory proteins, IRP1 and IRP2. They bind to iron responsive elements (IREs) within the untranslated regions (UTRs) of several target mRNAs, thereby controlling the mRNAs translation or stability. IRE/IRP interactions have been widely studied by EMSA. Here, we describe the EMSA protocol for analyzing the IRE-binding activity of IRP1 and IRP2, which can be generalized to assess the activity of other RNA-binding proteins as well. A crude protein lysate containing an RNA-binding protein, or a purified preparation of this protein, is incubated with an excess of32 P-labeled RNA probe, allowing for complex formation. Heparin is added to preclude non-specific protein to probe binding. Subsequently, the mixture is analyzed by non-denaturing electrophoresis on a polyacrylamide gel. The free probe migrates fast, while the RNA/protein complex exhibits retarded mobility; hence, the procedure is also called &#8220;gel retardation&#8221; or &#8220;bandshift&#8221; assay. After completion of the electrophoresis, the gel is dried and RNA/protein complexes, as well as free probe, are detected by autoradiography. The overall goal of the protocol is to detect and quantify IRE/IRP and other RNA/protein interactions. Moreover, EMSA can also be used to determine specificity, binding affinity, and stoichiometry of the RNA/protein interaction under investigation.

Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Here we present a protocol to analyze RNA/protein interactions. The electrophoretic mobility shift assay (EMSA) is based on the differential migration of RNA/protein complexes and free RNA during native gel electrophoresis. By using a radiolabeled RNA probe, RNA/protein complexes can be visualized by autoradiography.

Shift electrophoretic הניידות Assay (Emsa) לחקר RNA אינטראקציות חלבון: IRE / IRP דוגמא

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.