SynthSys un Centro per Integrative Systems Biology e finanziato dalla BBSRC premio D019621 EPSRC. EU FP6 Network of Excellence borsa di studio &quot;Marine Genomics&quot; per Fyb ha finanziato lo sviluppo di metodi di trasformazione genetica.

1. Preparazione del materiale algale <ol><li> Ostreococcus cellule sono coltivate in acqua di mare artificiale (ASW). Sali marini (tipicamente circa 40 grammi per litro) vengono sciolti in acqua deionizzata ad una salinità di 30 ppt, come misurato utilizzando un misuratore salinità. Terreno di arricchimento 11,12, elementi metallici oligoelementi e le vitamine sono aggiunti, come descritto nelle tabelle 1-3. I mezzi di comunicazione è quindi sterilizzata con filtro attraverso un filtro di 0,22 micron. </li><li> Per la manutenzione, le cellule del ceppo Ostreococcus OTTH95 sono sub-colta in modo asettico ad una diluizione di 1/100 in fresco ASW ogni 7 giorni e cresciuto sotto la luce costante in un incubatore di crescita delle piante dotate di filtro blu chiaro di luna. L&#39;intensità della luce deve essere vicino a 20 pmol m -2 s -1 e la temperatura viene mantenuta a 20 ° C. Le cellule non richiedono agitazione costante, ma vengono agitate ogni 2 o 3 giorni per prevenire l&#39;aggregazione. </li><li> Per ogni trasformazione, 50 ml di cellule sono richiesti in una cella density di 20-30 x 10 6 ml -1, che dovrebbe essere raggiunto 5-7 giorni a seguito di sub-coltura. Densità approssimativa delle cellule e axeny può essere determinata utilizzando la citometria a flusso o un emocitometro ad un minimo di ingrandimento x40. </li></ol> 2. Elettroporazione <ol><li> Preparare DNA per la trasformazione. Per ogni trasformazione, 5 pg di pura, DNA plasmidico linearizzato è richiesto ad una concentrazione di 1 pg / pl in acqua deionizzata sterile. Per ottenere questo DNA, gli autori raccomandano utilizzando un kit Qiagen midi preparazione, anche se altri metodi potrebbe funzionare ugualmente bene. Digerire il prodotto con un enzima che taglia nella spina dorsale del vettore utilizzato, ma non nel transgene o gene di selezione. Ulteriori purificare e concentrare il DNA lineare risultante dalla precipitazione con etanolo, e risospendere il prodotto in volume appropriato di alta qualità acqua sterile deionizzata. </li><li> Preparare le provette per microcentrifuga DNA contenenti 5 mg per ogni trasformazione. A Control senza DNA è necessaria per ciascuna linea cellulare da trasformare. Conservare le provette su ghiaccio, unitamente ad una cuvetta elettroporazione 2 mm per ogni trasformazione. </li><li> Preparare 2,2 ml di tampone risospensione per la trasformazione. Sciogliere Sorbitolo di una soluzione 1 M in ddh 2 O, aggiungere 0,1% acido Pluronic F68 e filtro-sterilizzare. </li><li> Aggiungere acido Pluronic F68, ad una concentrazione finale di 0,1% per le cellule, e pellet per 10 minuti a 8000X g a 10 ° C in una provetta da 50 ml con fondo conico. Immediatamente risospendere le cellule in 1 ml di tampone di risospensione pipettando su e giù, e trasferire una provetta da microcentrifuga. Centrifugare per 10 minuti a 8000 xg a 10 ° C, e lavorare velocemente, ripetere questo passaggio di lavaggio ancora una volta. </li><li> Con una punta di taglio, risospendere ogni finale pellet in 40 microlitri di buffer di risospensione. Aggiungere 40 microlitri delle cellule risospese ad ogni tubo di DNA linearizzato su ghiaccio, mescolare delicatamente e trasferire nella cuvetta elettroporazione. </li><li> Mettere la cuvetta nel electroporazione macchina. Modificare le impostazioni a 6 kV cm -1, 600 Ω, e 25 uF. Elettroporare le cellule. </li><li> Incubare le cellule electoporated nelle cuvette a temperatura ambiente per 10 minuti, e usare questo tempo per preparare le fiasche di coltura di tessuto. Etichettare e aggiungere 30 ml di fresco ASW a ciascuno. Prendere 1 ml da ogni pallone e delicatamente aggiungere alla cuvetta corrispondente. Incubare per 2 minuti e rimuovere delicatamente il ASW, che ora contiene il globulo di cellule e delicatezza pipettare direttamente nel ASW nel pallone cultura. </li><li> Le cellule rimangono tipicamente in un globulo. Fare attenzione a non scuotere o disturbare le cellule aggregate in questo momento. Consentire alle cellule di recuperare in incubatrice per 1-2 ore, poi risospendere agitando le staffe. A questo punto, le cellule devono Risospendere liberamente e senza grumi dovrebbero essere visibili. Lasciare le culture per recuperare durante la notte in incubatrice. </li></ol> 3. Inclusione di Celle Piastre in terreno semisolido <ol><li&gt; Il giorno successivo, in autoclave una soluzione di 2,1% agarosio a basso punto di fusione in ddh 2 O in una bottiglia contenente una bacchetta. Mantenere fuso a 65-90 ° C in un becker contenente acqua maggiore su un agitatore magnetico riscaldamento. Per ogni trasformazione preparare 8 Petri (55 mm di diametro) e 8 x 15 ml ciascuna provette contenenti 9 ml di ASW e la selezione desiderata. Se si utilizza Nourseothricin o G418, usare 2 mg / ml. </li><li> Raccogliere le cellule trasformate dal termostato. Lavorando in uno flowhood sterile, aggiungere 1 ml di agarosio LMP bollente al ml 9 in uno dei tubi. Chiudere la provetta, e mescolare per inversione. Poi aggiungere 0,5 ml di cellule appena trasformate, mescolare velocemente e versare nel piatto. Ripetere questa operazione con i restanti 7 tubi e quindi procedere al pallone trasformazione successiva. </li><li> Lasciare le piastre aprono nella cappa a flusso per un&#39;ora, per l&#39;agarosio per impostare. Quindi chiudere le piastre e trasferirli ai grandi piatti quadrati Petri, che terrà la 4 piatti ciascuno. Sigillare l&#39;arguzia piazza piastreh parafilm. Si noti che le piastre non si imposta completamente, e come risultato, il gel è molto fragile. Si deve prestare attenzione a non rompere il gel durante la manipolazione delle lastre. Mettere tutti i piatti quadrati in incubatrice. </li></ol> 4. Selezione delle colonie trasformate <ol><li> Le colonie dovrebbe apparire dopo 10 a 21 giorni sulle piastre di trasformazione, ma non sui piatti finti trasformati. Per scegliere le colonie usare una pipetta 200 ml con cut-off suggerimenti. Basta selezionare le colonie libere e succhiare la colonia verde. Fare attenzione a non includere le cellule delle colonie vicine. </li><li> Trasferire le cellule a 2 ml di terreno liquido contenente la selezione, in una piastra a 24 pozzetti. Quando si utilizza Nourseothricin, utilizzare 1,75 mg / ml. Mescolare pipettando su e giù. Selezionare 24-50 colonie per la trasformazione. Sigillare le piastre con parafilm e trasferimento in incubatrice. </li><li> Dopo una settimana, trasferire 100 ul di ciascun pozzetto a 2 ml fresco ASW con selezione in una piastra a 24 pozzetti e crescere per un additional 7 giorni. Linee cellulari sopravvissuti può essere utilizzato per ulteriori studi. Integrazione stabile nel numero genoma e l&#39;inserimento devono essere analizzati mediante PCR e Southern Blot. Il DNA genomico può essere ottenuta per tali scopi utilizzando qualsiasi down-scala metodo standard per l&#39;estrazione del DNA vegetale. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Dividi celle 1/100 ha raggiunto una densità di 25 milioni di cellule per millilitro dopo essere cresciuto per 7 giorni. Elettroporazione delle cellule con le impostazioni appropriate comportato una costante di tempo tra 10 e 14 millisecondi. Quando le cellule sono trasferito su un supporto in fiasche di coltura, una pallina di cellule dovrebbero formare. Quando viene leggermente scosso dopo un&#39;ora, le cellule dovrebbero facilmente riportare in sospensione. L&#39;inclusione di 1 ml cellule trasformate in agar LMP 0,2% dovrebbe comportare in maniera coerente, ma solo semi-solido gel. Le colonie dovrebbe apparire dopo 10 a 21 giorni. Quando trasformando 5 pg di DNA linearizzato usando il protocollo sopra, 50-100 colonie per trasformazionepiastra sono state generalmente previsto, contro nessuno sulle piastre di controllo negativo. ~ 80% delle colonie sono state raccolte selezionate positivamente dalla resistenza agli antibiotici in terreno liquido e sono stati usati in studi successivi. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Concentrazione finale </td><td> Soluzione madre </td><td> Volume per 1 litro </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td> 8,83 x 10 -4 M </td><td> 75 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> 3,63 x 10 -5 M </td><td> 2,68 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> β-glicerofosfato </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td> 2,16 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> H 2 SeO 3 </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 1,29 mg / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> Tris-base (pH 7,2) </td><td> 1 x 10 -3 M </td><td> 121,1 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> K metalli in tracce soluzione </td><td></td><td> Tabella 2 </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> f / 2 una soluzione di vitamine </td><td></td><td> Tabella 3 </td><td> 0,5 mL </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Componenti medi per la crescita di O. Tauri 11, 12. Portare un volume totale di 1 litro di acqua di mare artificiale a una salinità di 30 ppt, e aggiungere i componenti di cui sopra da soluzioni madre come indicato. Filtro-sterilizzare il terreno e l&#39;uso entro una settimana. Gli stock di tutti i composti tranne la soluzione vitamina può essere mescolati per aggiungere 6 ml di questa soluzione per ogni litro di terreno. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Concentrazione finale </td><td> Soluzione madre </td><td> Importo per 1 litro </td></tr><tr><td> Na 2 </sub&gt; EDTA • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 M -4 </td><td></td><td> 41,6 g </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td></td><td> 3,15 g </td></tr><tr><td> Na 2 Moo 4 • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 6,3 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td> 1 M x 10 -9 </td><td> 22,0 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> • CoCl 2 6H 2 O </td><td> 1 M x 10 -9 </td><td> 10,0 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 180,0 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 9,8 g / L dH <sub&gt; 2 O </td><td> 1 mL </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Tracciare una soluzione in metallo 11,12. Portare ad un totale di 1 litro, in dH 2 O, e il calore per sciogliere. Aliquotare la soluzione per lo stoccaggio e congelamento. Le concentrazioni finali indicati si riferiscono al mezzo finale, non la soluzione dei metalli in tracce. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Concentrazione finale </td><td> Soluzione madre </td><td> Importo per 1 litro </td></tr><tr><td> La vitamina B 12 </td><td> 1 x 10 -10 M </td><td> 1 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> Biotina </td><td> 1 M x 10 -9 </td><td> 0,1 g / L dH 2 O </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> • Tiamina HCl </td><td> 1 x 10 -7 M </td><td></td><td> 200 mg </td></tr></tbody></table> Tabella 3. f / 2vitamina soluzione 11. portare a un totale di 1 litro in dH 2 O, filtro-sterilizzare, aliquotare e congelare. Le concentrazioni finali indicati si riferiscono al mezzo finale, non la soluzione di vitamine. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> Figura 1. Visione grafica della procedura di trasformazione. Rappresentazione schematica della procedura per trasformare geneticamente Ostreococcus tauri mediante elettroporazione. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> Figura 2. Crescita delle cellule della Cultura. Sono sub-colta in modo asettico ad una diluizione di 1/100 in fresco ASW ogni 7 giorni e cresciuto sotto la luce costante in un incubatore di crescita delle piante dotate di filtro blu chiaro di luna. L&#39;intensità della luce deve essere vicino a 20 pmol m -2 s -1 e la temperatura viene mantenuta a 20 ° C Le cellule non richiedono agitazione costante, ma sono shaken ogni 2 o 3 giorni per prevenire l&#39;aggregazione. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> Figura 3. Formazione di colonie sul 0,2% di agarosio LMP. Transfer 4 piastre per un grande piatto quadrato Petri, e sigillare con parafilm (in alto a sinistra). Quando le colonie si sono formate, è sufficiente selezionare liberi (idealmente forma conica) colonie (in alto a destra) e succhiare fuori della piastra con una pipetta P200. Non ci dovrebbero essere le colonie per i controlli negativi (in basso a destra).

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Cellular axeny stato e la cultura è di cruciale importanza per la procedura di trasformazione. Sebbene le celle sono generalmente mantenute in cicli di 12 ore di luce, 12 ore buio, l&#39;efficienza della trasformazione in cellule coltivate in queste condizioni sono risultate insufficienti. Durante i ripetuti pellettatura / risospensione passi, le celle devono sempre risospendere facilmente. Se aggregato cellule, o una sostanza simile a muco è presente, è meglio per iniziare la procedura dall&#39;inizio di nuovo. Tipicamente, ~ 50 colonie può essere previsto su ciascuna piastra di trasformazione, rispetto nessuno sulla piastra di controllo negativo. In caso di scarsa efficienza di trasformazione, condizioni di coltura deve essere variato per garantire cellule sono nello stato ottimale. Le variabili che influenzano l&#39;efficienza della trasformazione includono la temperatura ambiente in laboratorio (dovrebbe essere prossima ai 20 ° C) e velocità di movimentazione (Procedura di pellet cellule [2,3] per il recupero [2.7] dovrebbe prendere ~ 1 ora). È altresì importante che tutte le soluzioni are preparato fresco prima di ogni trasformazione. Per l&#39;inclusione in piastre, la concentrazione di agarosio LMP è cruciale. Cellule Ostreococcus non crescerà in concentrazioni elevate di agarosio, e si diffonderà in basse concentrazioni. Tre vettori di trasformazione per Ostreococcus sono stati pubblicati in precedenza 6, e più vettori dovrebbero essere generato e pubblicato a breve. Il vettore esistente Pot-Luc 6 permette l&#39;utilizzo di un promotore di scelta in combinazione con un C-terminale tag lucciola, luciferasi permettendo la selezione della linea più veloce, più modelli di espressione transgenica trattabili, mentre il vettore Potox 6 porta la forte promotore inducibile 13 ricavati dal Ostreococcus alta affinità fosfato Transporter (HAPT) gene per la sovraespressione del gene di interesse. Il Potox-Luc vettore deriva da Potox, portando un marcatore addizionale luciferasi che può essere utilizzato per la selezione indiretta di linee sovraespressione <sup&gt; 14. Marcatori di selezione di successo su questi vettori sono Nourseothricin e G148. Tuttavia, le cellule Ostreococcus sono altamente resistenti a molti antibiotici, e le concentrazioni dei composti necessari per la selezione di cellule transgeniche Ostreococcus è più elevato che per sistemi modello convenzionale (2 mg / ml). Sebbene il processo risulta inefficiente, il numero di cellule e il DNA plasmide necessari per questa procedura non pone alcun ostacolo significativo. Una limitazione è più grande che ogni riga generato che è resistente al marcatore selezionabile deve essere analizzato singolarmente per verificare che l&#39;intero costrutto viene integrato nel DNA. Abbiamo osservato esempi in cui espressione riuscita del marcatore selezionabile non corrispondono all&#39;inserimento del gene di interesse effettivo; integrazioni cioè parziali possono verificarsi. Evidentemente, inserimento casuale nel genoma significa anche che non vi è alcun controllo del sito di inserimento utilizzando questo metodo, e metodi bulla base ricombinazione omologa sono attualmente in fase di sviluppo. Tuttavia, il metodo qui descritto è, a nostra conoscenza, attualmente l&#39;unico metodo caratterizzato per generare cellule Ostreococcus geneticamente modificate. Come Ostreococcus tauri solo recentemente è stata utilizzata come organismo modello sperimentale, la maggior parte dei metodi di lavoro con queste cellule è probabile evolversi ed essere perfezionato dalla comunità di ricerca sempre più coinvolta. Questo protocollo ha lo scopo di aiutare le persone con Ostreococcus avviare i lavori, ma in nessun modo pretende di descrivere tutto quello che c&#39;è da sapere su genomica trasformazione di questa microalga. La fiducia gli autori che i lettori saranno in grado di adattare questo protocollo per le proprie esigenze, come piccole differenze di incubatori (livelli di luce o la qualità) e di altri parametri esistono e probabilmente devono essere ottimizzati in ogni singolo laboratorio per ottenere le culture sane necessari per questo protocollo. Dopo aver imparato le tecniche descritte qui,vettori possono essere costruiti per generare luminescente, fluorescenti, o altre linee di fusione etichetta sotto il controllo di una serie di promotori. Questo entusiasmante piattaforma sperimentale romanzo sarà utile per studiare come biochimici complessi problemi sono risolti in un eucariote di complessità ridotta, in cui approcci farmacologici sono molto facilitati 3.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Costituenti del terreno </td></tr><tr><td> Chimico </td><td colspan="2" > Numero di catalogo </td><td> Fornitore </td></tr><tr><td> Immediata Ocean Marine Salt </td><td colspan="3"> da <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> o <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td colspan="2"> S5506-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td colspan="2"> A9434-500G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Glicerolo 2-fosfato sale disodico idrato </td><td colspan="2"> G9422-100G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> H 2 SeO 3 </td><td colspan="2"> 84920-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ultra puro tris </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> EDTA • Na 2 2H 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500G </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 157740 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Na 2 Moo 4 • 2H 2 O </td><td colspan="2"> 31439-100G-R </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> • CoCl 2 6H 2 O </td><td colspan="2"> 31277 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td colspan="2"> 203734-5G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> La vitamina B 12 (cianocobalamina) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Biotina </td><td colspan="2"> 47868 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> • Tiamina HCl </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td colspan="2"> A9518-25G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Neomicina </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Kanamicina </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td colspan="4"> Materiali di consumo per la coltura </td></tr><tr><td colspan="2"> Voce </td><td> Numero di catalogo </td><td> Fornitore </td></tr><tr><td colspan="2"> Tissue Culture Flask T25 colture in sospensione ventilato con Versare Canale </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Tissue Culture Flask T75 colture in sospensione ventilato con Versare Canale </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Tissue Culture Flask T175 colture in sospensione ventilato con Versare Canale </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP bottiglie filtri top, 1L, completi </td><td> 99950T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> Filtri bottiglie TPP top, 500ml, </td><td> 99500T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP bottiglie filtri migliori, 250ml, </td><td> 99250T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP bottiglie filtri top, 150ml, </td><td> 99150T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> Misuratore di salinità per il Marine Aquarium </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="3" > Prodotti chimici per la trasformazione </td></tr><tr><td> Chimico </td><td> Catalogonumero </td><td> Fornitore </td></tr><tr><td> D-Sorbitolo </td><td> S6021-1KG </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Pluronic F-68 soluzione </td><td> P5556-100ML </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51000 </td><td> Werner </td></tr><tr><td> Basso punto di fusione di agarosio </td><td> 16520-050 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td colspan="3"> Materiali di consumo per la trasformazione </td></tr><tr><td> Voce </td><td> Numero di catalogo </td><td> Fornitore </td></tr><tr><td> Tissue Culture Flask T25 colture in sospensione ventilato con Versare Canale </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Tissue Culture Flask T75 colture in sospensione ventilato con Versare Canale </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Cultura Flask Tissue T175 Sospensione Cultures ventilato con Versare Canale </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Greiner provette da 50 ml </td><td> 227261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td> Gene Pulser / MicroPulser cuvette da 0,2 cm, 50 gap </td><td> 165-2086 </td><td> Bio-Rad </td></tr><tr><td> Petri piatto tondo PS 3 VENTS H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR International </td></tr><tr><td> Petri quadrata con quattro prese d&#39;aria sterile in polistirolo da 120 millimetri irradiazione chiara </td><td> FB51788 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Moonlight filtrano la luce blu </td><td> 183 </td><td> Lee Lighting </td></tr></tbody></table>

genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri

I problemi più comuni che ostacolano rapidi progressi in Scienze della pianta includono cellulare, tissutale e la complessità intero organismo, e in particolare l&#39;alto livello di ridondanza genomica genetica che colpisce semplici piante superiori. Il nuovo modello di organismo Ostreococcus Tauri è il più piccolo a vita libera eucariote conosciuta fino ad oggi, e possiede una dimensione del genoma molto ridotto e 1,2 la complessità cellulare, si manifesta con la presenza di solo uno dei molti organelli (mitocondri, cloroplasti, pila del Golgi) per cella, e un genoma contenente soltanto ~ 8000 geni. Inoltre, la combinazione di unicellulari e della cultura semplice fornisce una piattaforma suscettibile di approcci di biologia chimica. Recentemente, Ostreococcus è stato impiegato con successo per studiare i meccanismi fondamentali alla base di indicazione dell&#39;ora circadiano 3-6. I risultati di questo organismo modello hanno avuto un impatto non solo la scienza delle piante, ma anche la biologia dei mammiferi 7. Questo esempio mette in luce come una rapida sperimentazione in uneucariote semplice dal lignaggio verde può accelerare la ricerca in organismi più complessi, generando ipotesi verificabili con metodi tecnicamente fattibile solo in questo contesto di complessità ridotta. La conoscenza del genoma e la possibilità di modificare i geni sono strumenti essenziali nelle varie specie di modello. Genomic 1, 8 trascrittomica, proteomica e 9 le informazioni per questa specie è liberamente disponibile, mentre i metodi precedentemente segnalati 6,10 per trasformare geneticamente Ostreococcus sono noti a pochi laboratori in tutto il mondo. In questo articolo, i metodi sperimentali per trasformare geneticamente questo nuovo organismo modello con una sovraespressione costruire mediante elettroporazione è descritta in dettaglio, come pure il metodo di inserimento di cellule trasformate in percentuale agarosio bassa per consentire la selezione delle linee trasformate proveniente da un singola cellula trasformata. Dopo il successo dell&#39;applicazione OstreocoCCU alla ricerca circadiano, l&#39;interesse crescente Ostreococcus si può aspettare da aree di ricerca diverse all&#39;interno e all&#39;esterno delle scienze vegetali, comprese le zone biotecnologiche. I ricercatori provenienti da una vasta gamma di scienze biologiche e mediche che lavorano su conservate vie biochimiche può prendere in considerazione la ricerca perseguendo in Ostreococcus, senza la complessità genomica e organismal di specie modello più grande.

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Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Questo articolo descrive la trasformazione genetica della marina alga unicellulare<em&gt; Ostreococcus Tauri</em&gt; Mediante elettroporazione. Questo organismo eucariotico è una piattaforma modello efficace per le piante superiori, possesing notevolmente ridotto la complessità genomica e cellulare ed essere facilmente suscettibili di sia la cultura della biologia cellulare e chimica.

Trasformazione genomica del Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus Tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

15.6K Views.  University of Edinburgh. Questo articolo descrive la trasformazione genetica della marina alga unicellulare Ostreococcus Tauri Mediante elettroporazione. Questo organismo eucariotico è una piattaforma modello efficace per le piante superiori, possesing notevolmente ridotto la complessità genomica e cellulare ed essere facilmente suscettibili di sia la cultura della biologia cellulare e chimica.

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Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolamento del DNA genomico da Tails mouse

Ricerca

Biologia

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Inserire grande Ambientale Genomic Produzione Biblioteca

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Generazione di DNA / RNA ibrido nel DNA genomico da trasformazione utilizzando RNA contenenti oligonucleotidi

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1. Due to its capacity to undergo efficient mitotic homologous recombination, Physcomitrella patens has emerged as an important model system in recent years2. This capacity allows high frequencies of gene targeting3-9, which is not seen in other model plants such as Arabidopsis. To take full advantage of this system, we need an effective and easy method to deliver DNA into moss cells. The most common ways to transform this moss are particle bombardment10 and PEG-mediated DNA uptake11. Although particle bombardment can produce a high transformation efficiency12, gene guns are not readily available to many laboratories and the protocol is difficult to standardize. On the other hand, PEG mediated transformation does not require specialized equipments, and can be performed in any laboratory with a sterile hood. Here, we show a simple and highly efficient method for transformation of moss protoplasts. This method can generate more than 120 transient transformants per microgram of DNA, which is an improvement from the most efficient protocol previously reported13. Because of its simplicity, efficiency, and reproducibility, this method can be applied to projects requiring large number of transformants as well as for routine transformation.

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1.

Efficiente polietilene glicole (PEG) Trasformazione mediata della Moss Physcomitrella patene</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Genomica risonanza magnetica - una risorsa pubblica per lo Studio Patterns sequenza all&#39;interno del DNA genomico

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Cattura selettiva di 5 hydroxymethylcytosine dal DNA genomico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Array Comparative Genomic Hybridization (CGH Array) per il rilevamento di Genomic Copy Number Varianti

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Mirati RNA Sequencing test per caratterizzare espressione genica e genomica Alterazioni

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Preparazione e iniezione di embrioni di zanzare Culex per generare mutazioni nulle utilizzando CRISPR / Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...