עבודה זו נתמכה על ידי מכון הקנדי לחקר בריאות (CIHR) מעניק 191,597, 299,432 324,265 ו, מדעי טבע והנדסת מועצת מחקר של מענק Discovery קנדה ומענק Frontier אדם תכנית המדע לCRL. CRL הוא חוקר CIHR חדש. גיום Diss נתמך על ידי מענק PROTEO. סמואל Rochette נתמך על ידי מלגות NSERC וFRQNT.

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+as+a+collection+of+protein+machines:+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists.">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92, 291-294 (1998).</li><li>Diss, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+avenues+for+exploring+the+dynamics+and+evolution+of+protein+interaction+networks.">Integrative avenues for exploring the dynamics and evolution of protein interaction networks.</a> Curr Opin Biotechnol. 24, 775-783 (2013).</li><li>Vidal, M., Cusick, M. E., Barabasi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactome+networks+and+human+disease.">Interactome networks and human disease.</a> Cell. 144, 986-998 (2011).</li><li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins.">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS biology. 7, e96 (2009).</li><li>Arifuzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+identification+of+protein-protein+interaction+of+Escherichia+coli+K-12.">Large-scale identification of protein-protein interaction of Escherichia coli K-12.</a> Genome Res. 16, 686-691 (2006).</li><li>Rajagopala, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+binary+protein-protein+interaction+landscape+of+Escherichia+coli.">The binary protein-protein interaction landscape of Escherichia coli.</a> Nature biotechnology. 32, 285-290 (2014).</li><li>Arabidopsis-Interactome-Mapping-Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map.">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li><li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+landscape+of+membrane-protein+complexes+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Interaction landscape of membrane-protein complexes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 489, 585-589 (2012).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li><li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes.">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415, 141-147 (2002).</li><li>Tarassov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+map+of+the+yeast+protein+interactome.">An in vivo map of the yeast protein interactome.</a> Science. 320, 1465-1470 (2008).</li><li>Uetz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+analysis+of+protein-protein+interactions+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 403, 623-627 (2000).</li><li>Guruharsha, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+complex+network+of+Drosophila+melanogaster.">A protein complex network of Drosophila melanogaster.</a> Cell. 147, 690-703 (2011).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+map+of+the+interactome+network+of+the+metazoan+C.+elegans.">A map of the interactome network of the metazoan C. elegans.</a> Science. 303, 540-543 (2004).</li><li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network.">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437, 1173-1178 (2005).</li><li>Landry, C. R., Levy, E. D., Abd Rabbo, D., Tarassov, K., Michnick, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+insight+from+noisy+cellular+networks.">Extracting insight from noisy cellular networks.</a> Cell. 155, 983-989 (2013).</li><li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).</li><li>Wodak, S. J., Vlasblom, J., Turinsky, A. L., Pu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+networks:+the+puzzling+riches.">Protein-protein interaction networks: the puzzling riches.</a> Current opinion in structural biology. 23, 941-953 (2013).</li><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340, 245-246 (1989).</li><li>Dunham, W. H., Mullin, M., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-purification+coupled+to+mass+spectrometry:+basic+principles+and+strategies.">Affinity-purification coupled to mass spectrometry: basic principles and strategies.</a> Proteomics. 12, 1576-1590 (2012).</li><li>Michnick, S. W., Ear, P. H., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolkit+of+protein-fragment+complementation+assays+for+studying+and+dissecting+large-scale+and+dynamic+protein-protein+interactions+in+living+cells.">A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells.</a> Methods Enzymol. 470, 335-368 (2010).</li><li>Rochette, S., Gagnon-Arsenault, I., Diss, G., Landry, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+yeast+protein+interactome+in+response+to+DNA+damage.">Modulation of the yeast protein interactome in response to DNA damage.</a> Journal of proteomics. 100, 25-36 (2014).</li><li>Diss, G., Dube, A. K., Boutin, J., Gagnon-Arsenault, I., Landry, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+approach+for+the+genetic+dissection+of+protein+complexes+in+living+cells.">A systematic approach for the genetic dissection of protein complexes in living cells.</a> Cell Rep. 3, 2155-2167 (2013).</li><li>Gagnon-Arsenault, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+divergence+plays+a+role+in+the+rewiring+of+protein+interaction+networks+after+gene+duplication.">Transcriptional divergence plays a role in the rewiring of protein interaction networks after gene duplication.</a> Journal of proteomics. 81, 112-125 (2013).</li><li>Schlecht, U., Miranda, M., Suresh, S., Davis, R. W., St Onge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+assay+for+condition-dependent+changes+in+protein-protein+interactions.">Multiplex assay for condition-dependent changes in protein-protein interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9213-9218 (2012).</li><li>Lev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+PCA,+a+systematic+approach+for+identifying+genes+important+for+the+physical+interaction+between+protein+pairs.">Reverse PCA, a systematic approach for identifying genes important for the physical interaction between protein pairs.</a> PLoS Genet. 9, e1003838 (2013).</li><li>Freschi, L., Torres-Quiroz, F., Dube, A. K., Landry, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qPCA:+a+scalable+assay+to+measure+the+perturbation+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">qPCA: a scalable assay to measure the perturbation of protein-protein interactions in living cells.</a> Mol Biosyst. 9, 36-43 (2013).</li><li>Pelletier, J. N., Campbell-Valois, F. X., Michnick, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+domain-directed+reassembly+of+active+dihydrofolate+reductase+from+rationally+designed+fragments.">Oligomerization domain-directed reassembly of active dihydrofolate reductase from rationally designed fragments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 12141-12146 (1998).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li><li>Schuldiner, M., Collins, S. R., Weissman, J. S., Krogan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+epistatic+miniarray+profiles+(E-MAPs)+and+its+application+to+chromatin+functions.">Quantitative genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae using epistatic miniarray profiles (E-MAPs) and its application to chromatin functions.</a> Methods. 40, 344-352 (2006).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Wagih, O., Parts, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gitter:+A+Robust+and+Accurate+Method+for+Quantification+of+Colony+Sizes+From+Plate+Images.">gitter: A Robust and Accurate Method for Quantification of Colony Sizes From Plate Images.</a> G3 (Bethesda). 4 (3), 547-552 (2014).</li><li>Leducq, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+robustness+of+protein+complexes+to+inter-species+hybridization.">Evidence for the robustness of protein complexes to inter-species hybridization.</a> PLoS Genet. 8, e1003161 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development Core Team: A language and environment for statistical computing. , (2008).</li><li>Stark, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioGRID:+a+general+repository+for+interaction+datasets.">BioGRID: a general repository for interaction datasets.</a> Nucleic Acids Res. 34, D535-D539 (2006).</li><li>Vinayagam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+complex-based+analysis+framework+for+high-throughput+data+sets.">Protein complex-based analysis framework for high-throughput data sets.</a> Science signaling. 6, rs5 (2013).</li><li>Jansen, R., Gerstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+function+on+a+genomic+scale:+the+importance+of+gold-standard+positives+and+negatives+for+network+prediction.">Analyzing protein function on a genomic scale: the importance of gold-standard positives and negatives for network prediction.</a> Current opinion in microbiology. 7, 535-545 (2004).</li><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+two-hybrid+analysis+to+explore+the+yeast+protein+interactome.">A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4569-4574 (2001).</li><li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li></ol>

חלק מדמי פרסום גישה הפתוחים לכתבה זו שולם על ידי רובוטיקה S &amp; P.

אנו מתארים פרוטוקול המבוסס על assay DHFR-PCA מאפשר זיהוי השיטתי של interactors הפיזי לכל חלבון פיתיון ניתנו בתפוקה גבוהה. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם על ידי בדיקות סקר ליותר פיתיונות, וזה בכל רמה רצויה של שכפול. אנחנו מדגימים את האמינות של פרוטוקול זה על ידי זיהוי של שותפי אינטראקציה פיזיים לחלבון פיתיון המעורב במתחם הגרעיני נקבובי: Nup82. הניתוח שלנו אפשר למצוא חמישה interactors שדווח בעבר ואחד interactor (איורים 3F &amp; 3G) לא פורסם בעבר, המדגיש את היכולת של השיטה ללמוד interactome שמרי החלבון. הפרוטוקול המתואר כאן כולל מספר שלבים קריטיים שהנסיין צריך לשים לב. אנו ממליצים ל1) ודאו שDHFR הפיתיון F [1,2] היתוך נכון (איור 1); זו יכולה להיות מושגת על ידי רצף הבנייה וmeasuring ביטוי חלבון נכון באמצעות אנטי-DHFR F [1,2] או אנטי DHFR-F [3] נוגדן; 2) לפני תחילת המסך, מומלץ לבדוק אם כל פיתיון של עניין מציג אינטראקציות מופקרות במסכי PCA. ניתן לעשות זאת על ידי ביצוע מסכי שליטה עם פיתיונות חצו עם הבקרה הנאותה L-DHFR או על ידי הזדווגות ידנית את הפיתיון עם הבקרה הנאותה L-DHFR וביצוע assay צמיחה במדיום MTX. 3) צלחות צריכה להיות שפכו היום לפני שהם נמצאים בשימוש, כך שהלחות היא אופטימלית לדבקות תא על פני השטח אגר במהלך תהליך ההדפסה; 4) אין להשתמש בצלחות מקור יותר מארבע פעמים להעביר מספיק תאים בצלחת היעד. הגדלת מספר העותקים של צלחת היעד יכול להיעשות על ידי צעדים רצופים של התרחבות (למשל 4 עותקים -&gt; 16 עותקים -&gt; 64 עותקים). לחלופין, ניתן לאסוף תאים בעמדות שונות על המדשאות או במושבה בין סבבים השונים של שכפול; 5) אם מספר positions חסרים לאחר בחירת דיפלואידי (s), לוודא כי צלחות המקור לא היו בשימוש פעמים רבות מדי בשלב החיזור (שלבים 4.5-4.7); 6) ודא שמדיום MTX מכיל את כל המרכיבים החיוניים בריכוזים הנכונים. ואכן, אם אין צמיחה בכלל הוא ציין על מדיום MTX, זה יכול להיות גם משום שאין אינטראקציה ניתן לזהות על ידי PCA לחלבונים של עניין, או משום בינוני MTX לא היה מוכן כראוי. כדי להבטיח שהמדיום מאפשר צמיחה של זנים מראים DHFR ברי שלמה, ניתן להוסיף אינטראקציה מכוננת בעמדות ריקות של האיסוף ושימשה כביקורת חיובית כגון DHFR-ברים התמזגו moieties הרוכסן לאוצין 33 (איור 1 ג). בדיקות מקבילות באמצעות שברי המקשר DHFR או שברי הרוכסן-מקשר DHFR יאפשרו להבחין בין תנאים שיאפשר לכל התאים לגדול (ריכוז MTX נמוך או חלבון פיתיון שנוטים לעשות אינטראקציות חיוביות כוזבות, כdescribed להלן) ותנאים המונעים צמיחה של כל הזנים (מרכיב ריכוז MTX גבוה או חיוני מדי חסר במדיום); 7) בהתחשב בכך שPCA מתבצעת באמצעות סיבובים רצופים של משוכפלים ממדיום אחד למשנהו, זיהום צולב בין זנים בין לוחות שונים עלול להתרחש אם, למשל, פיני הכלי אינו מעוקר כראוי בין סיבובי שכפול ו / או המים שעבר אמבטיה (תחנה כלומר רטובה) בהליך העיקור מזוהם על ידי מושבות של סיבובי שכפול קודמים. מספר התפקידים במערכים ריקים ולכן יכולים לשמש כעמדות שליטה שבו אין צמיחה, יש לשים לב לגילוי זיהומים צולבים. ניתוח תמונה יכול להתבצע באמצעות כמה תוכנות שפורסמו (ראה סעיף 5 לפרוטוקול) או כל תסריט מותאם אישית. במחקר זה, את התסריט המותאם אישית מבצע את השלבים הבאים: 1) התסריט גורע ערכי פיקסל של צלחת ריקה לפיקסל ערכים של כל צלחת כדי לשתףrrect להטיות תאורה. 2) התסריט ממיר כל תמונה מתוקנת רקע בינארית באמצעות סף ערך פיקסל של 10. 3) לכל 1,536 עמדות של כל צלחת, שנקבעו על ידי שכיסה מלבן במושבות הקצה, התסריט פועל ImageJ &quot;לנתח חלקיקים ... &quot;פונקציה בבחירה חוזר. הבחירה החוזר מוגדרת ברדיוס שווה לרווח בין שתי עמדות מינוס 10 פיקסלים. 4) התסריט בוחר את החלקיקים הקרובים ביותר ממרכז הבחירה ומאשר את זה כמושבה אם המיקום שלה הוא לא יותר ממחצית המרווח בין שתי מושבות מהמרכז של הבחירה. 5) התסריט מודד ערכי פיקסל של החלקיקים שנבחרו על התמונה מתוקנת רקע. 6) כדי לתקן עוד כל הטיות תאורת רקע שנותרו, את התסריט מחסיר את הערך הממוצע של כל הפיקסלים מהבחירה בחוזר, כי לא היו חלק מחלקיקים לערכי פיקסל של המושבה. הסכום של ערך פיקסל תיקן אלהים, מאוחסן בטור &quot;IntDenBackSub&quot; לוח משלים 1, משמש כמדד לגודל מושבה. שלב קריטי בחלק הניתוח הוא הבחירה של סף המשמעות. כאן, בחרנו סף המבוסס על חלוקת L-DHFR F השלילי [3] הבקרה, אך בהתאם למטרה של המסך, סף כזה עשוי להיות מחמיר מדי. ואכן, L-DHFR F [3] פקדי ביטוי יתר (אמרגן TEF חזק) באופן שהברים המשלימים עשויים באופן ספונטני משלימים אחד את השני ואלה ובכך אינם מייצגים את הביטוי של רוב החלבונים. זה מודגש על ידי העובדה שההפצה של L-DHFR F [3] הבקרות היא גבוהה מהממוצע של צמיחת הרקע (איור 3D). לכן, כמה אינטראקציות שיש ציונים מתחת לסף מחמיר זה אבל זה בבירור מחוץ להפצת צמיחת רקע יכול להיחשב כלהיטים משוערים שעשויות לייצג, למשל היתר, חולף או חלשפעולות. ניתן ללמוד אלה נוספים ומאומתים צולבים אם, למשל, שני החלבונים אינם באים לידי ביטוי ברמות שיכולות להרשות לשלמה הספונטנית של שברי DHFR כמו פקדי L-DHFR. כחלופה, אפשר להגדיר סף משמעות בהתאם לחלק היחסי של חפיפה עם interactors הפיזי דווח במסדי נתונים כמו 35 BioGRID על מנת למקסם את חלקם של תוצאות חיוביות האמיתיות על תוצאות חיוביות שגויות. עם זאת, בניגוד לשימוש בהפצת L-DHFR, חלופה זו עשויה שלא להיות תמיד אפשרית אם, למשל, מספר interactors הפיזי הידוע הוא לא גבוה מספיק. יתר על כן, הבחירה של סף המשמעות יש השפעה על השיעור של תוצאות חיוביות שגויות וגם שליליים שווא בערכת הנתונים הסופי. ואכן, כמו כל assay זיהוי PPI אחר, חיוביים שגוי יכול להיגרם כתוצאה מאינטראקציה נוקבת של חלבון עם חלבון DHFR-ההיתוך אם, למשל, החלבון הוא נרחב ביותר כאמור. זהמודגם על ידי העובדה שחלק פושט שיטתי אינטראקציה עם כל חלבוני הפיתיון במסכי PCA, ולכן, יש צורך להסיר מהניתוח 11 (לדוגמא Tef2 וAde17 ולוח משלים 2). כדי לעקוף בעיה זו, מסך PCA שליטה של ​​שני אוספים נגד הבקרה הנאותה L-DHFR (F [1,2] או F [3]) כדי לזהות פיתיונות ופושט מציגים ספונטני DHFR ברי שלמה יכולה להתבצע בתנאים מסוימים של כל מסך. יתר על כן, ביצוע ניתוח העשרת Gene אונטולוגיה יכול להגדיל את האמון בנתונים אם הפונקציה של פיתיון נתון ידועה. מצד השני, DHFR-PCA יכולה להצמיח שליליים שגוי מכמה סיבות: 1) לא ניתן התמזגו כל החלבונים לברי DHFR כמו אלה עלולים לערער את היציבות בחלבונים או לשנות את הלוקליזציה שלהם, אם, למשל, היתוך DHFR ל C-הסופי מפריע לאות לוקליזציה; 2) הכינון מחדש DHFR בכמה תאים סלולריים מ &#39;איי לא לייצר חומצה פולית אם, למשל, מבשר חיוני לסינתזה של חומצה פולית אינו זמין; 3) C-Termini צורך להיות במרחק של 8 ננומטר לשלמת DHFR להתרחש 11. לפיכך, אינטראקציה ידועה לא תזוהה אם C-Termini שלהם לא קרוב מספיק בחלל. זה בא לידי ביטוי כאן בעובדה שחלק גדול מאינטראקציות פיזיות Nup82 דווחו במאגרי מידע, אשר רובם עקיפים, לא התגלה assay שלנו. בדומה לכך, אינטראקציות בין חלבוני קרום שC-טרמיני נמצאים בטרנס ביחס לקרום לא יובילו לDHFR ברי שלמה ולא יזוהה 11. מגבלות 1) ו -3) ניתן לעקוף יחסית פשוט על ידי איחוי שבר DHFR לN-Termini של החלבון. פעולה זו עלולה למנוע להפריע לאות לוקליזציה ליד C-Termini ועשוי לאפשר לגילוי אינטראקציה בין החלבונים בממברנה שN ו- C-הסופי נמצא ביחסי cisהקרום. כמה אתגרים להישאר במחקר של מספרי זיהוי אישיים (שנסקר ב2,3). המפות של סיכות הופקו עד כה במידה רבה תוארו בתנאי ניסוי יחידים עבור כל מין ובכך להציע תמונת מצב אחת לאופן שעשויות להיות מאורגנים רשתות חלבון. אין אפוא צורך בבדיקה של תנאי ניסוי אחרים כדי לראות איך מספרי זיהוי אישיים עשויים להיות מחדש בתגובה לשינויים סביבתיים, גירויים מסוימים, על פני פיתוח או המוטציות הבאות. אתגרים אלה יהיו להתגבר על ידי פיתוח הטכנולוגיות חדשות לחקירת PPIs בזמן אמת, בתאים חיים ועל ידי התאמת טכניקות הנוכחיות, כך שהם יכולים להיות בשימוש על ידי קהילה גדולה יותר של מעבדות. כטכניקה כמותית שיכול לזהות שינויים בכמות של שלמת DHFR קומפלקסי 27, ניתן להתאים DHFR-PCA להתגבר על אתגרים אלה ונעשה שימוש כדי ללמוד איך PPIs מושפע DNA נזק סוכן 22 </sup&gt;, חומרים כימיים 25, מחיקות גן 23,26 או במינים שמרים אחרים והכלאיים שלהם 33. היכרות עם הממדים החדשים אלה תהפוך ליותר ויותר חשובים לחשוף את הדינמיקה של PIN.

רשתות אינטראקציה חלבון (PIN) מציעות מפה ברזולוציה נמוכה של כמה חלבונים מאורגנים מבחינה תפקודית בתא 1. כל חיבור פיזי בין שני חלבונים, או אינטראקציה בין חלבונים (PPI), עשוי לייצג עמותה כי הוא יציב בזמן, כמו אלה שנמצאו בתוך קומפלקסי חלבונים ושתורם לארגון המבני של התא. קשרים אלה עשויים גם לייצג עמותות חולפות המסדירות את הפעילות, יציבות, הלוקליזציה ואינטראקציות של שני השותפים. זיהוי שותפי אינטראקציה הפיזי של חלבון נתון לכן מספק מידע עשיר על התפקוד והרגולציה של החלבון ש2,3. מסיבות אלה, כבר לשים מאמצים גדולים למיפוי של סיכות באורגניזמים מודל, כולל Escherichia coli 4-6, thaliana ארבידופסיס 7, Saccharomyces cerevisiae 8-12, דרוזופילה melanogaster &lt;/ Em&gt; 13, Caenorhabditis elegans 14 וההומו ספיינס 15. מחקרים אלה סיפקו תובנות חשובות כיצד חלבונים מאורגנים בתא ומידע ובכך מפתח בחלבונים עם פונקציות ידועות קודם לכן. כמה אסטרטגיות שפותחו במשך השנים ללמוד מספרי זיהוי אישיים. טכנולוגיות אלה יכולות להיות מקובצים באופן כללי בשלוש קטגוריות המבוססות על הסוג של מידע שהם מספקים ב- PPI (שנסקר ב16-18). הראשון מבוסס על שמרי שתי-היברידי ונגזרותיו 19. טכנולוגיות אלו מספקות מידע על העמותה הישירה בין הזוגות של חלבונים, המאפשר בניית רשתות בינארי. המשפחה השנייה מבוססת על טיהור הזיקה של חלבוני פיתיון וזיהוי של השותפים הקשורים בם, כגון טיהור זיקה ואחריו ספקטרומטריית מסת 20. גישות אלה לזהות קבוצות של חלבונים אשר מתייחסות ישירותאו קשור באופן עקיף, בדרך כלל באופן יציב, והם חזקים מאוד לזהות קומפלקסי חלבונים. הגישה השלישית מתבססת על מבחני חלבון-בר שלמה (PCAs) 11,21. גישה זו מספקת רמה בינונית של החלטה בין שתי הגישות הקודמות, שכן היא מאפשרת איתור עמותות ישירות והפרוקסימלי בין חלבונים. לכל אחד יש טכניקה עוצמות משלה וחולשות, כפי שנסקר 18 לאחרונה. PIN אוקריוטים ביותר שתואר הוא ללא ספק אחד משמרי ניצני Saccharomyces cerevisiae, בין שאר משום שproteome היא יחסית פחות מורכבת מאלה של אאוקריוטים מודל אחרים וכי מבחני תפוקה גבוהה כדי לזהות PPIs ראשון כבר assayed ויעילות רב יותר מיושם באורגניזם מודל זה 9-12. שיטה חזקה במיוחד למערכת השמרים היא assay דיהידרופולאט רדוקטאז שלמת חלבון-בר (DHFR-PCA), assay כי כברמשמש בהקשרים שונים כדי ללמוד את PIN השמרים בתנאים סטנדרטיים ומוטרדים 11,22-26. שיטה זו מסתמכת על assay הישרדות המאפשר זיהוי של PPI ישיר וכמעט ישיר לחלבון פיתיון ניתנו בשתי רמות ביטוי אנדוגני והמגוירים subcellular יליד שותפי האינטראקציה 11,21 באופן כמותי 27. האות שהושגה באמצעות assay זה (גודל מושבה כלומר על מערכי מושבה בצפיפות גבוהה) ובכך משקפת את הסכום של קומפלקסי חלבונים שנוצרו בין הפיתיון והטרף בסביבה סלולרית כמעט שווה ערך לאחד מתאי wild-type. Assay מבוסס על הכינון מחדש של אנזים כתב המעורב במטבוליזם של חומצה פולית, דיהידרופולאט רדוקטאז (DHFR), לפיה שני שברים משלימים של DHFR שהתמזגו שני חלבונים של עניין הם הביאו לקרבה כאשר שני חלבוני האינטראקציה, ש בתורו מוביל לכינון מחדש הפיך של פעילות אנזים 1גידול של 1 ושל העומס על methotrexate בינוני מכיל (MTX; איור 1). מתחם זה מעכב את אנזים אנדוגני DHFR, אבל לא אחד שעבר מוטציה בשימוש assay 28. שני אוספים של זני PCA, אחד המכיל ~ 4,300 מאטה זנים עם ORF התמזג DHFR F [1,2] ובר אחד המכיל ~ 4,800 MAT α זנים עם ORF התמזג DHFR [3] שבר, ניתן לרכוש ל ליישם DHFR-PCA בקנה מידה קטנה או גדול בכל מעבדה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כללי אבל מפורט למסך ל- PPI בין חלבון פיתיון אחד ו~ 4,800 חלבוני טרף באמצעות assay זה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipement</td>
			<td>&#160;Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>&#160;Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMatrix Robot, Bench-top Configuration</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>BM5-BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-format Pin-tool</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>PH-96-10</td>
			<td>Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-format Pin-tool</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>PH-384-10</td>
			<td>Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1536-format Pin-tool</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>PH-1536-05</td>
			<td>Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated imaging module&#160;</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>IMG-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methotrexate&#160;</td>
			<td>Bioshop Canada Inc.</td>
			<td>MTX440&#160;</td>
			<td>CAUTION: toxic compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B&#160;</td>
			<td>Bioshop Canada Inc.</td>
			<td>HYG003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin dihydrogen sulfate</td>
			<td>Werner BioAgents</td>
			<td>5010000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast-Interactome Collection&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>YSC5849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Tray w/lid sterile&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DHFR F[1,2] antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DHFR F[3] antibody&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0942</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide protein-protein interaction screening by protein-fragment complementation assay (pca) in living cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

לוח משלים 2 הוא דוגמא לתוצאות שהושגה באמצעות נציג שמרי החלבון Nup82 התמזג DHFR F [1,2] הבר כפיתיון. הסף שנקבע עם L-DHFR F [3] בקרות יכולים לשמש כסף אמפירי כדי לקבוע להיטי ביטחון גבוהים (איורים 3D &amp; 3E). לחלופין, דירוג הציון ניתן להשתמש כדי לבצע מוספים לג&#39;ין אונטולוגיה או אחרים תפקודי מנתח 36 המבוסס על סטנדרטים זהב 37. Interactors הפיזי הידוע של הפיתיון יכול להאסף ממאגרי מידע כמו 35 BioGRID ומעולף על נתונים (הנתונים 3E &amp; 3F). בדוגמא זו, חמש מתוך שמונה להיטי ביטחון גבוה כבר דווחו בעבר כinteractors Nup82 ושני הם חלק מsubcomplex Nup82, Nup116 וNup159 (איור 3F &amp; 3G). חבר האחר של המתחם, Nsp1, לא מראה שום Interaction בניסוי שלנו. שני פושט, Ade17 וTef2 (לא מוצג באיור 3F), קבל ציונים מעל הסף הקשה ליישם, אבל אלה עשויים להיות חיוביים שגויים כפי שהם אינטראקציה עם כמעט כל חלבון פיתיון במסכי PCA שבוצענו (תוצאות לא פורסמו). מצד השני, Pex30 עשוי לייצג interactor פיזי רומן של Nup82 והיינו יכול לאשר אינטראקציה זו באמצעות DHFR-PCA בתפוקה נמוכה (איור 3G). Pex30 הוא חלבון קרום peroxisomal וכמה אינטראקציות ישירות דווחו בין מורכב הנקבובית הגרעיני (NPC) ואברון זה. מסך דו-היברידי זיהה שני חלבוני NPC אחרים, Nup53 וAsm4 (Nup59), כinteractors הפיזי של Pex30 38, ואינטראקציה גנטית בין Pex30 וNup170 דווחה 39. שני שותפים אחרים אינטראקציה זוהה, Nup120 וNup85 (איור 3F &amp; 3G), אינם חלקים מהמשנה המורכבת Nup82, הממחישים את היכולתשל DHFR-PCA כדי לזהות אינטראקציות בתוך ובין subcomplexes במתחמים גדולים יותר 11. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig1highres.jpg" /> איור 1:. זני שמרי הנדסה לתפוקה גבוהה DHFR-PCA (. הדמות המותאמת מLeducq et al 2,012 33) בנייה (א) לזני מאטה וα MAT הפלואידים למזג Gene1 (G1) וGene2 (G2) עם DHFR F [1,2] -NatMX וDHFR F [3] -HPH קלטות, בהתאמה. קלטות הן מוגברות מפלסמידים pAG25-DHFR F [1,2] וpAG32-DHFR F [3] עם G1-5 פריימרים קדימה &#39;וG2-5&#39;, ולהפוך פריימרים G1-3 &#39;וG2-3&#39;, ולאחר מכן הוכנס בגנום בסוף &#39;3 של גן המטרה על ידי רקומבינציה ההומולוגית. החלבונים וכתוצאה מכך, P1 ו- P2, הם בהתאמה התמזגו DHFR F [1,2] בר (מאטה) וDHFR F [3] שבר (MATα) באמצעות מקשר גמיש. (ב) אימות של הבנייה ב() מתבצע על ידי רצף צמתים בין Gene1 של וORFs של Gene2 ו קלטות DHFR. זני PCA בנויים מנוגדים סוגי הזדווגות מכן הזדווגו כדי ליצור דיפלואידי. זני דיפלואידי לגדול במדיום MTX אם שני שברי DHFR משלימים הם הביאו לקרבה על ידי אינטראקציה בין P1 ו- P2, שreconstitutes הפעילות של אנזים DHFR. בנייה (C) של שליטת PCA דיפלואידי זנים למסכי DHFR-PCA. הבקרות השליליות (L-DHFR) בנויות על ידי הפיכת זני מאטה וMATα בנפרד הפלואידים עם פלסמידים P41-מקשר DHFR F [1,2] וP41-מקשר DHFR F [3] 11, בהתאמה. שני זנים הם הזדווגו וכתוצאה מכך מתח דיפלואידי ביקורת שלילית שבו שברי DHFR אינם מסוגליםלמשלים אחד את השני (למעלה). בקרות חיוביות נבנות תוך שימוש באותה הגישה כמו לבקרה השלילית, אבל פלסמידים הפכו בזנים הפלואידים (P41-רוכסן-מקשר DHFR F [1,2] (P41-ZL-DHFR F [1,2]) וP41 -zipper-מקשר DHFR F [3] (P41-ZL-DHFR F [3])) מכיל שברי שני GCN4 אוצין המקביל רוכסן התמזגו ברי DHFR המשלימים, מה שמוביל לאינטראקציה חזקה ומכוננת שreconstitutes פעילות DHFR (תחתון ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52255/52255fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig2highres.jpg" /> איור 2: הליך DHFR-PCA תפוקה גבוהה (דמות שהותאמה מet al Leducq 33.) () MAT α DHFR F [3] האוסף.<html> הוא מרוכז בפורמט 1,536 באמצעות שני סיבובים רצופים של עיבוי. ראשית, צלחות מניית גליצרול משולבות בקבוצות של ארבעה על מדיום YPD + HygB סלקטיבית בפורמט 384 באמצעות 96 פיני הכלי. שנית, 384 מערכים משולבים על ידי קבוצות של ארבעה על מדיום YPD + HygB סלקטיבית בפורמט 1,536 באמצעות 384 פיני הכלי. מדשאות תא (B) של זן פיתיון מאטה PCA ערוכות על ידי גידול תרבות רוויה של זן הפיתיון ב YPD סלקטיבית + בינוני נט וציפוי התרבות בנט YPD + omnitray. (C) מדשאות אלה משמשים להזדווג מתח הפיתיון עם DHFR F [3] האוסף על מדיום YPD. תאים ברציפות מועברים פעמיים על מדיום YPD + HygB + נט כדי לבחור עבור diploids ופעמים במדיום MTX לבצע PCA. צמיחה יקויימו רק על מדיום MTX אם שברי DHFR משלימים אחד את השני הבא אינטראקציה בין הפיתיון וחלבוני הטרף.&quot;Target =&quot; e.jpg _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig3highres.jpg" /> איור 3:.. נורמליזציה נתונים הניתוח באמצעות צעדי נורמליזציה, קביעת סף משמעות וזיהוי של אינטראקציות חיוביות () הפצת צפיפות של גודל מושבה על כל צלחת (יומן 2) (ב) על ידי החציון של כל תמונה מתקנת להטיות קשור בתופעות צלחת לצלחת. Heatmap (C) המציגה את מקדם מתאם ספירמן בין הצלחות, המאשר את שחזור של ההליך. הפצה (D) של ציונים לPPIs נבדק וL-DHFR F [3] בקרות. סף קשיח יכול להיות מוגדר 95 אחוזון ה של L-DHFR F [3] הפצה לזהות PPIs ברמה ודאות גבוהה (המיוצג על ידי מקווקו אנכיהפצה) כדי דרגה. (E) שורה של הציון הממוצע של כל טרף. שותפים שדווחו בעבר פיזי אינטראקציה של Nup82p בBioGRID 35 מזוהים על ידי חוגים ואלו שדווחו במחקר זה מזוהים על ידי נקודות אדומות. הסף שנקבע ב( D) מוצג כקו מקווקו. (F) רשת מציגה את PPIs ברמה ודאות הגבוהה שזוהה במחקר זה. interactors קצוות כחולים מראים שדווחו בעבר הפיזי (35 BioGRID) וקצוות צהובים להראות אינטראקציה שלא דווחה בעבר עם Pex30. assay ספוט-הדילול של זני דיפלואידי PCA מעורבים Nup82-DHFR F [1,2] והטרף-DHFR F [3 (G) ] זוגות זוהו כinteractors הפיזי של Nup82p במחקר הנוכחי. assay הצמיחה בוצע במדיום DMSO (ממס MTX, פנל משמאל) ובינוני MTX (פנל מימין). בקרות שליליות בהיקף של Nup82-DHFR F [1,2] - לינקר-DHFR F [3] ולינקר-DHFR F [1,2] - לינקר-DHFR F [3] ושליטה חיובית בהיקף של tהוא אינטראקציה חזקה בין שתי moieties הרוכסן לאוצין (רוכסן-DHFR F [1,2] - הרוכסן-DHFR F [3]) היו כלולים. תא צמיחה מעולה לבקרה השלילית במדיום MTX יש לפרש כאינטראקציה פיזית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52255/52255fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חומצת אמינו </td><td> כמות (ז) </td></tr><tr><td> סולפט אדנין * </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-Tryptophane </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> L-טירוזין </td><td> 0.3 </td></tr><tr><td> ל-פנילאלנין </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> חומצה גלוטמית L-(מלח מונוסודיום) </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> L-asparagine </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> L-Valine </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> L-תראונין </td><td> 2.0 </tד&gt; </tr><tr><td> L-Serine </td><td> 3.75 </td></tr><tr><td> Uracile </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-היסטידין HCl </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L- ארגינין HCl </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-מתיונין * </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L ליזין * </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-לאוצין </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td colspan="2"> * הסתגרות בעת ביצוע PCA סטנדרטית (כמו בפרוטוקול זה) אך ניתן להוסיף למטרות אחרות. </td></tr></tbody></table> טבלת 1:. כמויות הרכב 10X -lys / הנשירה / ADE נפגשה במדיום MTX הן לליטר אחד של 10x נשירה. כוכביות לציין את התרכובות שיש משיכה למדיום MTX הסטנדרטי, אבל שניתן להוסיף למטרות אחרות. לוח משלים 1:. נתונים משולבים מצלחות מבחן 12 טבלה 1 מכילה את דה בשרשורta מניתוח ImageJ בוצע באמצעות תסריט ImageJ מותאם אישית עם כל שורה המתאימה לעמדה אחת על כל מערך 1,536. בנוסף, כל שורה כבר מבוארת עם המידע על קובץ התמונה, צלחת אוסף DHFR, לשכפל, ORF ושם חלבון. לוח משלים 2:. צמיחה מנורמלת ממוצעת למתח טבלה 2 מכילה את הצמיחה מנורמלת יומן 2 הממוצעת עבור כל זן של האוסף יחד עם סטיית התקן. פושט מסונן, להיטים וinteractors הפיזי הידוע מזוהים בעמודות נפרדות.

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells at JoVE.com

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

genome-wide-protein-protein-interaction-screening-protein-fragment

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

13.2K Views.  Université Laval. Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA). 

Video: Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

כמותיים אוטומטי תפוקה גבוהה הגנום כולו RNAi המסכים ג elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

מחיקות Gene הגנום ב<em&gt; סטרפטוקוקוס sanguinis</em&gt; על ידי תפוקה הגבוהה PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

מיפוי הגנום של תרופות-DNA בתאי אינטראקציות עם COSMIC (Crosslinking של מולקולות קטנות לבודד הכרומטין)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-seq: מיפוי הגנום של אינטראקציות החלבון-DNA על ידי תפוקה גבוהה רצף של קטעי DNA-מפוגל אדנין

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...