BBSRC ve EPSRC ödül D019621 tarafından finanse Bütünleştirici Sistem Biyolojisi için Merkezi SynthSys. FYB için Mükemmellik &quot;Deniz Genomics&quot; hibe AB 6. ÇP Ağ genetik transformasyon yöntemlerinin geliştirilmesi finanse etmiştir.

1. Alg Malzeme Hazırlanması <ol><li> Ostreococcus hücrelerin yapay deniz suyu (ABY) kültürlenmiştir. Deniz tuzları (litre başına tipik olarak yaklaşık 40 gram) 30 bir tuz için deiyonize su içinde çözülür, ppt gibi bir tuz sayacı kullanılarak ölçüldü. 1-3 Tablolarda tarif edildiği gibi Zenginleştirme orta 11,12, eser elementler metal ve vitaminler eklenir. Ortam 0.22 um bir filtreden daha sonra filtre ile sterilize edilmiş olup. </li><li> Bakım için Ostreococcus gerginlik OTTH95 hücreleri taze ASW her 7 günde 1/100 dilusyondaki aseptik alt-kültür ve Ayışığı Mavi filtre takılmış bir bitki büyüme inkübatörde sabit ışık altında yetiştirilen. Işık yoğunluğu yaklaşık 20 mmol m -2 s -1 olmalıdır ve sıcaklık 20 ° C&#39;de muhafaza edilir Hücreler sürekli ajitasyon gerekmez, ancak her 2 ila 3 gün agregasyonunu önlemek için bir kez çalkalanır. </li><li> Her bir dönüşüm için, hücreler 50 ml de bir hücre gerekmektediralt-kültür takiben 5-7 gün elde edilmelidir 20-30 x 10 6 ml -1, bir nsity. Yaklaşık hücre yoğunluğu ve axeny x40 büyütme en az akış sitometrisi ya da bir ya haemocytometer kullanılarak belirlenebilir. </li></ol> 2. Elektroporasyon <ol><li> Dönüşümü için DNA hazırlamak. Her bir dönüşüm için, saf, linearised plazmid DNA 5 ug steril deiyonize su içinde 1 mg / ml arasında derişimde gereklidir. Diğer yöntemler işe eşit derecede iyi olabilir ama bu DNA elde etmek için, yazarlar, Qiagen midi hazırlık kiti kullanmanızı öneririz. Bir kullanılan vektörün omurgasında kesen bir enzimi, ancak transgen ya da seçim geni olan ürünün sindirilmesi. Daha da saflaştırmak ve etanol çökeltme ile sonuçta elde edilen DNA doğrusal konsantre ve yüksek kaliteli bir steril deiyonize su uygun hacimde yeniden süspanse ürünü. </li><li> Her bir dönüşüm için 5 ug DNA içeren tüpler mikrosantrifüj hazırlayın. Bir controHer bir hücre dizisi transforme edilmesi için bir DNA ile l gereklidir. Her bir dönüşüm için bir küvet 2 mm elektroporasyon ile birlikte, buz üzerinde bu tüplerin tutmak. </li><li> Dönüşüm başına tabanda tamponu 2.2 ml hazırlayın. GKD 2 O içinde 1 M çözüm Sorbitol eritilir,% 0.1 Pluronic asit F68 ve filtre-sterilize ekleyin. </li><li> Konik alt ile bir 50 ml nihai bir tüp içinde hücreleri% 0.1 &#39;lik konsantrasyonu, 10 ve at 8000X g&#39;de 10 dakika boyunca granül bunların ° C ila Pluronic F68 asit, ekleyin. Hemen yukarı veya aşağı doğru pipet ile tarafından yeniden süspanse tampon 1 ml içinde tekrar süspansiyon hücreleri, ve bir mikrofüj tüpe transfer. 10 ° C&#39;de 8000 xg&#39;de 10 dakika aşağı doğru döndürün ve hızlı şekilde çalışma, bir kez daha bu yıkama adımı tekrarlayın. </li><li> Bir kesim ucu ile yeniden süspanse tampon 40 ul her son pelletini. Buz üzerinde linearised DNA&#39;nın her tüpüne süspanse hücreler 40 ul ekleyin, hafifçe karıştırın ve elektroporasyon küvetine transfer. </li><li> Electrop de küvet koyunnutuk makinesi. 6 kV cm -1, 600 Ω ve 25 uF için ayarlarını değiştirin. Hücreleri Electroporate. </li><li> 10 dakika için oda sıcaklığında küvet içinde electoporated hücreleri inkübe ve doku kültür şişeleri hazırlamak için olduğu zaman kullanılır. Onları etiketlemek ve her taze ASW 30 ml ekleyin. Her balona 1 ml çıkarın ve yavaşça ilgili küvet ekleyin. 2 dakika inkübe ve yavaşça ASW kaldırmak, şimdi yavaşça hücrelerin damlası içeren ve yavaş yavaş kültür şişelerinde ASW doğrudan Pipeti. </li><li> Hücreler genellikle bir damlası kalır. Bu anda toplu hücreler sallamayın veya rahatsız dikkat edin. Hücreleri 1-2 saat inkübatörde kurtarmak için izin ver, sonra şişeleri sallayarak tekrar süspansiyon. Bu zamanda, hücre serbestçe tekrar süspansiyon olmalıdır ve hiçbir topaklar görülmelidir. Inkübatörde gecede kurtarmak için kültürleri bırakın. </li></ol> 3. Yarı-katı Ortamda Tabaklar Hücreler dahil edilmesi <ol><li&gt; Ertesi gün, bir karıştırma çubuğu içeren bir şişe içinde GKD 2 O% 2.1 düşük erime noktası agaroz çözeltisi otoklavlama. Bir ısıtma altmda manyetik bir karıştırıcı su içeren bir cam kapta daha 65-90 ° C sıcaklıkta erimiş tutmak. Her dönüşüm için 9 ASW ml artı gerekli seçimi içeren 8 Petri (55 mm çap) ve 8 x 15 ml tüpler her hazırlamak. Nourseothricin veya G418 kullanıyorsanız, 2 mg / ml kullanın. </li><li> Kuluçka gelen dönüştürülmüş hücreler toplanır. Steril bir flowhood çalışan, tüplerin birinde 9 ml kaynar LMP agaroz 1 ml ilave edilir. Tüp kapatılır ve alt üst edilerek karıştırılır. Sonra, taze transforme hücreler 0.5 ml eklemek hızlı karıştırın ve plaka içine dökün. Kalan 7 tüpleri ile bu işlemi yineleyin ve ardından sonraki dönüşüm şişesi geçin. </li><li> Agaroz ayarlamak için tabak, bir saat boyunca akış kaputu açık bırakın. Sonra tabak kapatın ve 4 plakaları her tutacak büyük kare Petri, aktarabilirsiniz. Kare plakalar zekâ Sealh parafilm. Plakalar tamamen ayarlanır unutmayın, ve sonuç olarak, jel çok hassastır. Bakım tabak tutarken jel kırmamaya dikkat edilmelidir. Inkübatör tüm kare tabak yerleştirin. </li></ol> 4. Dönüştürülmüş Kolonileri Seçimi <ol><li> Koloniler dönüşüm plakaları 10 ila 21 gün sonra, ancak davalarını dönüştürdü plakalar üzerinde görünmelidir. Koloniler kesme ipuçları ile 200 ul pipet kullanmak toparlamak için. Sadece ücretsiz koloniler seçin ve yeşil koloni berbat. Komşu kolonilerden herhangi bir hücre dahil etmemeye dikkat edin. </li><li> Bir 24 kuyu plaka, seçimi ihtiva eden sıvı bir ortam, 2 ml kadar hücreleri transfer edin. Nourseothricin kullanıldığı zaman, 1.75 mg / ml kullanabilir. Aşağı pipetleme tarafından karıştırın. Dönüşüm başına 24-50 koloniler seçin. Parafilm ve inkübatör için transfer yüzeyleri. </li><li> Bir hafta sonra, 24 kuyu plaka seçimi ile 2 ml taze ASW her iyi 100 ul aktarmak ve bir additiona için büyümekl 7 gün. Hayatta kalan hücre çizgileri başka çalışmalar için kullanılabilir. Genomu ve ekleme numarasına Kararlı entegrasyon PCR ve Southern Blot kullanılarak analiz edilmelidir. Genomik DNA bitki DNA ekstraksiyonu için herhangi bir yere ölçekli standart metot kullanılarak bu amaçlar için elde edilebilir. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Hücreler 1/100 7 gün boyunca gelişen sonra, mililitrede 25 milyon hücrelik bir yoğunlukta ulaşmıştır bölünür. Ayarları uygun olan hücrelerin elektroporasyon bir zaman sabiti 10 ila 14 milisaniye ile sonuçlanmıştır. Hücrelerinin kültür şişeleri içinde orta aktarıldığında, hücrelerin bir damlası oluşturması gerekir. Hafif bir saat sonra çalkalandı zaman, hücrelerin kolaylıkla tekrar süspansiyon gerekir. % 0.2 LMP agar içine 1 ml transforme hücreler dahil edilmesi tutarlı ama sadece yarı katı jel neden. Kolonileri 10 ile 21 gün sonra görünmelidir. dönüşüm başına yukarıda protokolünü kullanarak linearised DNA 5 mikrogram dönüştüren, 50-100 kolonilerplaka genellikle negatif kontrol plakalar üzerinde hiçbir karşılık, bekleniyordu. ~ Seçilmiş kolonilerin% 80 pozitif sıvı ortam içinde antibiyotik direnci ile seçilmiştir ve müteakip çalışmalarda kullanılan edildi. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Nihai konsantrasyon </td><td> Stok çözelti </td><td> 1 litre için Hacmi </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td> 8.83 x 10 -4 M </td><td> 75 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> NH4CI </td><td> 3.63 x 10 -5 M </td><td> 2.68 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> β-gliserofosfat </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td> 2.16 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> H 2 SeO 3 </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 1.29 mg / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> Tris-bazlı (pH 7.2) </td><td> 1 x 10 -3 M </td><td> 121.1 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> K eser metal çözüm </td><td></td><td> Tablo 2 </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> f / 2 vitamini çözüm </td><td></td><td> Tablo 3 </td><td> 0,5 mL </td></tr></tbody></table> Tablo 1. O. büyüme için Orta bileşenlerin tauri 11, 12. 30 ppt tuzluluk bir yapay deniz suyu 1 litre toplam hacmi Makyaj ve belirtildiği gibi stok solüsyonlar yukarıda bileşenlerini ekleyin. Bir hafta içinde orta ve kullanım Filter-sterilize edin. Vitamin çözeltisi dışında bütün bileşiklerin stokları orta her bir litre için bu çözelti 6 ml eklemek için havuzlanmış edilebilir. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Nihai konsantrasyon </td><td> Stok çözelti </td><td> 1 litre için Tutarı </td></tr><tr><td> Na 2 </sub&gt; EDTA • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -4 M </td><td></td><td> 41.6 g </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td></td><td> 3.15 g </td></tr><tr><td> Na 2 Moo 4 • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 6.3 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 22.0 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 10.0 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 180.0 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 9.8 g / L dH <sub&gt; 2 O </td><td> 1 mL </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Metal çözüm 11,12 çiziniz. Bir dH 2 O 1 litre toplam, ve çözülmekte ısı kadar olun. Depolama için tablet çözümü ve dondurma. Final konsantrasyonları son ortamı değil, eser metal çözümü için verilmiştir. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Nihai konsantrasyon </td><td> Stok çözelti </td><td> 1 litre için Tutarı </td></tr><tr><td> Vitamin B 12 </td><td> 1 x 10 -10 M </td><td> 1 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> Biotin </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 0.1 g / L dH 2 O </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> Tiamin • HCl </td><td> 1 x 10 -7 M </td><td></td><td> 200 mg </td></tr></tbody></table> Tablo 3. f / 2Vitamin çözümü 11. dH 2 O, filtre sterilize, tablet ve dondurucuda 1 litre toplam Makyaj. Nihai konsantrasyonlar nihai orta değil, vitamin çözeltisi için verilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> Şekil 1.. Dönüşüm işlemi grafiksel bakış. Genetik elektroporasyonla Ostreococcus tauri dönüştürme işlemi şematik gösterimi. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> Şekil 2. Kültür büyüme. Hücreler taze ASW 1/100 dilüsyon her 7 günde aseptik alt-kültür ve Ayışığı Mavi filtre takılmış bir bitki büyüme inkübatörde sabit ışık altında yetiştirilen. Işık yoğunluğu yaklaşık 20 mmol m -2 s -1 ° C Hücreler sürekli ajitasyon gerekmez 20 tutulur, ama s, gerekenagregasyonunu önlemek için her 2 ila 3 günde bir Haken. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> Şekil 3. % 0.2 LMP agaroz koloni oluşumu. Büyük bir kare Petri Transfer 4 plaka ve parafilm (sol üst) ile mühür. Koloniler oluşturdular zaman, sadece ücretsiz (ideal konik biçimli) koloniler (sağ üstte) seçin ve bir P200 pipetle plaka onları emmek. Negatif kontrol (sağ alt) üzerinde koloniler olmamalıdır.

<ol>
	<li>Derelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+analysis+of+the+smallest+free-living+eukaryote+Ostreococcus+tauri+unveils+many+unique+features.">Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).</li><li>Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+ultrastructure+of+O.+tauri:+electron+cryotomography+of+an+entire+eukaryotic+cell.">3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell.</a> PLoS One. 2, e749 (2007).</li><li>O'Neill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+persist+without+transcription+in+a+eukaryote.">Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote.</a> Nature. 469, 554-558 (2011).</li><li>van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+function+is+required+for+biological+timing+throughout+the+twenty-four+hour+cycle.">Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle.</a> Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).</li><li>Troein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+light+inputs+to+a+simple+clock+circuit+allow+complex+biological+rhythms.">Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms.</a> Plant. J. 66, 375-385 (2011).</li><li>Corellou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clocks+in+the+green+lineage:+comparative+functional+analysis+of+the+circadian+architecture+of+the+picoeukaryote+ostreococcus.">Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus.</a> Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).</li><li>O'Neill, J. S., Reddy, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clocks+in+human+red+blood+cells.">Circadian clocks in human red blood cells.</a> Nature. 469, 498-503 (2011).</li><li>Monnier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrated+transcription+of+biological+processes+in+the+marine+picoeukaryote+Ostreococcus+exposed+to+light/dark+cycles.">Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles.</a> B.M.C. Genomics. 11, 192 (2010).</li><li>Le Bihan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomic+analysis+of+the+unicellular+alga+Ostreococcus+tauri.">Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri.</a> J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).</li><li>Corellou, F., Bouget, F. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polypeptides+from+the+nuclear+genome+of+Ostreococcus+sp.">Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp.</a> US application patent. , (2010).</li><li>Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt,+and+Detonula+confervacea+(cleve)+Gran.">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).</li><li>Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+for+the+culture+of+oceanic+ultraphytoplankton.">Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton.</a> J. Phycol. 23, 633-638 (1987).</li><li>Djouani-Tari, e. l. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphate-regulated+promoter+for+fine-tuned+and+reversible+overexpression+in+Ostreococcus:+Application+to+circadian+clock+functional+analysis.">A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis.</a> PLoS One. 6, e28471 (2011).</li><li>Moulager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+light+signals+by+the+retinoblastoma+pathway+in+the+control+of+S+phase+entry+in+the+picophytoplanktonic+cell+Ostreococcus.">Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus.</a> PLoS. Genet. 6, e1000957 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Hücresel devlet ve kültür axeny dönüşüm prosedürü için büyük önem taşır. Hücreleri, genellikle ışık 12 saat çevrimi içinde muhafaza edilmesine rağmen, 12 saat karanlık, bu şartlar altında yetiştirilen hücrelerinde dönüşümünün verim yetersiz olduğu bulunmuştur. Tekrarlanan peletleme / tabanda adımları sırasında hücreler her zaman kolaylıkla tekrar süspansiyon gerekir. Hücreleri agrega veya mukus benzeri bir madde varsa, tekrar baştan prosedürü başlatmak için daha iyidir. Tipik olarak, ~ 50 koloniler negatif kontrol plaka üzerinde hiç karşı, her dönüşüm plaka beklenebilir. Düşük dönüşümü verim durumda, kültürleme koşulları hücreleri optimum halindedir sağlamak üzere değiştirilebilir olmalıdır. Dönüşüm verimliliği etkileyen değişkenler ortam laboratuarında sıcaklıkta (yaklaşık 20 ° C olmalı) ve işleme hızı (hücre [2,3] kurtarma [2,7] peletleme gelen Prosedürü ~ 1 saat sürer) içerir. Aynı zamanda önemli olduğu bütün solüsyonlar,yeniden her dönüşüm öncesi taze yaptı. Plakalar dahil olmak için LMP agaroz konsantrasyonu Ostreococcus hücreleri yüksek agaroz konsantrasyonlarda büyümek olmaz. Çok önemlidir ve düşük konsantrasyonlarda karışacaktır. Ostreococcus için üç dönüşüm vektörleri daha önce 6 yayınlanmış olan ve daha vektörler oluşturulan ve kısa zamanda yayınlanacaktır bekleniyor. Potox vektör 6 Ostreococcus alınan güçlü uyarılabilir 13 promotor taşıyan ise mevcut vektör Pot-Luc 6, hızlı transgenik hat seçimini artı uysal ekspresyonu sağlayan bir C-terminal ateşböceği lusiferaz etiketi ile birlikte bir seçim promotor kullanılmasına izin verir ilgi genin ekspresyonu için yüksek afinite Fosfat Taşıyıcı (HAPT) geni. Potox-Luc vektör aşırı hatları dolaylı seçimi için kullanılabilecek ek bir lusiferaz işareti taşıyan, Potox türemiştir <s14&gt; kadar. Bu vektörler başarılı seçim işaretleyicilerini Nourseothricin ve G148 vardır. Bununla birlikte, birçok Ostreococcus hücreleri antibiyotikler dayanımı ve transjenik Ostreococcus hücrelerin seçilmesi için gerekli olan bileşiklerin konsantrasyonları konvansiyonel sistemlerin modeli (2 mg / ml) daha yüksektir. Süreci verimsiz görünür rağmen, hücreler ve bu işlem için gerekli plazmid DNA sayıda anlamlı bir engel teşkil etmektedir. Daha geniş bir sınırlama seçilebilir işaretleyici dayanıklı üretilen her satırı tüm yapı DNA entegre olduğunu kontrol etmek için ayrı ayrı analiz edilmesi gerekiyor. Biz seçilebilir marker başarılı ifadesi ilgi gerçek geninin ekleme uymadı hangi örnekler gözlemledim, yani kısmi entegrasyonlar oluşabilir. Açıkça, genom içine rastgele yerleştirilmesi de bu yöntemle ekleme sitenin hiçbir kontrolü olmadığı anlamına gelir, ve yöntemleri bhomolog rekombinasyon üzerine ased halen geliştirilmektedir. Ancak, yöntem, en iyi bilgi için, burada genetiği değiştirilmiş Ostreococcus hücreleri oluşturmak için şu anda sadece karakterize yöntemi açıklanmıştır. Ostreococcus tauri ancak son zamanlarda bir deneysel model organizma olarak kullanılan olduğu gibi, bu hücrelerin çalışma yöntemleri çoğu gelişmeye ve ilgili artan araştırma topluluğu tarafından rafine edilmesi muhtemeldir. Bu protokol insanların Ostreococcus ile çalışma başlatmak yardımcı olmak için tasarlanmıştır, ama hiçbir şekilde bu mikroalgi genomik dönüşümü hakkında bilmek olduğunu tüm tanımlamak için iddia edilir. Okuyucuları, küçük kuluçka farklılıklar (ışık seviyesi ve kalitesi) ve diğer parametreler var olacaktır olarak kendi ihtiyaçlarına göre bu protokol uyum ve muhtemelen bunun için gerekli sağlıklı kültürleri elde etmek için her bireyin laboratuvarda optimize edilmiş olması mümkün olacak yazarlar güven protokolü. Mastering sonra teknikleri, burada açıklananvektörler promotörleri bir dizi kontrolü altında ışıldayan, floresan veya diğer tagged füzyon hatları oluşturmak için inşa edilebilir. Bu heyecan verici yeni deney platformu karmaşık biyokimyasal sorunlar farmakolojik yaklaşımlar oldukça kolaylaştırdı 3 edildiği azaltılmış karmaşıklığı, bir ökaryot çözülüyor, nasıl çalışmak faydalı olacaktır.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Orta bileşenleri </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td colspan="2" > Katalog numarası </td><td> Satıcı </td></tr><tr><td> Instant Ocean Deniz Tuz </td><td colspan="3"> gelen <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> veya <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td colspan="2"> S5506-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> NH4CI </td><td colspan="2"> A9434-500G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Gliserol 2-fosfat disodyum tuzu hidrat </td><td colspan="2"> G9422-100G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> H 2 SeO 3 </td><td colspan="2"> 84.920-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ultra saf tris </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Na 2 EDTA • 2H 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500G </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 157740 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Na 2 Moo 4 • 2H 2 O </td><td colspan="2"> 31.439-100G-R </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 31277 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td colspan="2"> 203.734-5G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Vitamin B 12 (Siyanokobalamin) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Biotin </td><td colspan="2"> 47868 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Tiamin • HCl </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ampisilin </td><td colspan="2"> A9518-25G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Neomisin </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Kanamisin </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td colspan="4"> Yetiştiricilik için Sarf Malzemeleri </td></tr><tr><td colspan="2"> Madde </td><td> Katalog numarası </td><td> Satıcı </td></tr><tr><td colspan="2"> Kanal Dökme ile havalandırılmış Doku Kültürü Flask T25 Süspansiyon Kültürleri </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Kanal Dökme ile havalandırılmış Doku Kültürü Flask T75 Süspansiyon Kültürleri </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Kanal Dökme ile havalandırılmış Doku Kültürü Flask T175 Süspansiyon Kültürleri </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> DYP Şişe üst filtreler, 1L, tam </td><td> 99950T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> DYP Şişe üst filtreler, 500ml, </td><td> 99500T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> DYP Şişe üst filtreler, 250ml, </td><td> 99250T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> DYP Şişe üst filtreler, 150ml, </td><td> 99150T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> Marine Aquarium için Tuzluluk Ölçer </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="3" > Dönüşümü için kimyasallar </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Katalognumara </td><td> Satıcı </td></tr><tr><td> D-sorbitol </td><td> S6021-1KG </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Pluronic F-68 çözüm </td><td> P5556-100ML </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51000 </td><td> Werner </td></tr><tr><td> Düşük erime noktası agaroz </td><td> 16520-050 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td colspan="3"> Dönüşüm için Sarf </td></tr><tr><td> Madde </td><td> Katalog numarası </td><td> Satıcı </td></tr><tr><td> Kanal Dökme ile havalandırılmış Doku Kültürü Flask T25 Süspansiyon Kültürleri </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Kanal Dökme ile havalandırılmış Doku Kültürü Flask T75 Süspansiyon Kültürleri </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Doku Kültürü Flask T175 Süspansiyon Cultures Kanal Dökme ile havalandırılmış </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Greiner santrifüj tüpü 50ml </td><td> 227261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td> Gen Verici / MicroPulser küvetler, 0.2 cm boşluk, 50 </td><td> 165-2086 </td><td> Bio-Rad </td></tr><tr><td> Petri yuvarlak PS 3 DELIKLERI H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR International </td></tr><tr><td> Işınlama net 120mm tarafından steril dört havalandırmaları polistiren ile Petri kare </td><td> FB51788 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Ayışığı Mavi ışık filtresi </td><td> 183 </td><td> Lee Aydınlatma </td></tr></tbody></table>

genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri

Bitki Bilimleri hızlı ilerleme engelleyen ortak sorunları hücresel, doku ve tüm organizmanın karmaşıklığı ve yüksek bitkiler basit genetik etkileyen genomik fazlalık özellikle yüksek düzeyde bulunmaktadır. Yeni model organizma Ostreococcus tauri bugüne kadar bilinen en küçük serbest yaşayan ökaryot ve başına en organellerin sadece biri (mitokondri, kloroplast, golgi yığını) varlığı ile kendini gösteren büyük oranda azaltılmış genom büyüklüğü ve hücresel karmaşıklık 1,2, sahip Hücre ve sadece ~ 8.000 gen içeren bir genomu. Dahası, unicellularity ve kolay bir kültür kombinasyonu kimyasal biyolojisi yaklaşımlara müsait bir platform sağlar. Son zamanlarda, Ostreococcus başarıyla sirkadiyen Timekeeping 3-6 altında yatan temel mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. Bu model organizma sonuçları memeli biyoloji 7 bitki bilimi sadece etkiledi, ama var. Bu örnek, nasıl hızlı bir deney vurgulamaktadıryeşil soydan basit ökaryot yalnızca sınırlı karmaşıklığı bu arka planda teknik olarak uygulanabilir yöntemlerle sınanabilir hipotezler üretme, daha kompleks organizmalarda araştırma hızlandırabilir. Bir genom ve genler değiştirmek olanağı Bilgi herhangi bir model türler için temel araçlardır. Genetik Ostreococcus dönüştürmek için daha önce bildirilen yöntemler 6,10 dünyada çok az laboratuar bilinmektedir ise Genomik 1, Transkriptomik 8, ve bu türler için Proteomik 9 bilgiler, özgürce kullanılabilir. Bu makale, deney yöntemleri genetik elektroporasyon yoluyla yapı ayrıntılı olarak belirtildiği gibi dönüştürülmüştür hatları seçimi, bir kaynaklanan izin verecek şekilde düşük oranda agaroz in transforme hücreler dahil edilmesi metodu olan bir aşırı ekspresyonu ile Bu yeni model organizma dönüştürmeye tek hücre dönüştürdü. Ostreoco başarılı uygulama sonrasındasirkadiyen araştırma ccus, Ostreococcus artan bir ilgi biyoteknolojik alanlarda dahil olmak üzere bitki bilimleri, içinde ve dışında çeşitli araştırma alanları beklenebilir. Korunmuş biyokimyasal yollar üzerinde çalışmak biyoloji ve tıp bilimleri, geniş bir alanda araştırmacılar büyük bir model türlerinin genomik ve organizma karmaşıklığı ücretsiz Ostreococcus içinde takip araştırma, düşünebilirsiniz.

Watch this Scientific Journal Video about Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri at JoVE.com

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Bu makalede, tek hücreli deniz alg genetik dönüşümü anlatılmaktadır<em&gt; Ostreococcus tauri</em&gt; Elektroporasyonla. Bu ökaryot organizma büyük ölçüde azaltılmış genomik ve hücresel karmaşıklığı haiz ve hücre kültürü ve kimyasal biyoloji hem de kolayca uysal biri, yüksek bitkiler için etkili bir model platformdur.

Picoeukaryote genomik Dönüşüm<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

genomic-transformation-of-the-picoeukaryote-ostreococcus-tauri

Research

JoVE Journal

Biology

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

15.6K Görüntüleme.  University of Edinburgh. Bu makalede, tek hücreli deniz alg genetik dönüşümü anlatılmaktadır Ostreococcus tauri Elektroporasyonla. Bu ökaryot organizma büyük ölçüde azaltılmış genomik ve hücresel karmaşıklığı haiz ve hücre kültürü ve kimyasal biyoloji hem de kolayca uysal biri, yüksek bitkiler için etkili bir model platformdur.

Video: Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Fare Tails Genomik DNA izolasyonu

Biyoloji

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Büyük Ekle Çevre Genomik Kütüphane Üretim

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

RNA içeren Oligonükleotidler kullanarak Dönüşüm Genomik DNA, RNA / DNA Hibritlerin Üretimi

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1. Due to its capacity to undergo efficient mitotic homologous recombination, Physcomitrella patens has emerged as an important model system in recent years2. This capacity allows high frequencies of gene targeting3-9, which is not seen in other model plants such as Arabidopsis. To take full advantage of this system, we need an effective and easy method to deliver DNA into moss cells. The most common ways to transform this moss are particle bombardment10 and PEG-mediated DNA uptake11. Although particle bombardment can produce a high transformation efficiency12, gene guns are not readily available to many laboratories and the protocol is difficult to standardize. On the other hand, PEG mediated transformation does not require specialized equipments, and can be performed in any laboratory with a sterile hood. Here, we show a simple and highly efficient method for transformation of moss protoplasts. This method can generate more than 120 transient transformants per microgram of DNA, which is an improvement from the most efficient protocol previously reported13. Because of its simplicity, efficiency, and reproducibility, this method can be applied to projects requiring large number of transformants as well as for routine transformation.

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1.

Moss Verimli Polietilen Glikol (PEG) aracılığı ile Dönüşüm Physcomitrella Dini ayinlerde kullanılan patenler</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

MR Genomik - Sıra Desenler Genomik DNA içinde incelenmesi için Kamu Kaynak

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Genomik DNA 5-hydroxymethylcytosine seçici Yakalama

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Genomik Kopya Sayısı Variantların Algılama için dizi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (CGH Array)

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA Sıralama Deneyi Gen İfade ve Genomik değişiklikleri tanımlamak için hedeflenen

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

CRISPR/Cas9 Kullanarak Boş Mutasyonlar Oluşturmak için Culex Sivrisineklerinin Embriyolarının Hazırlanması ve EnjekteSi

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...