הרשות הפלסטינית היא נמען של מלגה &quot;פייר דוראן&quot; בפקולטה לרפואה של האוניברסיטה לאוול. עבודה זו נתמכה על ידי למדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה (MOP-CG095386) ל RM fractionator polysome נרכש באמצעות קרן קנדית עבור חדשנות מענק (MOP-GF091050) לRMR M מחזיק הפרס משכורת חוקר חדש CIHR. אנו אסירי תודה לבני זוג. א Khandjian, י Gallouzi, ס &#39;Di-מרקו וא&#39; Cammas לעצות מועילות.

הפרוטוקול כדלקמן ההנחיות שאושר על ידי המועצה לביקורת האתית של לאוואל. 1. הכנת תרביות תאים ומניפולציה המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי יונקים ודרוזופילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול הלה תאי סרטן צוואר הרחם ותאים עובריים שניידר דרוזופילה כמומלץ על ידי התרבות האמריקנית אוסף סוג. עבודה עם תאים במעבר נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים כדי להגיע למפגש 80% היום של הניסוי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש ~ 12 x 10 6 תאים לכל תנאי ניסוי. לפני קבלת תמציות לניתוח polysome, לעורר תרגום על ידי הוספה בינונית מלא טרי לפחות 90 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד מוח: לבודד את המוח מעכברים בגילים שבין 9 ו16 ימים לאחר לידה. המתת חסד כרוך משאיפת CO 2 אחרי הרדמה ונקע בצוואר הרחם. בעקבות הקרבה, לבודד את המוח כולו וגם מקום שאניt ב -80 מעלות צלזיוס או ישירות להעביר אותו לקר PBS 1X לשימוש מיידי. </li></ol> 2. מערכת ההיפוך החלוקה Gradient הכנת הצפיפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את מערכת צינורות עם 0.1% SDS למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את מערכת צינורות עם אתנול 70% למשך 5 דקות, ולאחר מכן עם RNaseZAP פתרון עבור 5 דקות לפני שטיפה עם מים DEPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משאבת אוויר כדי לייבש את מערכת צינורות של המנגנון. </li></ol> 3. הכנת עירובי סוכרוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את פתרונות סוכרוז 15% ו55% ב20 מ&quot;מ טריס-HCl pH 7.4, 1.25 מ&quot;מ MgCl 2, 150 mM NaCl, ו1 מ&quot;מ DTT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור 15-55% שיפוע סוכרוז ליניארי באמצעות ISCO דגם 160 שיפוע לשעבר, כפי שתוארו על ידי הוראות היצרן. עם זאת, חשוב לשלוט גם על מהירות משאבת peristaltic טריס על מנת למנוע יצירה של בועות או מערבולות בהדרגות. שמור הדרגתיים על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הזמן שבו תכנית יצרנית השיפוע פועלת, לקרר את ultracentrifuge עד 4 ° C. </li></ol> 4. הכנת נייד ותמציות מוח עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תמציות סלולריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת מקום (ים) בתאי קרח ולשטוף 3x עם PBS הקר 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים (~ 12 x 10 6) במאגר 1 תמוגה מיליליטר (20 מ&quot;מ טריס-HCl ב-pH 7.4, 1.25 מ&quot;מ MgCl 2, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% P40 Nonidet, 5 מעכב U / מיליליטר RNase, בתוספת עם טבליות מעכבי פרוטאז קוקטייל מלאים מיני ללא EDTA), להעביר אותם לצינור Eppendorf, ומערבבים היטב על ידי העברתם 15x באמצעות מזרק אינסולין U100 1cc 28 G 1/2. בואו lysate התא לנוח על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים כמה טיפות של lysate תא לשקופית להעריך תמוגה הסלולרית על ידי ההתבוננות במיקרוסקופ לעומת שלב באמצעות מטרת 10X. גרעינים רק צריכים להיות גלויים ולא קרום תא צריך להיות מעיד גלוי לתמוגה תא. כמו שליטה, להתבונןתאי unlysed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר את lysate התא על ידי צנטריפוגה ב11,000 XG עבור 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולשמור lysate המסיסים המכיל polyribosomes. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תמציות מוח עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize המוח כולו המבודד (~ מ&quot;ג 500) על ידי 10 משיכות בhomogenizer Dounce קר כקרח עם 2 מיליליטר של חיץ תמוגה ולהבהיר את homogenate על ידי צנטריפוגה ב11,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את supernatant וכתוצאה מכך על כרית של סוכרוז 50% ולהמשיך עם שקיעה לשעה 2 ב 200,000 XG באמצעות הרוטור ultracentrifuge TH-641 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור השקוף המכיל polyribosomes ב 1 מיליליטר של חיץ תמוגה ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. בואו שאר ההשעיה על הקרח למשך 30 דקות לפני העמסתי על הדרגות. </li></ol></li></ol> 5. טוען תמציות על סוכרוז הדרגות וultracentrifugation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הריכוזשל RNA הנמצא בתמצית cytoplasmic באמצעות ספקטרופוטומטר. לאט ובזהירות לטעון ~ 20 OD 260 יחידות של התמצית על גבי שיפוע סוכרוז 15% ל55%. ודא שיש 2-3 מ&quot;מ של שטח פנוי על פני השטח של צינור כדי למנוע גדות הצינורות במהלך צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הדרגתיים באמצעות אולטרה צנטריפוגות במשך שעה 2 30 דקות ב 230,000 XG באמצעות הרוטור ultracentrifuge TH-641 ב 4 ° C. כאשר מסתיימת צנטריפוגה, להסיר את הצינורות ומניח אותם על קרח בזהירות שלא להפריע את השיפועים. </li></ol> 6. היפוך חלוק של תמציות cytoplasmic לPolysomes פרופיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח הדרגתיים סוכרוז על מערכת היפוך חלוקה צפיפות אוטומטית ולהמשיך עם חלוקה ואיסוף אוטומטיים של שברים (0.5 מיליליטר כל אחד), כפי שתואר על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף כל חלק (~ μl 500) לתוך צינורות Eppendorf אדם עם ניטור רציף של הספיגה ב 254 ננומטר. בparallאל של מבצע חלוקה השיפוע, פרופיל polyribosomal יהיה עריכה על נייר התרשים. לחלופין, השתמש ביחידת רכישת נתונים המצורפת למקליט התרשים יש רכישה אלקטרונית של פרופיל polysome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף כל סיבוב, להעביר eppendorfs נאסף על קרח יבש. בשלב זה, גם חנות שנאספו שברים ב -80 מעלות צלזיוס או ישירות משקע מתחמי החלבון-RNA באופן הבא. </li></ol> 7. מיצוי חלבון וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל שבר שנאסף משיפוע סוכרוז, להוסיף 2 כרכים של 100% אתנול קר ולתת קומפלקסי RNA-חלבון לזרז ב -20 לילה מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כל משקע RNA-חלבון ב11,000 XG עבור 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לשטוף עם 70% אתנול. יבש וresuspend המשקע בחיץ מדגם SDS-PAGE לפני שתמשיך עם כתם מערבי באמצעות נוגדנים ספציפיים (ראה איור 2). </li></ol> 8. RNA חילוץ וnalysis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משקע מתחמי RNA-חלבון כמו בסעיף 7.1. Resuspend כל משקע RNA-חלבון במאגר תמוגה מכיל 0.1% SDS. לעכל את מרכיב החלבון של המשקע עם 2 מ&quot;ג / מיליליטר proteinase K ל30 דקות באמבט מים C ° 55. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ רכיבי RNA של המשקע על ידי הוספת נפח של 1 &quot;פנול: כלורופורם&quot;, 2 כרכים של כלורופורם, ו0.1 נפח של 2-pH M NaOAc 4 וצנטריפוגה ב 10,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. משקע RNA מהשלב וכתוצאה מהמימי של כל דגימת לילה בשעה -20 ° C על ידי הוספת נפח של 1 isopropanol ו0.2 מיקרוגרם / μl של גליקוגן. ספין המשקע עבור שעה 1 ב 10,000 XG ב 4 ° C. שטוף את כדור RNA עם 70% אתנול קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדור RNA לנפח קטן של מים חופשיים RNAse. להעריך את הכמות ואיכות של RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. </li></ol>

<ol>
	<li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+translational+control.">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).</li><li>Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation.">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).</li><li>Fournier, M. -. J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules.">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell International. 10 (12), (2010).</li><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression.">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li><li>Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Mental+Retardation+protein+determinants+required+for+its+association+with+polyribosomal+mRNPs.">Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs.</a> Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).</li><li>Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Metazoan+stress+granule+assembly+is+mediated+by+P-eIF2alpha-dependent+and+-independent+mechanisms.">a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms.</a> RNA. 15 (10), 1814-1821 (2009).</li><li>Gareau, C., Houssin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+fragile+x+mental+retardation+protein+recruitment+and+dynamics+in+Drosophila+stress+granules.">Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules.</a> PLoS ONE. 8 (2), (2013).</li><li>Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+transcript+isoforms:+association+with+polyribosomes;+regional+and+developmental+expression+in+mouse+brain.">FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain.</a> PLoS ONE. 8 (3), (2013).</li><li>Khandjian, E. W., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+evidence+for+the+association+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+brain+polyribosomal+ribonucleoparticles.">Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).</li><li>Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+of+gene+expression+in+the+human+brain.">Translational control of gene expression in the human brain.</a> Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).</li><li>Stephens, S. B., Nicchitta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V+In+vitro+and+tissue+culture+methods+for+analysis+of+translation+initiation+on+the+endoplasmic+reticulum.">V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum.</a> Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).</li><li>Koritzinsky, M., Wouters, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+regulation+of+messenger+RNA+translation.">Hypoxia and regulation of messenger RNA translation.</a> Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).</li><li>Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+ribosomes.">The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes.</a> Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).</li><li>Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+slowdown+mediates+translational+arrest+during+cellular+division.">Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).</li><li>Thomas, J. D., Johannes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mRNAs+that+continue+to+associate+with+polysomes+during+hypoxia.">Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia.</a> RNA. 13, 1116-1131 (2007).</li><li>Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., L&#252;, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+gene+translation+profiles+reveal+tumor+type+and+cancer-specific+components.">Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components.</a> Cancer Research. 68 (10), 3819-3826 (2008).</li><li>Fournier, M. -. J., Coudert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+mTORC1-eIF4E+Pathway+alters+Stress+Granules+Formation.">Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).</li><li>Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+the+survival+motoneuron+protein+as+a+translational+regulator.">A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator.</a> Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).</li><li>B&#233;chade, C., Rostaing, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+survival+motor+neuron+(SMN)+protein:+possible+involvement+in+nucleocytoplasmic+and+dendritic+transport.">Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport.</a> The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).</li><li>Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., C&#244;t&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDRD3,+a+novel+Tudor+domain-containing+protein,+localizes+to+cytoplasmic+stress+granules.">TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules.</a> Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).</li><li>Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+let-7a+miRNA+blocks+protein+production+on+actively+translating+polyribosomes.">Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).</li><li>Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+to+analyse+the+specific+impact+of+rapamycin+on+mRNA-ribosome+association.">An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association.</a> BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).</li><li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., M&#252;llner, E. W., Garcia-Sanz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments.">a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li><li>Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation.">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li><li>Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+footprints+on+a+transcriptome+landscape.">Ribosomal footprints on a transcriptome landscape.</a> Genome Biology. 10 (4), (2009).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

ניתוח פרופיל polysome על הדרגתיים סוכרוז מאפשר מדידה של חניכה תרגום על ידי ניתוח הצפיפות של polysomes מבודד תאים או רקמות 9,11-14. טכניקה זו היא הטובה ביותר (אם לא ייחודית) הגישה למדידת ייזום תרגום in vivo. הוא משמש כדי לפקח על מצב translational של גידול תאים בתא מחזור 15, וכ?...

תאי אוקריוטים נתקלים כל הזמן במגוון של מצבים פיסיולוגיים וסביבתיים מזיקים מתח שדורשים תגובת תא הסתגלות מהירה. תגובת לחץ תא כרוכה באיזון מדויק בין גורמים הפועלים נגד הישרדות והפרה הישרדות. לשבש את האיזון הזה יכול להיות השלכות בלתי הפיכות המובילות את הפיתוח של פתולוגיות אדם כגון סרטן ומחלות ניווניות. במהלך השלב הראשון של תגובת הלחץ, תאים להפעיל מסלולים הפרו הישרדות שכוללים שליטה מתואמת של שינויים בביטוי גנים ברמה של תרגום ה-mRNA. תרגום ה-mRNA באאוקריוטים הוא תהליך תאי מורכב שכרוכים באינטראקציות מתואמות בין גורמי חניכה התרגום (EIFS), חלבוני RNA הספציפי מחייבים (ריב &#39;), ומולקולות RNA 1. תרגום ה-mRNA מתחלק לשלושה שלבים ברורים: ייזום, התארכות, וסיום. למרות שכל שלושת השלבים כפופים לreguמנגנוני latory, מנגנוני בקרת translational למקד בעיקר בשלב הייזום של תרגום, אשר ובכך מהווה את צעד שער הגבלה של חלבון סינתזה 2. חניכה תרגום היא תהליך הורה מאוד שמתחיל עם הקמתה של eIF2a.GTP.Met-tRNA פגשתי מורכב משולשת ולאחר מכן מחייבת שלה למקטע הריבוזום 40S, מה שמוביל להיווצרות של המתחם טרום החניכה. השלב הבא הוא הגיוס של מתחם preinitiation mRNA, הכולל את הפעילות של גורמי חניכה תרגום כגון eIF4F וeIF3. מורכב preinitiation 48S וכך נוצרו עובר שינויי קונפורמציה ספציפיים המאפשרים למנגנון הזה כדי להתחיל לסרוק את אזור 5&#39;-מתורגם של ה-mRNA עד שהוא מזהה את הייזום קודון אוגוסט אז רוב גורמי החניכה התרגום משתחררים ויחידות משנת 60S מגויסות כדי ליצור 80S הריבוזום מורכב מוסמך לתרגום,לא שמתחיל את סינתזת חלבון נקודה (איור 1). יותר מפעם אחת 80S monosome ניתן לתרגם את אותו mRNA בזמן הפקת polysomes שנקרא (או polyribosomes). הצפיפות של polysomes על mRNA משקפת ייזום, התארכות ושיעורי סיום ובכך הוא מדד של translatability של תעתיק מסוים. עם זאת, polysome פרופיל משמש בעיקר כדי להעריך את השינויים בתרגום ה-mRNA בשלב הייזום. כאן השתמשנו מעכב הפרוטאזום כמעכב ייזום תרגום. טיפול בתאי סרטן עם תרופה זו גורם לתגובת לחץ המאופיינת בהפעלה של קינאז בשם המתח HRI שphosphorylates גורם החניכה תרגום eIF2a 3. זירחון של eIF2a הוא אחד האירועים המרכזיים שהובילו לעיכוב של חניכה תרגום בתאי יונקים 4.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cells</td></tr><tr><td>HeLa cervical cancer cells</td><td>American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Schneider &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; embryonic cells</td><td>American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)</td><td>CRL-1963</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Culture medium and Supplements</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SO146-500ml</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life technologies</td><td>11995-073</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientist Scientist</td><td>SH30396-03</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Sucrose solutions</td></tr><tr><td>D-sucrose</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP220-212</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49767</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Fisher Scientist</td><td>B3925</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Lysis buffer</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Tekniscience</td><td>3624-05</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 9779</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nonidet P40 (Igepal CA-630 )</td><td>MJS Biolynx</td><td>19628</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Tekniscience</td><td>4095-02</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor)</td><td>Life technologies</td><td>10777-019</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Antiproteases (complete, mini, EDTA free)</td><td>Roche</td><td>11,836,170,001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">RNA Extraction</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Life technologies</td><td>AM2542</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phenol:chloroform</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP1754I-400</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientist</td><td>C298-500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Life technologies</td><td>10814-010</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Acros organics</td><td>327270010</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Antibodies</td></tr><tr><td>anti-FMRP antibody</td><td>Fournier &lt;i&gt;et al.&lt;/i&gt;, Cancer Cell International, 2010</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling

שליטה מדויקת של תרגום ה-mRNA היא יסוד להומאוסטזיס תא אוקריוטים, בעיקר בתגובה ללחץ פיסיולוגי ופתולוגיים. שינויים של תכנית זו יכול להוביל לצמיחה של תאים שניזוקו, סימן היכר של התפתחות הסרטן, או למוות של תאים מוקדמים כגון ראה במחלות ניווניות. הרבה ממה שידוע בנוגע לבסיס המולקולרי לבקרת translational כבר מתקבלים מניתוח polysome באמצעות מערכת חלוקה שיפוע צפיפות. טכניקה זו מסתמכת על ultracentrifugation של תמציות cytoplasmic על שיפוע סוכרוז ליניארי. ברגע שהספין הושלם, המערכת מאפשרת חלוקה וכימות של אזורי centrifuged המתאימים לתרגום שונה הריבוזומים אוכלוסיות, ובכך וכתוצאה מכך פרופיל polysome. שינויים בפרופיל polysome מעידים על שינויים או פגמים בייזום תרגום המתרחשים בתגובה לסוגים שונים של מתח. טכניקה זו מאפשרת גם להעריך את התפקיד דואר של חלבונים ספציפיים על ייזום תרגום, וכדי למדוד את פעילות translational של mRNAs הספציפי. כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו לביצוע פרופילי polysome על מנת להעריך חניכה תרגום של תאים ורקמות אוקריוטים בתנאי גידול נורמלים או מתח.

כאמור, polysome פרופיל מאפשר הניתוח של שינויים של חניכה תרגום בתנאי לחץ. איור 1 היא תצוגה פשוטה של ייזום תרגום אשר כפי שתואר קודם לכן הוא תהליך רב שלבי מעורבים הרכבה מסודרת של מתחמי ייזום תרגום. תחת תנאי גידול רגילים, מתחמי ייזום תרגום מומרים לpolyribosomes גילויו על יד?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling at JoVE.com

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח שינויים בייזום של תרגום ה-mRNA של תאי אוקריוטים בתגובה למצבי לחץ. שיטה זו מבוססת על הפרדת המהירות בשיפועי סוכרוז של תרגום ריבוזומים מהריבוזומים שאינם תרגום.

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

analysis-translation-initiation-during-stress-conditions-polysome

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Views.  Laval University.  כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח שינויים בייזום של תרגום ה-mRNA של תאי אוקריוטים בתגובה למצבי לחץ. שיטה זו מבוססת על הפרדת המהירות בשיפועי סוכרוז של תרגום ריבוזומים מהריבוזומים שאינם תרגום. 

Video: Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Biochemistry

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

האיקריוטים פרופיל Polyribosome ניתוח

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell types. This balance is tightly controlled by gene expression that is fine-tuned at multiple levels, including transcription, post-transcription and translation. In this regard, a growing body of evidence highlights a critical role of translational regulation in coordinating neural stem cell fate decisions. Polysome fractionation is a powerful tool for the assessment of mRNA translational status at both global and individual gene levels. Here, we present an in-house polysome profiling pipeline to assess translational efficiency in cells from the developing mouse cerebral cortex. We describe the protocols for sucrose gradient preparation, tissue lysis, ultracentrifugation and fractionation-based analysis of mRNA translational status.

The development of the mammalian brain requires proper control of gene expression at the level of translation. Here, we describe a polysome profiling system with an easy-to-assemble sucrose gradient-making and fractionation platform to assess the translational status of mRNAs in the developing brain.

ניתוח תרגום במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Neuroscience

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

שיטה קלה הצמח Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...