העבודה שלנו כבר נתמך על ידי תרומות של איגוד הלב האמריקני (שותפים רבתי דרום מזרח) התחלת-מענק-in-0765185B סיוע, ע &#39;אלזה Pardee קרן מענק מחקר, ויין סטייט קרן ההפעלה עירונית, לב וכלי דם מכון המחקר איזיס הפרס היוזמה. שיטה זו של באסיפה חוץ גופית CFTR מורכב macromolecular היה במקור חלוץ ידי ד&quot;ר AP Naren (אוניברסיטת טנסי למדעי הבריאות מרכז).

1. ביטוי וטיהור של חלבון רקומביננטי היתוך שתויגו בחיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר באזורים מוגדרים של ה-C-זנבות (האחרונים 50-100 חומצות אמינו המכילות המוטיבים PDZ בתחנה הסופית, ג) CFTR, אמ&quot;ע 2, MRP2, MRP4, β 2 AR, ו NHERFs (באורך מלא או PDZ1 או PDZ2 תחומים ) על ידי גישה PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל את מוצרי ה-PCR לתוך וקטור-1 pGEX4T עבור GST-Fusion חלבונים (כגון GST-NHERFs, GST-MRP4 CT), pMAL-C2 וקטור עבור MBP-Fusion חלבונים (כמו MBP-β 2 AR-CT, MBP-CFTR CT ), ו pET30 for-S-Fusion שלו חלבונים (כמו שלו S-CFTR CT, שלו S-PDZK1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרה של פרוטאז ה-לקויה זן coli (BL21-DE3) כדי למזער את החלבון ניתן השפלה רקומביננטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול בתרבות לילה ב 37 מעלות צלזיוס לוריא-Bertani בינוני (pH 7.0) המכיל אנטיביוטיקה המתאימה (כגון ampicillin או kanamycin). לדלל את תרבות הלילה בשעה 1:10 ולגדול עוד 2 שעות ב 37 ° C. בתוךדוצ&#39;ה עם 0.5-1 מ &#39;מ IPTG עבור H 4 הבא בשעה 30 ° C. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 8000 × גר 10 דקות ב 4 מעלות ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים במאגר סוכרוז (50 מ &#39;M-Tris HCl, pH 8.0, 1 מ&#39; M EDTA, 1 מ &#39;מ PMSF, סוכרוז ו 10%) המכיל ליזוזים (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל), טריטון 0.2% X-100, ו פרוטאז מעכבי. השתמש 20 מ&quot;ל של תא גלולה שמקורם L 1 של התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים על שייקר רוטרי למשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסובבים 20000 × g למשך 30 דקות ב 4 ° C. איסוף supernatant ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל supernatant ברור, הוסף 1 מ&quot;ל של שרף / agarose החרוזים הבאים (slurry 50% במאגר סוכרוז): <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלוטתיון agarose חרוזים עבור חלבונים GST היתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טופר חרוזים עבור חלבונים שלו מכלל היתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Amylose שרף עבור חלבונים MBP היתוך. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת H 4 על 4 מעלות צלזיוס על שייקר סיבובית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את החרוזים על ידי resuspending ב 1x PBS (15 מ&quot;ל), ערבוב של 2 מיילn, מסתובב ב 800 × g עבור 2 דקות, ואת השלכת supernatant. חזור על פעולה זו במשך שש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute חלבון מן החרוזים באמצעות חיץ elution בהתאמה (2 חיץ elution מ&quot;ל לכל 1 מ&quot;ל של חרוזים). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר elution עבור חלבונים GST היתוך: 25 מ &#39;מ טריס-HCl (pH 8.0), 140 M NaCl, ו 20 מ&#39; מ מופחת גלוטתיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elution חיץ של חלבונים היתוך שלו: 20 מ &#39;מ טריס-HCl (pH 8.0), 500 מ&#39; M NaCl, ו 200 מ &#39;מ imidazole. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elution חיץ של חלבונים MBP היתוך: 20 מ &#39;מ טריס-HCl (pH 8.0), 200 מ&#39; M NaCl, 1 מ &#39;M EDTA, 1 מ&#39; מ DTT, ו 10 מ &#39;מ מלטוז. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze החלבונים eluted נגד L 2 של 1x PBS ב 4 ° C (כדי למנוע פירוק חלבונים אפשרי). שנה PBS כל 4 שעות במשך ארבע פעמים. לרכז את החלבון באמצעות מסנן Centricon (10,000 הפסקת MW, Millipore) וחנות כמו aliquots קטנים ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Detסמור ריכוז חלבון בשיטת ברדפורד. להעריך את איכות החלבון על ידי SDS-PAGE באמצעות BSA כמו סטנדרטים. אם שלמות של החלבון אינו משביע רצון, הליכי טיהור משניים כגון סינון ג&#39;ל או חילוף יונים ניתן להשתמש. (למשל, השתמשנו עמודה G-75 Sepharose להמשיך לטהר GST-Fusion חלבון). </li></ol> 2. התא התרבות lysate הכנה Cell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התינוק אוגר בכליות (BHK) התאים ביציבות יתר אקספרס CFTR-WT ו-CFTR his10 או תאים BHK כי זמני יתר אקספרס הדגל אמ&quot;ע 2-WT או הדגל אמ&quot;ע 2-ΔSTL, ואת מדין, דארבי כליות כלבים (MDCK התאים) ביציבות יתר אקספרס MRP2 במדיום חיוני מינימום של הנשר (MEM) המכילים 10% עוברית עגל בסרום פניצילין / סטרפטומיצין ב צלוחיות קלקר על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אדם תרבות עובריים כליה 293 (HEK293) התאים ביציבות יתר אקספרס CFTR-WT ו-CFTR his10 ב Dulbecco&quot;בינוני זה שונה הנשרים (DMEM) השלימו עם 10% בסרום שור עוברית פניצילין / סטרפטומיצין ב צלוחיות קלקר על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים במאגר תמוגה (PBS - 0.2% Triton-X-100 השלימו עם תערובת של מעכבי הפרוטאז המכילים פלואוריד 1 מ &#39;מ phenylmethylsulphonyl, 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל aprotinin, 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל leupeptin, 1 מיקרוגרם / pepstatin מ&quot;ל); שימוש 500 תמוגה חיץ μL על צלחת פטרי כל 60 מ&quot;מ, ו 1000 מאגר תמוגה μL על צלחת פטרי כל 100 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוק התא lysates במשך 20 דקות ב 4 ° C, ולהסיר את חומר מסיס על ידי צנטריפוגה של 16,000 × גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C. לקבוע את ריכוז החלבון על ידי assay ברדפורד. </li></ol> 3. ב העצרת מבחנה של CFTR קומפלקס המכיל Macromolecular (CFTR-PDZK1-MRP4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל μL 200 מאגר תמוגה (PBS - 0.2% טריטון X-100 + מעכבי פרוטאז), להוסיף 20 מיקרוגרם מטוהרים GST-MRP4-C טרמינל50 AA (CT50) חלבון היתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת כמויות שונות (0-40 מיקרוגרם) של מטוהרים שלו S-PDZK1 חלבון היתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את שני חלבונים על מערבל סיבובית על 22 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 חרוזים גלוטתיון μL (50% slurry) לתוך תערובת החלבונים, וממשיכים לערבב לעוד 1 ש. שלב זה מכונה גם זוג מבחינת מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו, להכין את HEK293 lysates תא overexpress הדגל CFTR (WT) כמתואר לעיל בשלב 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את מורכבות פעמיים עם חיץ תמוגה. מסובבים 800 גר &#39;× 1 דקות לכביסה כל ובזהירות לשאוב supernatant לאחר כל שטיפה. היזהר לא למצוץ את החרוזים בחלק התחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את לעיל מוכנים HEK293 lysates התא אל חרוזים, לערבב בעדינות על 4 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות (או לילה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את החרוזים נרחבת שלוש פעמים עם חיץ תמוגה כמתואר בשלב 3.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute את החלבונים באמצעות 30 חוצץ לדוגמא μL (5 ×): 0.6 מ &#39;<html> טריס-HCl (pH 6.8), גליצרול 50%, SDS 2%, ו -0.1% bromophenol כחול, המכיל 5% β-mercaptoethanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 37 ° C אמבט מים במשך 10-15 דקות, ועל הספין של 5000 × 30 גרם של S כדי לזרז את החרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון את כל eluate על ג&#39;ל 4-15%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל SDS-PAGE בערך 30-40 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת להקות חלבון הממברנה PVDF, עבור 1.5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום את הממברנה ב-TBS Tween המכיל 5% שומן לא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם הנוגדן הראשוני (כגון אנטי CFTR IgG, R1104) בשעה 4 ° C, למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה עם TBS-Tween במשך 5 דקות, שש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדן משנית (כגון אנטי העכבר עז נוגדנים HRP-מצומדות nd 2) במשך 45 דק &#39;ב 22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה עם TBS-Tween במשך 5 דקות, שש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את להקות חלבון באמצעות ECL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנתונים מייצגים מוצגות באיור 1. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. תוצאות נציג דוגמה מורכבת CFTR המכיל macromolecular מאותת כי נערכו במבחנה מוצג באיור 1. מורכב macromolecular הוקמה בין MRP4 בטרמינל C-50 חומצות אמינו (MRP4-CT50), PDZK1, וכן באורך מלא CFTR (איור 1, למטה). היווצרות קומפלקס גדל מינון dependently עם כמויות הולכות וגדלות של חלבון מתווך, PDZK1 (איור 1, למטה) 18. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4091/4091fig1.jpg" /> באיור 1. ייצוג בתמונות של assay מורכב macromolecular (למעלה). מורכב macromolecular התגלה במבחנה שלושה חלבונים (GST-MRP4-CT50, שלו S-PDZK1, ואת הדגל CFTRwt) באופן תלויות מינון (למטה) 18. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; CFTR-NHERF1-β 2 AR (ref. 14) </td><td> CFTR-NHERF2-LPA 2 (ref. 15) </td><td> CFTR-PDZ חלבונים-MRP 2 (ref. 17) </td><td> CFTR-PDZK1-MRP4 (ref. 16) </td></tr><tr><td> זיקה חרוזים </td><td> Amylose שרף </td><td> S-חלבון agarose </td><td> Amylose שרף </td><td> גלוטתיון agarose </td></tr><tr><td> מטוהרים חלבון-1 </td><td> MBP-β 2 AR-CT </td><td> שלו-S-CFTR CT </td><td> MBP-CFTR CT </td><td> GST-CT MRP4 </td></tr><tr><td> מטוהרים חלבון-2 </td><td> GST-NHERF1 </td><td> GST-NHERF2 </td><td> GST-PDZ חלבונים </td><td> שלו-S-PDZK1 </td></tr><tr><td> מטוהרים חלבון-3 (או lysates התא) </td><td> CFTR-WT או CFTR-his10 (BHK או lysates HEK התא) </td><td> דגלאמ&quot;ע-2-WT או הדגל אמ&quot;ע 2-ΔSTL (lysates BHK התא) </td><td> MRP2 (lysates סלולריים MDCK) </td><td> מטוהרים הדגל CFTR-WT או CFTR-his10 (או lysates התא) </td></tr><tr><td> נוגדן </td><td> Anti-CFTR IgG </td><td> Anti-Flag HRP </td><td> Anti-IgG MRP2 </td><td> Anti-Flag HRP </td></tr></tbody></table> 1. טבלה מסכמת של CFTR המכילים קומפלקסים שונים macromolecular התאספו במבחנה.

<ol>
	<li>Anderson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+that+CFTR+is+a+chloride+channel+by+alteration+of+its+anion+selectivity.">Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity.</a> Science. 253, 202-205 (1991).</li><li>Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+functional+reconstitution+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR.">Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR.</a> Cell. 68, 809-818 (1992).</li><li>Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+impermeability+in+cystic+fibrosis.">Chloride impermeability in cystic fibrosis.</a> Nature. 301, 421-422 (1983).</li><li>Cheng, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+intracellular+transport+and+processing+of+CFTR+is+the+molecular+basis+of+most+cystic+fibrosis.">Defective intracellular transport and processing of CFTR is the molecular basis of most cystic fibrosis.</a> Cell. 63, 827-834 (1990).</li><li>Gabriel, S. E., Brigman, K. N., Koller, B. H., Boucher, R. C., Stutts, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+heterozygote+resistance+to+cholera+toxin+in+the+cystic+fibrosis+mouse+model.">Cystic fibrosis heterozygote resistance to cholera toxin in the cystic fibrosis mouse model.</a> Science. 266, 107-109 (1994).</li><li>Li, C., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+chloride+channel+in+the+apical+compartments:+spatiotemporal+coupling+to+its+interacting+partners.">CFTR chloride channel in the apical compartments: spatiotemporal coupling to its interacting partners.</a> Integr. Biol (Camb). 2, 161-177 (2010).</li><li>Chao, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+intestinal+CFTR+Cl-+channel+by+heat-stable+enterotoxin+and+guanylin+via+cAMP-dependent+protein+kinase.">Activation of intestinal CFTR Cl- channel by heat-stable enterotoxin and guanylin via cAMP-dependent protein kinase.</a> Embo. J. 13, 1065-1072 (1994).</li><li>Gabriel, S. E., Clarke, L. L., Boucher, R. C., Stutts, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+and+outward+rectifying+chloride+channels+are+distinct+proteins+with+a+regulatory+relationship.">CFTR and outward rectifying chloride channels are distinct proteins with a regulatory relationship.</a> Nature. 363, 263-268 (1993).</li><li>McNicholas, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+a+renal+K++channel+(ROMK2)+to+the+inhibitory+sulfonylurea+compound+glibenclamide+is+enhanced+by+coexpression+with+the+ATP-binding+cassette+transporter+cystic+fibrosis+transmembrane+regulator.">Sensitivity of a renal K+ channel (ROMK2) to the inhibitory sulfonylurea compound glibenclamide is enhanced by coexpression with the ATP-binding cassette transporter cystic fibrosis transmembrane regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 8083-8088 (1996).</li><li>Schreiber, R., Nitschke, R., Greger, R., Kunzelmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+activates+aquaporin+3+in+airway+epithelial+cells.">The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activates aquaporin 3 in airway epithelial cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 11811-11816 (1999).</li><li>Shumaker, H., Amlal, H., Frizzell, R., Ulrich, C. D., Soleimani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+drives+Na+-nHCO-3+cotransport+in+pancreatic+duct+cells:+a+basis+for+defective+HCO-3+secretion+in+CF.">CFTR drives Na+-nHCO-3 cotransport in pancreatic duct cells: a basis for defective HCO-3 secretion in CF.</a> Am. J. Physiol. 276, 16-25 (1999).</li><li>Ahn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+interaction+between+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+and+HCO3-+salvage+mechanisms+in+model+systems+and+the+mouse+pancreatic+duct.">Regulatory interaction between the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and HCO3- salvage mechanisms in model systems and the mouse pancreatic duct.</a> J. Biol. Chem. 276, 17236-17243 (2001).</li><li>Sugita, M., Yue, Y., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+Cl-+channel+and+CFTR-associated+ATP+channel:+distinct+pores+regulated+by+common+gates.">CFTR Cl- channel and CFTR-associated ATP channel: distinct pores regulated by common gates.</a> Embo. J. 17, 898-908 (1998).</li><li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CFTR+chloride+channels+by+syntaxin+and+Munc18+isoforms.">Regulation of CFTR chloride channels by syntaxin and Munc18 isoforms.</a> Nature. 390, 302-305 (1997).</li><li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntaxin+1A+is+expressed+in+airway+epithelial+cells,+where+it+modulates+CFTR+Cl(-)+currents.">Syntaxin 1A is expressed in airway epithelial cells, where it modulates CFTR Cl(-) currents.</a> J. Clin. Invest. 105, 377-386 (2000).</li><li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macromolecular+complex+of+beta+2+adrenergic+receptor,+CFTR,+and+ezrin/radixin/moesin-binding+phosphoprotein+50+is+regulated+by+PKA.">A macromolecular complex of beta 2 adrenergic receptor, CFTR, and ezrin/radixin/moesin-binding phosphoprotein 50 is regulated by PKA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 342-346 (1073).</li><li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidic+acid+inhibits+cholera+toxin-induced+secretory+diarrhea+through+CFTR-dependent+protein+interactions.">Lysophosphatidic acid inhibits cholera toxin-induced secretory diarrhea through CFTR-dependent protein interactions.</a> J. Exp. Med. 202, 975-986 (2005).</li><li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+coupling+of+cAMP+transporter+to+CFTR+chloride+channel+function+in+the+gut+epithelia.">Spatiotemporal coupling of cAMP transporter to CFTR chloride channel function in the gut epithelia.</a> Cell. 131, 940-951 (2007).</li><li>Li, C., Schuetz, J. D., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+carcinogen+NNK+transporter+MRP2+regulates+CFTR+function+in+lung+epithelia:+implications+for+lung+cancer.">Tobacco carcinogen NNK transporter MRP2 regulates CFTR function in lung epithelia: implications for lung cancer.</a> Cancer Lett. 292, 246-253 (2010).</li><li>Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C-terminal+motif+found+in+the+beta2-adrenergic+receptor,+P2Y1+receptor+and+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+determines+binding+to+the+Na+/H++exchanger+regulatory+factor+family+of+PDZ+proteins.">A C-terminal motif found in the beta2-adrenergic receptor, P2Y1 receptor and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator determines binding to the Na+/H+ exchanger regulatory factor family of PDZ proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 8496-8501 (1998).</li><li>Short, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+apical+PDZ+protein+anchors+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+to+the+cytoskeleton.">An apical PDZ protein anchors the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to the cytoskeleton.</a> J. Biol. Chem. 273, 19797-19801 (1998).</li><li>Wang, S., Yue, H., Derin, R. B., Guggino, W. B., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessory+protein+facilitated+CFTR-CFTR+interaction,+a+molecular+mechanism+to+potentiate+the+chloride+channel+activity.">Accessory protein facilitated CFTR-CFTR interaction, a molecular mechanism to potentiate the chloride channel activity.</a> Cell. 103, 169-179 (2000).</li><li>Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3KARP+mediates+the+association+of+ezrin+and+protein+kinase+A+with+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+airway+cells.">E3KARP mediates the association of ezrin and protein kinase A with the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in airway cells.</a> J. Biol. Chem. 275, 29539-29546 (2000).</li><li>Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Golgi-associated+PDZ+domain+protein+modulates+cystic+fibrosis+transmembrane+regulator+plasma+membrane+expression.">A Golgi-associated PDZ domain protein modulates cystic fibrosis transmembrane regulator plasma membrane expression.</a> J. Biol. Chem. 277, 3520-3529 (1074).</li><li>Scott, R. O., Thelin, W. R., Milgram, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+PDZ+protein+regulates+the+activity+of+guanylyl+cyclase+C,+the+heat-stable+enterotoxin+receptor.">A novel PDZ protein regulates the activity of guanylyl cyclase C, the heat-stable enterotoxin receptor.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 22934-22941 (1074).</li><li>Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+by+competitive+interactions+of+molecular+adaptors.">Dynamic regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by competitive interactions of molecular adaptors.</a> The Journal of biological chemistry. 282, 10414-10422 (2007).</li><li>Gee, H. Y., Noh, S. H., Tang, B. L., Kim, K. H., Lee, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+DeltaF508-CFTR+trafficking+via+a+GRASP-dependent+unconventional+secretion+pathway.">Rescue of DeltaF508-CFTR trafficking via a GRASP-dependent unconventional secretion pathway.</a> Cell. 146, 746-760 (2011).</li><li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+intermolecular+and+intramolecular+interactions+regulating+CFTR+function.">Methods for the study of intermolecular and intramolecular interactions regulating CFTR function.</a> Met. Molecul. Med. 70, 175-186 (2002).</li><li>Li, C., Roy, K., Dandridge, K., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+assembly+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+plasma+membrane.">Molecular assembly of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in plasma membrane.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 24673-24684 (2004).</li><li>Li, C., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+CFTR+Interactome+in+the+Macromolecular+Complexes.">Analysis of CFTR Interactome in the Macromolecular Complexes.</a> Met. Molecul. Med. 741, 255-270 (2011).</li><li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemokine+receptor+CXCR2+macromolecular+complex+regulates+neutrophil+functions+in+inflammatory+diseases.">A chemokine receptor CXCR2 macromolecular complex regulates neutrophil functions in inflammatory diseases.</a> J. Biol. Chem. , (2011).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

בפרוטוקול זה הראינו שיטה במבחנה הרכבה זיהוי של CFTR המכיל קומפלקס macromolecular איתות באמצעות חלבונים מטוהרים (או שברי חלבונים) ו / או lysates סלולריים כפי שדווח בעבר 16-19,29,30. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר הנקודות הבאות קריטיות בתהליך ההכנה דורשים התייחסות מיוחדת: ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> pGEX4T-1 וקטור </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9545-49 </td><td> בעבר Amersham Biosciences </td></tr><tr><td> pMAL-C2 וקטור </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> pET30 וקטור </td><td> EMD כימיקלים </td><td> 69077-3 </td><td> בעבר Novagen </td></tr><tr><td> גלוטתיון agarose חרוזים </td><td> BD Biosciences </td><td> 554780 </td><td></td></tr><tr><td> Amylose שרף </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> E8021S </td><td></td></tr><tr><td> טופר חרוזים </td><td> Clontech </td><td> 635501 </td><td></td></tr><tr><td> גלוטתיון מופחתת </td><td> BD Biosciences </td><td> 554782 </td><td></tד&gt; </tr><tr><td> imidazole </td><td> דיג </td><td> BP305-50 </td><td></td></tr><tr><td> מלטוז </td><td> דיג </td><td> BP684-500 </td><td></td></tr><tr><td> S-חלבון agarose </td><td> EMD כימיקלים </td><td> 69704-3 </td><td> בעבר Novagen </td></tr><tr><td> Anti-Flag HRP </td><td> סיגמא </td><td> A8592 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CFTR IgG </td><td> מחוייט </td><td> R1104 </td><td> MAB הכרה CFTR epitope ב-AA 722-734 </td></tr><tr><td> Anti-IgG MRP2 </td><td> Chemicon הבינלאומי </td><td> MAB4148 </td><td> עכשיו חלק Millipore </td></tr></tbody></table> טבלה 2. חומרים כימיים ספציפיים וציוד.

in vitro analysis of pdz-dependent cftr macromolecular signaling complexes

סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור המוליכות (CFTR), ערוץ כלוריד נמצא בעיקר בקרום הפסגה של תאים אפיתל, ממלא תפקיד מכריע הומאוסטזיס נוזל transepithelial 1-3. CFTR היה מעורב בשתי מחלות עיקריות: סיסטיק פיברוזיס (CF) 4 ו הפרשה שלשולים 5. ב CF, סינתזה או פעילות פונקציונלית של CFTR Cl ערוצים מצטמצם. הפרעה זו משפיעה על כ 1 ב 2500 לבנים בארצות הברית 6. פעילות CFTR מוגזם גם היה מעורב במקרים של שלשול, הרעלן המושרה הפרשה (למשל, על ידי רעלן כולרה enterotoxin יציבה חום א coli), אשר ממריץ את ייצור cGMP cAMP או במעיים 7. צבירת ראיות מציע קיומה של אינטראקציה פיזית בין תפקודי CFTR, ומספר גדל והולך של חלבונים אחרים, כולל מובילי, תעלות יונים, רצפטורים, קינאזות, phosphatases, אותותמולקולות תית, ואלמנטים cytoskeletal, וכן את יחסי הגומלין בין CFTR וחלבונים מחייב שלה הוכחו להיות מעורב באופן קריטי בוויסות CFTR בתיווך התחבורה יון transepithelial במבחנה גם in vivo 8-19. בפרוטוקול זה, אנחנו מתמקדים רק השיטות המסייעים בחקר יחסי הגומלין בין זנב מסוף carboxyl CFTR, אשר מחזיק מוטיב חלבון מחייב [המכונה PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) מוטיב], ו קבוצה של פיגום חלבונים, אשר מכילים מודול מחייב ספציפית המכונה תחומים PDZ. עד כה, כמה חלבונים שונים PDZ הפיגום דווחו להיקשר זנב מסוף carboxyl של CFTR עם זיקות שונות, כגון NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR הקשורים ליגנד), Shank2, ולתפוס 20-27. מוטיב PDZ בתוך CFTR, שמוכר על ידי PDZ פיגום חלבונים הוא האחרון ארבע חומצות אמינו בתחנה הסופית C (כלומר, 1477, DTRL-1480 ב CFTR אדם) 20. מענייןCFTR יכולה לאגד יותר מושלם PDZ של שני NHERFs ו PDZK1, אם כי עם שינוי זיקות 22. Multivalency זה ביחס CFTR מחייב הוכח להיות בעל משמעות תפקודית, דבר המצביע על כך PDZ חלבונים הפיגום יכול להקל על היווצרות macromolecular CFTR איתות קומפלקסים של איתות ספציפיים / סלקטיביים ויעיל בתאים 16-18. מבחני ביוכימיים רבים פותחו ללמוד CFTR-מעורבים אינטראקציות חלבון, כגון immunoprecipitation משותפת, הנפתח assay, זוג מבחינת assay מחייב, assay colorimetric זוג מבחינת מחייב, והרכבה מורכב macromolecular assay 16-19,28,29 . כאן נתמקד הנהלים המפורטים של הרכבת מוטיב תלוי PDZ CFTR המכיל macromolecular מורכב במבחנה, שבו נעשה שימוש נרחב על ידי המעבדה שלנו ללמוד חלבונים או תחום תחומים אינטראקציות מעורבים CFTR 16-19,28,29.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes at JoVE.com

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור המוליכות (CFTR), ערוץ כלוריד אפיתל, דווחה אינטראקציה עם חלבונים שונים לווסת תהליכים תאיים חשובים, ביניהם את PDZ CFTR מוטיב בתיווך אינטראקציות תועדו היטב. פרוטוקול זה מתאר שיטות שפיתחנו כדי להרכיב macromolecular PDZ תלוי CFTR איתות מורכבת<em&gt; במבחנה</em&gt;.

בניתוח מבחנה של PDZ תלויי macromolecular תסביכים CFTR לשידור אותות

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

in-vitro-analysis-pdz-dependent-cftr-macromolecular-signaling

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

10.3K Views.  Wayne State University School of Medicine. סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור המוליכות (CFTR), ערוץ כלוריד אפיתל, דווחה אינטראקציה עם חלבונים שונים לווסת תהליכים תאיים חשובים, ביניהם את PDZ CFTR מוטיב בתיווך אינטראקציות תועדו היטב. פרוטוקול זה מתאר שיטות שפיתחנו כדי להרכיב macromolecular PDZ תלוי CFTR איתות מורכבת

Video: In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, form a complex with Smad4 and translocate to the nucleus where they function as transcription factors to initiate BMP specific downstream effects 1. Traditional immuno-fluorescence techniques with antibodies against phospho-Smad peptides exhibit low sensitivity, high background and offer gross quantification as they rely on intensity of the antibody signal particularly if this is photosensitive fluorescent. In addition, phospho-Smads may not all be in complex with Smad4 and engaged in active transcription.
In situ PLA is a technology capable of detecting protein interactions with high specificity and sensitivity 2-4. This new technology couples antibody recognition with the amplification of DNA surrogate of the protein. It generates a localized, discrete signal in a form of spots revealing the exact position of the recognition event. The number of signals can be counted and compared providing a measurement. We applied in situ PLA, using the Duolink kit, with a combination of antibodies that allows the detection of the BMP signaling effectors phospho-Smad1/5/8 and Smad4 only when these are in proximity i.e. in a complex, which occurs only with signaling activation. This allowed for the first time, the visualization and measurement of endogenous BMP signaling with high specificity and sensitivity in a time course experiment under BMP4 stimulation.

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Here we show how to use Proximity Ligation Assay (PLA), with a combination of antibodies to visualize Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling in fixed cells. This technique allowed us to follow the nuclear accumulation of endogenous BMP activated effector-complexes and quantify their levels over time under BMP4 stimulation.

איתור של מפעיל איתות, מתחמי Downstream של BMP4 שימוש באתרו PLA, Assay קשירת הסמיכות

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

הדמית עבודה גבוהה תוכן ללמוד Grb2 מכלולי איתות על ידי שיבוט ביטוי

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the brain, liver, retina, cochlea and vasculature. In experimental settings, intercellular Ca2+-waves can be elicited by applying a mechanical stimulus to a single cell. This leads to the release of the intracellular signaling molecules IP3 and Ca2+ that initiate the propagation of the Ca2+-wave concentrically from the mechanically stimulated cell to the neighboring cells. The main molecular pathways that control intercellular Ca2+-wave propagation are provided by gap junction channels through the direct transfer of IP3 and by hemichannels through the release of ATP. Identification and characterization of the properties and regulation of different connexin and pannexin isoforms as gap junction channels and hemichannels are allowed by the quantification of the spread of the intercellular Ca2+-wave, siRNA, and the use of inhibitors of gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-wave in monolayers of primary corneal endothelial cells loaded with Fluo4-AM in response to a controlled and localized mechanical stimulus provoked by an acute, short-lasting deformation of the cell as a result of touching the cell membrane with a micromanipulator-controlled glass micropipette with a tip diameter of less than 1 &mu;m. We also describe the isolation of primary bovine corneal endothelial cells and its use as model system to assess Cx43-hemichannel activity as the driven force for intercellular Ca2+-waves through the release of ATP. Finally, we discuss the use, advantages, limitations and alternatives of this method in the context of gap junction channel and hemichannel research.

Intercellular Ca2+-waves are driven by gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-waves in cell monolayers in response to a local single-cell mechanical stimulus and its application to investigate the properties and regulation of gap junction channels and hemichannels.

הרבייה מכאנית מושרה גירוי סיד גל בmonolayers הסלולרי: דוגמה לתאי אנדותל קרני שור

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

מדידה של קצב חילוף החומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; באמצעות Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls and carotenoids. In vivo, these proteins are folded with pigments to form complexes which are inserted in the thylakoid membrane of the chloroplast. The high similarity in the chemical and physical properties of the members of the family, together with the fact that they can easily lose pigments during isolation, makes their purification in a native state challenging. An alternative approach to obtain homogeneous preparations of LHCs was developed by Plumley and Schmidt in 19871, who showed that it was possible to reconstitute these complexes in vitro starting from purified pigments and unfolded apoproteins, resulting in complexes with properties very similar to that of native complexes. This opened the way to the use of bacterial expressed recombinant proteins for in vitro reconstitution. The reconstitution method is powerful for various reasons: (1) pure preparations of individual complexes can be obtained, (2) pigment composition can be controlled to assess their contribution to structure and function, (3) recombinant proteins can be mutated to study the functional role of the individual residues (e.g., pigment binding sites) or protein domain (e.g., protein-protein interaction, folding). This method has been optimized in several laboratories and applied to most of the light-harvesting complexes. The protocol described here details the method of reconstituting light-harvesting complexes in vitro currently used in our laboratory, and examples describing applications of the method are provided.

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.