מרדף הדופק הרדיואקטיבי באמצעות 35 S שכותרתו מתונין וציסטאין היא עדיין השיטות הביוכימיות היחידות לחקור ביו-סינתזה של חלבונים עם זמן בתאים חיים. ביו-סינתזה של חלבונים מכסה הן תרגום, קיפול והרכבה, והן סחר והשפלה. שילוב של מרדף הדופק הרדיואקטיבי עם ניתוח של שינויים בחלבון לאחר התרגום, כגון היווצרות אג"ח דיסולפיד ואצטילציה מספק בדיקה רגישה וכמותית כדי לחקור את אמונת החלבון עם הזמן.
מיקוד טוב וטיפול ניסיוני נדרש עבור הליך זה. הכנה טובה היא קריטית, כמו מאגרים, סביבת העבודה הרדיואקטיבית שלך ולוח זמנים ברור. וידאו זה מספק מבט ברור מעבר לכתף של פרוטוקול מרדף הדופק הרדיואקטיבי.
הדגמת ההליך תהיה הוי יינג יאו, מועמד pHd מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, זרע מתחלף ותאי תרבות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לפני מרדף הדופק, לבדוק את התאים שלך דרך המיקרוסקופ.
לאחר מכן, לשטוף את הכלים עם שני מיליליטר של חיץ לשטוף. ושני מיליליטר של רעב בינוני לתאים ומ מניחים את הכלים באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 15 דקות. ודא כי מרדף הדופק שלך להגדיר הוא בסדר.
מעבירים את הכלים למדפים באמבט המים, מחוממים מראש ל-37 מעלות צלזיוס. ודאו שהמנות נמצאות במגע עם מים, אך אל תצופו. לאחר מכן, התחל שעון זמן.
ב-40 שניות, שאף את מדיום הרעב. באמצעות צינור מיקרו, לצייר 600 microliters של פתרון הדופק. בדיוק דקה אחת, מוסיפים בעדינות את תסנון הדופק למרכז המנה.
חזור על תהליך זה של הסרת מדיום הרעב והוספת פתרון הדופק עבור הכלים הנותרים במרווחי זמן של דקה אחת. בדיוק 11 דקות ועל כל הכלים הבאים, על פי ערכת מרדף הדופק, למעט מדגם מרדף אפס דקות, להוסיף שני מיליליטר של מרדף בינוני ישירות לצלחת. שאפו את מדיום המרדף והחליפו אותו בשני מיליליטר של מדיום מרדף טרי.
חזור על תהליך זה עבור כל המנות הנותרות במרווחי זמן של דקה אחת. כאשר טיימר קורא בדיוק 16 דקות, להוסיף שני militers של מרדף בינוני ישירות לצלחת מרדף אפס דקות, על גבי מדיום הדופק, כדי להפסיק לתייג. מיד שאף את המדיום.
מעבירים את המנה לצלחת אלומיניום מקוררת ומוסיפים שני מיליליטר של חיץ עצירה קרה כקרח. מעבירים את כל המנות האחרות לאנקובטור ב-37 מעלות צלזיוס. מעבירים כל צלחת מרדף חזרה מהחממה לאמבט המים שתי דקות לפני סוף כל זמן מרדף.
בזמן המרדף המדויק לכל מנה, שאפו את מדיום המרדף והעבירו את המנה לצלחת אלומיניום מקורר. הוסף שני מיליליטר של חיץ עצירה קרה קרח. השאירו את כל הכלים על קרח ועצרו את החיץ עד שיש זמן לריס התאים.
לאחר מכן שאפו את פתרון התחנה ושטפו את כל הכלים. שלושה בו זמנית עם שני מיליליטר של תותח עצירה קרה כקרח. שאפו את פתרון העצור לחלוטין והוסיפו 600 מיקרוליטרים של מאגר תיזה לשתי מנות בכל פעם.
באמצעות מגרד תא, לגרד את פני השטח של המנה ביסודיות, אבל בעדינות לערבב את lysate. מעבירים ליסנט מכל מנה לצינור צנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר מיקרו. צנטריפוגה ב 15, 000 עד 20, 000 G בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי גלולה הגרעינים.
למרדף הדופק על תאים מתלים לאסוף חמישה מיליון תאים לנקודת זמן בצינור אחד 50 מיליליטר. בצע את הליך הרעב כמתואר בטקסט. לאחר הליך רעב באמבט המים במשך 15 דקות, להתחיל את טיימר.
בדיוק דקה אחת, להוסיף 275 microcuries של תווית לא מזוהה ישירות לצינור המכיל תאים מערבולת לערבב. בדיוק 11 דקות, להוסיף ארבעה מיליליטר של מדיה מרדף כדי לעצור את התיוג. ומיד להעביר מיליליטר אחד לצינור 15 מיליליטר על קרח המכיל תשעה מיליליטר של פתרון עצירה קרה קרח להפסיק תיוג.
חזור על תהליך זה של העברת מיליליטר אחד של מרדף לצינור על קרח המכיל תשעה מיליליטר של פתרון עצירה עבור כל נקודת זמן מרדף רצופה. לאחר immunoprecipitation, שאפו את הכביסה האחרונה לחלוטין. השהה מחדש את חרוזים ב- 20 מיקרוליטרים של מאגר TE ומערבולת.
הוסף 20 מיקרוליטרים של שני מאגר דגימת X ללא הסוכן המפחית. מערבולת הדגימות ולאחר מכן לחמם אותם ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. מערבולת הדגימות שוב.
צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת. העבר 19 מיקרוליטרים של על-טבעי שאינו מופחת לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי המכיל מיקרוליטר אחד של DDT 500 מילימולרי. במידת הצורך, צנטריפוגה המדגם במהירות, כך שכל הנוזלים נמצאים בתחתית.
וחום ב-95 מעלות צלזיוס לחמש דקות. תן לדגימה המופחתת להתקרר ואז למערבולת. צנטריפוגה הן דגימות מופחת ולא מופחת ב 12, 000 פעמים G בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת, ולאחר מכן להוסיף 1.1 microliters של NEM טוחנת אחת לכל הדגימות.
במחקר זה, גישה רדיואקטיבית של מרדף דופק משמשת לניתוח קיפול חלבונים והובלה בתאים שלמים. הקיפול וההפרשה של HIV GP120 אחד מרדף דופק חסיד מוצג כאן. הג'ל ללא הפחתת מראה את הקיפול החמצוני של GP120.
מיד לאחר תיוג הדופק, הוא מופיע כרצועה מפוזרת גבוה יותר בג'ל. ככל שהמרדף מתקדם, הלהקה נודדת במורד הג'ל דרך ביניים מתקפלים מפוזרים עוד יותר עד שהיא מצטברת ברצועה ההדוקה המייצגת מקופלת באופן מקורי ב- GP120. זה קורה כמו היווצרות של קשרים disulfide מגביר את הקומפקטיות של החלבון, גורם לו לנדוד מהר יותר מאשר חלבון מופחת לחלוטין.
על ג'ל הפחתת, קשרים disulfide וכל המולקולות הופחתו אינם משפיעים על מוליפטי. ככזה, הבדלים בניידות הם רק תוצאה של שינויים במסה המולקולרית. המעבר לאורך זמן מהצורה המופחתת של פפטיד אות לצורת מחשוף פפטיד אות מופחת מייצג את מחשוף פפטיד האות שלאחר התרגום של GP120.
הניידות עולה עקב אובדן האות פפטיד אשר מגביר במהלך המרדף כמו חלבונים נוספים להשיג את הקיפול המקומי ולאבד פפטיד האות שלהם. הן על ג'ל ללא הפחתה והפחתה, האות מתחיל לרדת משעה אחת ואילך עקב הפרשת GP120. ניתן לפקח על פעולה זו על-ידי ניתוח המדיה.
שיטה זו חלה על כל קו תא, כולל מודלים של תאים אורגנואידיים. אבל ההצלחה תלויה מאוד ברמת הביטוי של חלבון העניין. לפני תחילת הליך זה, לסמן את הכלים שלך ולשמור על הסדר הזה לאורך כל הניסוי.
ודא שהכל מוכן לפני הוספת אמצעי רעב. זו ההתחלה של הניסוי. ותזמן המעבדה שלך הוא חבר שלך, אבל יכול להיות האויב הגדול ביותר שלך כאשר אתה לא מוכן.
המרדף של ביל יכול להיות משולב עם פרוטוליזה מוגבלת כדי לחקור את האחוזה המלאה של חלבונים עם הזמן. גם שיטות שונות של מקפיאים נבחרים יאפשרו ניתוח של הבדלי שטיפה או הקפדה או טעינה. כדי להגן על החוקר ועל המנגנון, יש לציית לכל כללי בטיחות הקרינה המקומיים.
ויש לנקוט באמצעי הגנה בהתאם לפרוטוקול. שים לב כי האקרילמיד שלך, המשמש עבור דף STH שלך הוא נוירוטוקסי.
