SynthSys um Centro para Biologia de Sistemas Integrativa financiado pelo BBSRC e adjudicação EPSRC D019621. UE Rede de Excelência FP6 &quot;Genomics Marinhos&quot; bolsa para FYB financiou o desenvolvimento de métodos de transformação genética.

1. Preparação de Material de algas <ol><li> As células são cultivadas em Ostreococcus água do mar artificial (ASW). Sais do mar (tipicamente cerca de 40 gramas por litro) são dissolvidos em água desionizada para uma salinidade de 30 ppt, tal como medido usando um medidor de salinidade. Meio de enriquecimento 11,12, elementos vestigiais de metal e vitaminas são adicionados como descrito nas Tabelas 1-3. Os meios de comunicação é, então, esterilizada por filtração através de um filtro de 0,22 um. </li><li> Para a manutenção, as células de Ostreococcus estirpe OTTH95 são sub-cultivadas assepticamente a uma diluição de 1/100 em ASW fresco a cada 7 dias e cultivadas sob luz constante numa unidade de crescimento incubadora equipado com luar filtro azul. A intensidade da luz deve ser próximo de 20 umol m -2 s -1 e temperatura é mantida a 20 ° C. Células não requerem agitação constante, mas são agitados uma vez cada 2 a 3 dias para evitar a agregação. </li><li> Para cada transformação, 50 ml de células são necessários com uma célula density de 20-30 x 10 6 ml -1, que deve ser atingido 5-7 dias após sub-cultura. A densidade celular aproximada e axeny pode ser determinada utilizando qualquer citometria de fluxo ou um hemocitómetro a um mínimo de aumento de 40X. </li></ol> 2. Eletroporação <ol><li> Preparar DNA para a transformação. Para cada transformação, 5 ug de puro, o DNA linearizado plasmídeo é necessário a uma concentração de 1 ug / uL em água desionizada estéril. Para obter esse DNA, os autores recomendam usar um kit Qiagen midi preparação, embora outros métodos podem funcionar igualmente bem. Digerir o produto com uma enzima que corta na espinha dorsal do vector utilizado, mas não no transgene ou gene de selecção. Além disso purificar e concentrar o ADN linear resultante por precipitação com etanol, e ressuspender o produto no volume apropriado de alta qualidade da água desionizada estéril. </li><li> Preparar tubos de microcentrífuga contendo 5 ug de DNA para cada transformação. A controvérsial sem DNA é necessária para cada linha celular a ser transformado. Manter estes tubos em gelo, em conjunto com uma cuvete de electroporação 2 mm para cada transformação. </li><li> Preparar 2,2 ml de tampão de ressuspensão por transformação. Dissolver Sorbitol a uma solução 1 M em ddH2O, adicionar 0,1% de ácido Pluronic F68 eo filtro-esterilizar. </li><li> Adicionar ácido plurónico F68, a uma concentração final de 0,1% para as células, e pellet-los durante 10 minutos a 8000X g, a 10 ° C num tubo de 50 ml com fundo cónico. Imediatamente ressuspender as células em 1 ml de tampão de ressuspensão por pipetagem para cima e para baixo, e transferir para um tubo de microcentrífuga. Girar para baixo durante 10 minutos a 8000 xg a 10 ° C, e trabalhando rapidamente, repetir este passo de lavagem mais uma vez. </li><li> Com uma ponta de corte, ressuspender cada sedimento final em 40 ul de tampão de ressuspensão. Adicionar 40 ul de as células ressuspensas a cada tubo de DNA linearizado em gelo, misturar suavemente e transferir para a cuvete de electroporação. </li><li> Coloque a cuba no electropmáquina de oração. Altere as configurações para 6 kV cm -1, 600 Ω e 25 uF. Electroporate as células. </li><li> Incubar as células electoporated nas cuvettes à temperatura ambiente durante 10 minutos, e usar esse tempo para preparar os frascos de cultura de tecidos. Identificá-los e adicionar 30 ml de ASW fresco a cada um. Tomar 1 ml de cada frasco e suavemente adicioná-la à cuvete correspondente. Incubar durante 2 minutos e remover suavemente a ASW, agora contendo o glóbulo de células e suavemente e lentamente pipetar directamente para o ASW no frasco de cultura. </li><li> Células permanecem tipicamente em um glóbulo. Tome cuidado para não abalar ou perturbar as células agregadas neste momento. Permitir que as células para se recuperar na incubadora durante 1-2 horas, em seguida, ressuspender por agitação dos frascos. Neste momento, as células devem ressuspender livremente e não aglomerados deve ser visível. Deixe as culturas para se recuperar durante a noite na incubadora. </li></ol> 3. Inclusão de células em placas em meio semi-sólido <ol><li&gt; No dia seguinte, autoclave uma solução de 2,1% de agarose de baixo ponto de fusão em ddH2O em um frasco contendo uma haste de agitação. Manter fundido a 65-90 ° C em um copo contendo água maior sobre um agitador magnético de aquecimento. Para cada transformação preparar 8 placas de Petri (55 mm de diâmetro) e 8 x 15 ml tubos cada um contendo 9 ml de ASW mais a selecção requerida. Se usando Nourseothricin ou G418, utilizar 2 mg / ml. </li><li> Recolher as células transformadas a partir da incubadora. Trabalhando em um flowhood estéril, adicionar 1 ml de ebulição LMP de agarose para os 9 ml de um dos tubos. Fechar o tubo e misturar por inversão. Em seguida, adicionar 0,5 ml de células de fresco transformadas, de forma rápida e misturar verter na placa. Repita esse processo com os restantes 7 tubos e prossiga para o balão de transformação que vem. </li><li> Deixar as placas abrir na capela de fluxo por uma hora, para a agarose a ser definido. Em seguida, feche as placas e transferi-los para grandes pratos quadrados de Petri, que irá realizar 4 placas cada. Selar a sagacidade placas quadradash parafilme. Note-se que as placas não irá definir completamente, e como resultado, o gel é muito frágil. Cuidados devem ser tomados para não quebrar o gel durante a movimentação das placas. Coloque todas as placas quadradas na incubadora. </li></ol> 4. Seleção de colónias transformadas <ol><li> Colónias deve aparecer após 10 a 21 dias, com as placas de transformação, mas não sobre as placas de simulação transformadas. Para escolher colônias usar uma pipeta de 200 ul com dicas de corte. Basta selecionar colônias livres e sugar a colônia verde. Tome cuidado para não incluir todas as células de colônias vizinhas. </li><li> Transferir as células a 2 ml de meio líquido contendo a selecção, numa placa de poços 24. Quando se utiliza Nourseothricin, usar 1,75 mg / ml. Misturar por pipetagem cima e para baixo. Selecione 24-50 colônias por transformação. Selar as placas com parafilme e transferência para a incubadora. </li><li> Após uma semana, transferir 100 uL de cada poço a 2 ml fresco ASW com selecção de uma placa de poços 24 e crescer para uma additional 7 dias. Linhas de células sobreviventes pode ser usado para estudos posteriores. Integração estável no número genoma e inserção deve ser analisado utilizando PCR e Southern Blot. O ADN genómico pode ser obtido para estes fins, utilizando qualquer método para baixo em escala padrão para extracção de ADN de plantas. </li></ol> 5. Os resultados representativos Células divididas 1/100 atingiu uma densidade de 25 milhões de células por mililitro após crescimento durante 7 dias. Eletroporação das células com as configurações adequadas resultou em um tempo de constantes entre 10 e 14 milissegundos. Quando as células são transferidas para o meio em frascos de cultura, um glóbulo de células deve formar-se. Quando levemente abalada depois de uma hora, as células devem facilmente ressuspender. A inclusão de células de 1 ml transformadas em agar LMP 0,2% deverá resultar num consistente, mas apenas gel semi-sólido. Colónias deve aparecer após 10 a 21 dias. Quando transformando 5 ug de DNA linearizado utilizando o protocolo anterior, 50-100 colónias por transformaçãoplaca foram tipicamente esperado, versus nenhum sobre as placas de controlo negativo. ~ 80% das colónias escolhidas foram positivamente seleccionadas pela resistência a antibióticos em meio líquido e foram utilizados em estudos subsequentes. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Concentração final </td><td> Solução estoque </td><td> Volume para 1 litro </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td> 8,83 x 10 -4 M </td><td> 75 g / L de dH2O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> De NH4CI </td><td> 3,63 x 10 ~ 5 M </td><td> 2,68 g / L de dH2O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> β-glicerofosfato </td><td> 1 x 10 ~ 5 M </td><td> 2,16 g / L de dH2O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> H 2 3 SeO </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 1,29 mg / L de dH2O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> Tris-base (pH 7,2) </td><td> 1 x 10 M -3 </td><td> 121,1 g / L de dH2O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> K solução de metal traço </td><td></td><td> Tabela 2 </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> f / 2 solução de vitaminas </td><td></td><td> Tabela 3 </td><td> 0,5 mL </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Constituintes do meio para o crescimento de O. tauri 11, 12. Perfazer um volume total de 1 litro de água do mar artificial a uma salinidade de 30 ppt, e adicionar os componentes acima a partir de soluções de reserva, como indicado. Filtrar a esterilizar o meio e utilização dentro de uma semana. Existências de todos os compostos, excepto a solução de vitaminas podem ser agrupados para adicionar 6 ml desta solução para cada litro de meio. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Concentração final </td><td> Solução estoque </td><td> Valor para 1 litro </td></tr><tr><td> Na 2 </sub&gt; EDTA • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 M -4 </td><td></td><td> 41,6 g </td></tr><tr><td> FeCl 3 6H 2 O • </td><td> 1 x 10 ~ 5 M </td><td></td><td> 3,15 g </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 6,3 g / L de dH2O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 ó </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 22,0 g / L de dH2O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 10,0 g / L de dH2O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 180,0 g / L de dH2O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 9,8 g / L dH <sub&gt; 2 ó </td><td> 1 mL </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Rastreamento de metal solução 11,12. Perfaz-se a um total de 1 litro, em dH2O, e aquece-se dissolver. Solução alíquota eo congelamento para armazenamento. As concentrações finais indicadas referem-se ao meio final, não a solução de vestígios metálicos. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Concentração final </td><td> Solução estoque </td><td> Valor para 1 litro </td></tr><tr><td> A vitamina B 12 </td><td> 1 x 10 -10 M </td><td> 1 g / L de dH2O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> Biotina </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 0,1 g / L de dH2O </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> • A tiamina HCl </td><td> 1 x 10 -7 M </td><td></td><td> 200 mg </td></tr></tbody></table> Tabela 3. f / 2vitamina solução 11. Perfazer para um total de 1 litro em dH2O, filtro-esterilizar, alíquota e congelar. As concentrações finais indicadas referem-se ao meio final, não a solução de vitaminas. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> Figura 1. Resumo gráfica do processo de transformação. Representação esquemática do procedimento para transformar geneticamente Ostreococcus tauri por electroporação. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> Figura 2. Células de crescimento da cultura. São sub-cultivadas assepticamente a uma diluição de 1/100 em ASW fresco a cada 7 dias e cultivadas sob luz constante numa unidade de crescimento incubadora equipado com luar filtro azul. A intensidade da luz deve ser próximo de 20 umol m -2 s -1 e temperatura é mantida a 20 ° C Células não requerem agitação constante, mas são sHaken uma vez cada 2 a 3 dias para evitar a agregação. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> Figura 3. Formação de colônias em 0,2% agarose LMP. Transferência de 4 placas de uma placa de Petri grande e quadrada, e vedação com parafilme (superior esquerdo). Quando formaram colônias, basta selecionar livres (de preferência de forma cónica) colônias (canto superior direito) e sugá-los para fora da placa com uma pipeta de p200. Não deve haver colônias no controle negativo (inferior direito).

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	<li>Derelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+analysis+of+the+smallest+free-living+eukaryote+Ostreococcus+tauri+unveils+many+unique+features.">Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).</li><li>Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+ultrastructure+of+O.+tauri:+electron+cryotomography+of+an+entire+eukaryotic+cell.">3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell.</a> PLoS One. 2, e749 (2007).</li><li>O'Neill, J. 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Biol. 21, 869-875 (2011).</li><li>Troein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+light+inputs+to+a+simple+clock+circuit+allow+complex+biological+rhythms.">Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms.</a> Plant. J. 66, 375-385 (2011).</li><li>Corellou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clocks+in+the+green+lineage:+comparative+functional+analysis+of+the+circadian+architecture+of+the+picoeukaryote+ostreococcus.">Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus.</a> Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).</li><li>O'Neill, J. S., Reddy, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clocks+in+human+red+blood+cells.">Circadian clocks in human red blood cells.</a> Nature. 469, 498-503 (2011).</li><li>Monnier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrated+transcription+of+biological+processes+in+the+marine+picoeukaryote+Ostreococcus+exposed+to+light/dark+cycles.">Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles.</a> B.M.C. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphate-regulated+promoter+for+fine-tuned+and+reversible+overexpression+in+Ostreococcus:+Application+to+circadian+clock+functional+analysis.">A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis.</a> PLoS One. 6, e28471 (2011).</li><li>Moulager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+light+signals+by+the+retinoblastoma+pathway+in+the+control+of+S+phase+entry+in+the+picophytoplanktonic+cell+Ostreococcus.">Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus.</a> PLoS. Genet. 6, e1000957 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Axeny estado e cultura celular é de importância crucial para o processo de transformação. Embora as células são normalmente mantida em ciclos de 12 horas de luz, 12 horas escuro, a eficiência da transformação nas células cultivadas sob estas condições foram encontrados para ser insuficiente. Durante os repetidos granulação / ressuspensão etapas, as células devem sempre ressuspender facilmente. Se as células agregado, ou uma substância muco-como é presente, é melhor para iniciar o processo desde o início novamente. Tipicamente, ~ 50 colónias pode ser esperado em cada placa de transformação, versus nenhum sobre a placa de controlo negativo. No caso de baixa eficiência de transformação, as condições de cultura deve ser variada para assegurar células estão no estado ideal. As variáveis ​​que afectam a eficiência de transformação incluem a temperatura ambiente no laboratório (deve estar próxima de 20 ° C) e velocidade de manipulação (Processo de granulação células [2,3] para recuperação [2,7] deve tomar ~ 1 hora). É também importante que todas as soluções de umre feito fresco antes de cada transformação. Para inclusão em placas, a concentração de LMP de agarose é crucial. Células Ostreococcus não crescerão em concentrações elevadas de agarose, e irá difundir em baixas concentrações. Três vetores de transformação para Ostreococcus foram publicados anteriormente 6, e mais vetores devem ser gerados e publicados em breve. O vector existente Pot-Luc 6 permite a utilização de um promotor de escolha, em combinação com uma etiqueta de pirilampo C-terminal da luciferase permitindo a selecção de linhas transgénicas mais rápida, mais padrões de expressão tratáveis, enquanto que o vector Potox 6 transporta o forte promotor indutível 13 tirada da Ostreococcus Fosfato de alta afinidade gene transportador (HAPT) para sobre-expressão de gene de interesse. O vector Potox-Luc deriva Potox, transportando um marcador de luciferase adicional que pode ser utilizada para a selecção de linhas indirecta superexpressão <saté&gt; 14. Marcadores de seleção de sucesso sobre esses vetores são Nourseothricin e G148. No entanto, as células Ostreococcus são altamente resistentes a vários antibióticos, e as concentrações de compostos necessários para a selecção de células transgénicas Ostreococcus é maior do que para os sistemas de modelo convencional (2 mg / ml). Embora o processo parece ineficiente, o grande número de células e ADN de plasmídeo necessária para este procedimento não representa qualquer obstáculo significativo. Um maior limitação é que cada linha gerada, que é resistente ao marcador seleccionável precisa de ser analisadas individualmente para verificar que a construção inteira está integrado no DNA. Observamos exemplos em que a expressão bem sucedida do marcador seleccionável não correspondiam a inserção do gene de interesse real; integrações ie parciais podem ocorrer. Evidentemente, a inserção aleatória no genoma também significa que não existe controlo do local de inserção utilizando este método, e métodos bom base na recombinação homóloga estão sendo desenvolvidos atualmente. No entanto, o método aqui descrito é, para o nosso melhor conhecimento, actualmente o único método caracterizado para gerar células Ostreococcus geneticamente modificados. Como Ostreococcus tauri só recentemente foi usado como um organismo modelo experimental, a maioria dos métodos de trabalho com essas células é susceptível de evoluir e ser refinado pela comunidade de pesquisa em crescimento envolvidos. Este protocolo destina-se a ajudar as pessoas a iniciar os trabalhos com Ostreococcus, mas nem por isso pretende descrever tudo o que há para saber sobre a transformação genômico da microalga. A confiança autores que os leitores serão capazes de se adaptar este protocolo para suas próprias necessidades como pequenas diferenças em incubadoras (níveis de luz ou de qualidade) e os outros parâmetros existentes e provavelmente terá de ser otimizado em cada laboratório individual para obter as culturas saudáveis ​​necessários para este protocolo. Depois de dominar as técnicas descritas aqui,vectores podem ser construídos para gerar luminescente, fluorescente, ou outras linhas de fusão etiquetados sob o controlo de uma variedade de promotores. Esta plataforma experimental emocionante novela será útil para estudar como os complexos problemas bioquímicos são resolvidos em um eucarionte de complexidade reduzida, em que abordagens farmacológicas são altamente facilitada 3.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Constituintes do meio </td></tr><tr><td> Químico </td><td colspan="2" > Número de catálogo </td><td> Fornecedor </td></tr><tr><td> Instantânea Marinha do Oceano Sal </td><td colspan="3"> da <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> ou <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td colspan="2"> S5506-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> De NH4CI </td><td colspan="2"> A9434-500G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Glicerol 2-fosfato hidrato de sal dissódico </td><td colspan="2"> G9422-100G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> H 2 3 SeO </td><td colspan="2"> 84920-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ultra pura tris </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Na 2 EDTA • 2 O 2H </td><td colspan="2"> BPE120-500G </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> FeCl 3 6H 2 O • </td><td colspan="2"> 157740 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 • 2H 2 O </td><td colspan="2"> 31439-100G-R </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 ó </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 31277 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td colspan="2"> 203.734-5G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> A vitamina B 12 (cianocobalamina) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Biotina </td><td colspan="2"> 47868 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> • A tiamina HCl </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ampicilina </td><td colspan="2"> A9518-25G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Neomicina </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Canamicina </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td colspan="4"> Os consumíveis para a cultura </td></tr><tr><td colspan="2"> Item </td><td> Número de catálogo </td><td> Fornecedor </td></tr><tr><td colspan="2"> Frasco para cultura de tecidos T25 culturas em suspensão perfurada com derramamento Canal </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Frasco para cultura de tecidos T75 culturas em suspensão perfurada com derramamento Canal </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Frasco para cultura de tecidos T175 culturas em suspensão perfurada com derramamento Canal </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Garrafa TPP filtros principais, 1l, completos </td><td> 99950T </td><td> Helena Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> Filtros Garrafa TPP topo, 500ml, </td><td> 99500T </td><td> Helena Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> Garrafa TPP filtros topo, 250ml, </td><td> 99250T </td><td> Helena Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> Garrafa TPP filtros topo, 150ml, </td><td> 99150T </td><td> Helena Bioscience </td></tr><tr><td colspan="2"> Medidor de Salinidade para Marine Aquarium </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="3" > Produtos químicos para a transformação </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Catálogonúmero </td><td> Fornecedor </td></tr><tr><td> D-Sorbitol </td><td> S6021-1KG </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Solução de Pluronic F-68 </td><td> P5556-100ML </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51000 </td><td> Werner </td></tr><tr><td> Baixo ponto de fusão de agarose </td><td> 16520-050 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td colspan="3"> Consumíveis para a transformação </td></tr><tr><td> Item </td><td> Número de catálogo </td><td> Fornecedor </td></tr><tr><td> Frasco para cultura de tecidos T25 culturas em suspensão perfurada com derramamento Canal </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Frasco para cultura de tecidos T75 culturas em suspensão perfurada com derramamento Canal </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Frasco de cultura de tecido T175 Suspensão Cultures perfurada com derramamento Canal </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Tubos de centrífuga Greiner 50ml </td><td> 227261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td> Gene Pulser / MicroPulser Cubetas, 0,2 gap cm, 50 </td><td> 165-2086 </td><td> Bio-Rad </td></tr><tr><td> Petri prato redondo PS 3 ABERTURAS H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR International </td></tr><tr><td> Placa de Petri quadrado, com quatro saídas de poliestireno estéril por 120 milímetros de irradiação clara </td><td> FB51788 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Luar Azul filtro de luz </td><td> 183 </td><td> Lee Iluminação </td></tr></tbody></table>

genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri

Os problemas mais comuns que impedem um progresso rápido em Ciências da planta incluem tecido, celulares e complexidade organismo como um todo e, nomeadamente, o elevado nível de redundância genética genômica afetando simples em plantas superiores. O novo modelo organismo Ostreococcus tauri é o menor eucariota de vida livre conhecido até à data, e possui um tamanho de genoma grandemente reduzida e 1,2 complexidade celular, que se manifesta-se pela presença de apenas uma da maioria dos organelos (mitocôndria, cloroplasto, pilha de Golgi) por celular, e um genoma que contém apenas ~ 8000 genes. Além disso, a combinação de unicellularity e cultura fácil proporciona uma plataforma passível de abordagens em biologia químicos. Recentemente, Ostreococcus tem sido empregada com sucesso para estudar mecanismos básicos subjacentes cronometragem circadiano 3-6. Os resultados deste organismo modelo ter afetado não só a ciência das plantas, mas também a biologia dos mamíferos 7. Este exemplo evidencia como a experimentação rápida em umeucarioto simples da linhagem verde pode acelerar a pesquisa em organismos mais complexos, gerando hipóteses testáveis ​​utilizando métodos tecnicamente viáveis ​​apenas neste fundo de menor complexidade. Conhecimento de um genoma ea possibilidade de modificar genes são ferramentas essenciais em qualquer espécie de modelo. Genomic 1, transcriptomic 8, 9 e informação Proteômica para esta espécie está livremente disponível, ao passo que os métodos anteriormente relatados 6,10 para transformar geneticamente Ostreococcus são conhecidos por poucos laboratórios em todo o mundo. Neste artigo, os métodos experimentais para transformar geneticamente este organismo novo modelo com uma sobre-expressão de construção através de electroporação são descritas em detalhe, bem como o método de inclusão de células transformadas em baixo percentagem de agarose para permitir a selecção de linhas transformadas provenientes de uma único transformado da célula. Após o sucesso da aplicação OstreocoCCUs para pesquisa circadiano, o interesse crescente em Ostreococcus pode ser esperado de diversas áreas de pesquisa dentro e fora das ciências vegetais, incluindo áreas biotecnológicas. Pesquisadores de uma ampla gama de ciências biológicas e médicas que trabalham em conservadas vias bioquímicas podem considerar a investigação prossegue em Ostreococcus, livre da complexidade genômica e organismal de espécies de maior porte do modelo.

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Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Este artigo descreve a transformação genética da alga marinha unicelular<em&gt; Ostreococcus tauri</em&gt; Por eletroporação. Este organismo eucariótico é uma plataforma de modelo eficaz para plantas superiores, possesing muito reduzida complexidade genômica e celular e de ser facilmente passíveis de ambos cultura de células e biologia química.

Transformação genômica do Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

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Biology

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

15.6K visualizações.  University of Edinburgh. Este artigo descreve a transformação genética da alga marinha unicelular Ostreococcus tauri Por eletroporação. Este organismo eucariótico é uma plataforma de modelo eficaz para plantas superiores, possesing muito reduzida complexidade genômica e celular e de ser facilmente passíveis de ambos cultura de células e biologia química.

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Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolamento de DNA genômico de Tails rato

Biologia

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Grandes Inserir Produção Ambiental Biblioteca Genômica

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Geração de RNA / DNA híbrido em DNA genômico por transformação por meio de RNA contendo Oligonucleotídeos

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1. Due to its capacity to undergo efficient mitotic homologous recombination, Physcomitrella patens has emerged as an important model system in recent years2. This capacity allows high frequencies of gene targeting3-9, which is not seen in other model plants such as Arabidopsis. To take full advantage of this system, we need an effective and easy method to deliver DNA into moss cells. The most common ways to transform this moss are particle bombardment10 and PEG-mediated DNA uptake11. Although particle bombardment can produce a high transformation efficiency12, gene guns are not readily available to many laboratories and the protocol is difficult to standardize. On the other hand, PEG mediated transformation does not require specialized equipments, and can be performed in any laboratory with a sterile hood. Here, we show a simple and highly efficient method for transformation of moss protoplasts. This method can generate more than 120 transient transformants per microgram of DNA, which is an improvement from the most efficient protocol previously reported13. Because of its simplicity, efficiency, and reproducibility, this method can be applied to projects requiring large number of transformants as well as for routine transformation.

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1.

Polietileno Glicol eficiente Transformação Mediada (PEG) do Moss Physcomitrella patens</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Genômica MRI - um recurso público para estudar os padrões de seqüência dentro de DNA genômico

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Matriz Hibridização Genômica Comparativa (Array CGH) para a detecção de Genomic copiar o número de variantes

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Targeted RNA Sequenciação Ensaio para Caracterizar expressão gênica e genômica Alterações

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Preparando e injetando embriões de mosquitos Culex para gerar mutações nulas usando CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...