פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פרופיל פוליזום החושף פרטים מולקולריים על פעילות הריבוזומים בתוך התא. טכניקה זו מאפשרת למשתמשים להשיג את המידע החשוב המסופק על ידי פרופיל פוליזום, שאין להם גישה למערכות פיצול הדרגתיות אוטומטיות. קח את הזמן שלך בעת הכנת מעברי הצבע, ואחסן את מעברי הצבע במיקום שבו הם לא יופרעו על ידי מדחס או פעולות מכניות אחרות כשהם שוקעים לשיפוע ליניארי.
כדי להתחיל, הכינו פתרונות מלאי של 7 ו-47% סוכרוז במאגר הדרגתי של סוכרוז. המסנן מעקר את תמיסות מלאי הסוכרוז באמצעות מסנן של 0.22 מיקרון. הכן 14 מיליליטר של 17, 27 ו 37% סוכרוז פתרונות על ידי חלוקה וערבוב של פתרונות מלאי 7 ו -47%.
הנח שש שפופרות צנטריפוגות פוליפרופילן לתוך מתלה מבחנה לצפייה מלאה. ודא שיש מספיק רווח בין הצינורות, כך שהפעולות עם צינור אחד לא יפריעו לאחרים. חברו מחט בגודל 9 אינץ', 22 מד עם קצה קהה למזרק של שלושה מיליליטר, ובצעו מילוי ופיזור בדיקה כדי להבטיח שהמזרק יכול להחזיק את תמיסת הסוכרוז ללא כל טפטוף לפני הגדרת השיפועים.
הוסף שני מיליליטר של 7% סוכרוז לתחתית כל צינור צנטריפוגה. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של 17% סוכרוז מתחת לתמיסת 7%, על ידי מיקום קצה המחט בסביבה הקרובה של תחתית הצינור. בזהירות ובאיטיות לוותר על הפתרון.
חזור על ההליך עם שני מיליליטר כל אחד מתמיסת 27, 37 ו 47% סוכרוז, להבטיח כי כל שכבה ניתנת להבחנה מהשנייה על ידי קו המסמן את הפרדת הצפיפויות. אחסנו את השיפועים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר להם להתמקם לאחוז רציף והולך של סוכרוז. לאחר הצמיחה והקציר של שמרים, Saccharomyces cerevisiae תאים, לתלות את התאים ב 700 microliters מקורר של חיץ מיצוי פוליזום.
הוסף 100 יחידות של מעכב RNAse. לאחר מכן, הוסיפו 400 מיקרוליטרים של חרוזי זכוכית מקוררים מראש בגודל משוער של 425 עד 600 מיקרון. מעבירים את התערובת לצינור צנטריפוגה בקוטר 1.5 מיליליטר עם חרוזי הזכוכית, ומשבשים את תאי השמרים על ידי תסיסה נמרצת במקציף חרוזים למשך חמש דקות.
לאחר שיבוש התאים, להבהיר את lysate על ידי צנטריפוגה. קבע את ריכוז הרנ"א בליזאט המובהר על ידי מדידת הספיגה ב-260 ננומטר, באמצעות מערכת זיהוי RNA מבוססת פלואורסצנציה. ודא כי ריכוז RNA הוא 0.5 עד מיקרוגרם אחד לכל מיקרוליטר.
אם ריכוז הרנ"א נמוך מדי, הפחיתו את נפח חיץ המיצוי המשמש להחייאת התאים. טען בזהירות את הליזאט על החלק העליון של מעברי הצבע. מניחים את קצה הפיפטה על הקיר הפנימי בחלק העליון של צינור הפוליפרופילן.
זווית את הצינור ולאט לאט לטפטף את הליזאט על החלק העליון של שיפוע, מטפטף על הקיר. מניחים בעדינות את הצינורות לתוך הדליים המצוננים מראש של רוטור דלי מתנדנד, וצנטריפוגות את השיפועים. לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את צינורות הצנטריפוגה מרוטור הדלי המתנדנד, והנח אותם במחזיק צינורות.
תייג את לוחות 96 הבארות כדי לאחסן את השברים ולצנן מראש על קרח. אסוף 100 או 200 שברים מיקרוליטר החל מראש השיפוע, על ידי החדרה זהירה של קצה פיפטה לחלק העליון של השיפוע, ואיסוף השברים עד שכל השיפוע הוא aliquoted. מדוד את הספיגה של כל שבר ב-254 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר כנגד תמיסות 7 ו-47% סוכרוז כריקים.
צור את פרופיל הפוליזום על-ידי התוויית מספר השבר לעומת הספיגה. שלושה פרופילים פוליזום מייצגים של שמרים S.Cerevisiae, מוצגים. הפסגה של כל תת-יחידה ריבוזומלית ופסגת פוליזום ניכרת בכל פרופיל.
פרופיל מייצג ממערכת חלוקת צפיפות אוטומטית מוצג כאן. פרופיל זה הופק מפרופיל ספיגה רציף כאשר שיפוע הסוכרוז נעקר מלמטה למעלה על ידי תמיסת מרדף, דרך תא זרימת גלאי ונאסף בשברים. פרופיל הפוליזום שנוצר על ידי חלוקה ידנית של 200 ו-100 דגימות מיקרוליטר מוצג כאן.
הדבר החשוב ביותר שיש לזכור עם הליך זה הוא לא לשבש את שיפוע. היזהרו לא להכניס בועות אוויר או לשבש את השיפוע על ידי חלוקת פתרון מהר מדי. לאחר הליך זה, ניתן לחלץ RNA מהשיפועים לניתוח נוסף כדי לקבוע mRNA המשויכים לריבוזומים פעילים
