אנו מודים jonna אליס לסיוע המערכת. הפרויקט המתואר נתמך על ידי מספר פרס R01MH079751 (PI: פ Peruzzi) מהמכון הלאומי לבריאות הנפש. התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות הנפש או מכוני הבריאות הלאומיים.

1. פולי-D-ליזין (PDL): הכנת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל סטרילי DDH 2 O ל 5 מ&quot;ג של PDL להשיג פתרון מלאי של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים פתרון המניות על ידי pipetting מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש מיד או לאחסן פולי-D-ליזין פתרון ב 2-8 ° C. </li></ol> 2. פולי-D-ליזין (PDL): תא ציפוי פלסטיק צלחות תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הפתרון המניות PDL עם סטרילית DDH 2 O לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה פתרון מספיק לתוך צלחת 60 מ&quot;מ כדי לכסות את פני התרבות באזור (3 מ&quot;ל למנה 60 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטלטל בעדינות, כדי להבטיח גם ציפוי של משטח התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לוחות מצופים בטמפרטורת החדר (RT) למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, בדרך כלל יום של דיסקציה, להסיר את הפתרון Poly-D-ליזין ידי השאיפה ולשטוף לזמן קצר עם 3 מ&quot;ל של סטרילית DDH 2 א &#39; חזור על פעולה זו. לאחר שטיפה 2, להסיר במים לחלוטין על ידי שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">צלחות ניתן לאחסן 4 ° C עד שלושה שבועות. </li></ol> 3. פולי-D-ליזין (PDL) ו Laminin: הכנת ציפוי של זכוכית דו קאמרית שקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים PDL (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ו laminin (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) מניות פתרונות סטרילית DDH 2 O לריכוז סופי של 10 ו 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה פתרון מספיק לתוך הבארות של זכוכית דו קאמרית שקופיות כדי לכסות את פני התרבות באזור (1 מ&quot;ל על כן כל אחד כוס 2 גם 2, חדר שקופיות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטלטל בעדינות, כדי להבטיח גם ציפוי של משטח התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לוחות מצופים ב RT בן לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הבא, להסיר את הפתרון Poly-D-ליזין, Laminin ציפוי באמצעות השאיפה ולשטוף בקצרה פעמיים עם 1 מ&quot;ל של סטרילית DDH 2 א &#39; לאחר שטיפה 2, להסיר במים לחלוטין על ידי שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות קאמרית ניתן לאחסן 4 ° C עד שלושה שבועות. </li></ol> הערה: כל שקופית תא זכוכית יכול להיות מצופה followinגרם בפרוטוקול זה. אנו משתמשים בדרך כלל את שתי קאמרית שקופיות כי כל שקופית מספק הגדרה השליטה בדיקה ניסיונית (למשל מטופל מול מטופלים, לעומת untransfected transfected). 4. Dissection תרבות עצבי ו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את ריאגנטים הבאים אמבט 37 ° C מים: <ul type="disc" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TrypLE אקספרס על הבקבוק המקורי שלה 100 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Neurobasal/B27 בינוני שלם (ראה טבלה אני). נפח חימם תלוי במספר מנות להיות מצופה (למשל 30 מ&quot;ל במשך עשר מנות מצופה 60 מ&quot;מ). </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של תמיסת קר E שינה לארבעה 60 תרבות מנות מ&quot;מ ו 13 מ&quot;ל ל 15 מ&quot;ל BD צינור פוליפרופילן פלקון בהירות גבוהה חרוטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25-30 מ&quot;ל של מדיום לנתיחה קר (ראה טבלה II, ד&quot;ר אולימפיה מאוצ&#39;י, תקשורת אישית) לכל אחת משלוש מנות 100 מ&quot;מ תרבות. הצלחות אלה, המכילים כמות גדולה של המדיום, ישמש כדי לשטוף את העוברים מיד אחרי שלהםהסרת מתוך שקי מי השפיר (שלבים 4.7 ו -4.8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חולדה E17 מתוזמן הרה CO 2 על פי מדיניות שירותי בריאות הציבור על טיפול שימוש אנושי של חיות מעבדה ותחת טיפול בבעלי חיים אישרה מוסדית ולהשתמש בפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסס בבטן התחתונה עם EtOH 70% וחותכים מדיאלית דרך העור והשרירים עם זוג מספריים החושפים את הרחם ואת העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל העוברים ומניחים אותם בצלחת 100 מ&quot;מ סטרילית המכילה עודף בינוני לנתיחה קר (25-30 מ&quot;ל, ראה שלב 4.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור עוברים באמצעות מספריים קטנים של שק השפיר ומניחים אותם בצלחת 100 מ&quot;מ 2 המכיל בינוני לנתיחה קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העוברים בטמפרטורת החדר על ידי מנה מטה בעדינות 100 מ&quot;מ במשך 5-10 שניות. לאחר מכן, להעביר את העוברים שטופים לצלחת 100 מ&quot;מ המכיל 3 בינוני לנתח. שתי שוטף במצע עודף בדרך כלל מספיק כדי להסיר את כל עקבות של דם. עם זאת, אם NECessary, לשטוף פעם נוספת באמצעות מאכל טריים 100 מ&quot;מ המכילים 25-30 מ&quot;ל של מדיום לנתיחה קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים סטראו ועקומים, לחלץ המוח כל העובר של החולדה על ידי תלישת עור הגולגולת. מניחים המוח כולו באחד 60 מ&quot;מ צלחות (בדרך כלל, עם לא יותר מ 5 מוחות לכל מנה) עם הקור שינה א &#39;שמור את הצלחות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו מנה אחת בכל פעם, תחת מיקרוסקופ לנתח, להפריד בין ההמיספרות ולבודד את קליפת המוח הסרת המוח התיכון ואת קרומי המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: מוח חתך לאורך קו האמצע, לחלץ hippocampi ובצע את ההליך שלהלן כדי לבודד נוירונים בהיפוקמפוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את כל קליפת המוח ניתוחים צינור של 15 מ&quot;ל חרוטי ברור המכיל 13 מ&quot;ל של שנת חורף קר א &#39;השאירו את קליפת המוח על קרח עד שכל והניתוחים הושלמו. בשל גודלם הזעיר, hippocampi גזור ניתן לאסוף בצינור Eppendorf 1.5-מ&quot;ל במקום השפופרת של 15 מ&quot;ל. אם רוצים, על זה צעד אחד או קליפת המוחhippocampi ניתן לשים צלוחית cryotube המכילה 1 מ&quot;ל של שינה E + 2% B27 + גנטמיצין (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) + Fungizone (250 ng / ml) ביחס של 2-4 או 2-4 הקורטקס hippocampi לכל בקבוקון. רקמת המוח ניתן לאחסן 4 ° C בחושך עד שבוע 1 (מאוחר יותר פעמים לא נבדק עדיין). בעת הצורך, להשתמש במלקחיים עדינים להעביר את רקמת המוח צינור המכיל 15 מ&quot;ל שינה E ולאחר מכן בצע את הפרוטוקול שלהלן כדי לבודד את הנוירונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הצינור אל מכסה המנוע בתרבית רקמה. אפשר ליישב את קליפת המוח לחלק התחתון של הצינור ואז להסיר בזהירות supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 13 מ&quot;ל של E שינה טרי צינור של 15 מ&quot;ל חרוטי, לאפשר הקורטקס להתיישב בחלק התחתון של הצינור בזהירות להסיר את supernatant. חזור על פעולה זו 2 פעמים, ואחרי הכביסה שעברה, להסיר בזהירות את כל התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Enzymatically לעכל בקורטקס המוח על ידי הוספת 1-2 מ&quot;ל (תלוי במספר של קליפת המוח, להשתמש פחות בידוד hippocampi) של TR חמיםypLE Express. סוגרים את המכסה של הצינור עם Parafilm ולצוף את הצינורית אמבט 37 ° C מים במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסס את הצינור עם אתנול 70% לפני פתיחת המכסה ומוסיפים 10 מ&quot;ל של שינה א &#39;אפשר ליישב את קליפת המוח בחלק התחתון של הצינור ולהסיר supernatant. חזור על פעולה זו שלוש פעמים כדי לשטוף את TrypLE Express. בשלב האחרון, להסיר בזהירות את כל התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות triturate (4-5 פעמים) הקורטקס של 2 מ&quot;ל של מדיום Neurobasal/B27 מלאה באמצעות אש זכוכית מלוטשת פסטר (כ 1 מ&quot;מ קוטר). להיזהר כדי למנוע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על עוד 4-5 פעמים עם כוס סטרילית פיפטה פסטר קטן יותר בקוטר (כלומר פיפטה כ 1/2-3/4 מ&quot;מ קוטר). אין להשתמש פיפטה פסטר קטן יותר מאשר זה או זה יהרוס את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר חתיכות הנותרים של רקמות (בדרך כלל מעט מאוד, אם בכלל) להתיישב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה העליון מתחיל מתא בודד לצינור 15 מ&quot;ל חדש, והותיר אחריו התיישבו חתיכות של רקמת גוף. פרווהיס לדלל את ההשעיה התא עד 10-12 מ&quot;ל עם מדיום Neurobasal/B27 מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב לדלל תאים עבור מונה על ידי הוספת 10 μl של השעיה תא μl 490 הפתרון ספירת 50x (ראה לוח ג) ב 1.5 מ&quot;ל Eppendorf צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת התאים על PDL מצופים לוחות בצפיפות של 5.0 x 10 4/2 ס&quot;מ. אם nucleofection יש לבצעם, אנו ממליצים על הציפוי בתאים בריכוז גבוה (8-10 x 10 4 / cm 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל, אנחנו מחלקים 9-10 עוברים בכל ניסוי, כמו בערך 13 x 10 6 נוירונים נגזרות העובר E17 זה. אם עוברים יותר יש צורך, לוודא כי כל התהליך לא נמשך יותר משעתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם רוצים, 24 שעות לאחר הבידוד, 10 מיקרומטר של ציטוזין-β-D-arabinofuranoside (AraC) ניתן להוסיף כל מאכל, כדי למנוע התפשטות גליה. עם זאת, שלב זה אינו נחוץ מאחר Neurobasal/B27 בינוני מעכב התפשטות גליה, לפי המלצות היצרן (Invitrogen / Gibco). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנוירונים יכול לשמש בניסויים לאחר 4-5 ימים במבחנה, אך הזמן המדויק תלוי בשלב בידול הרצוי. יש לנו נוירונים בתרבית של עד 4 שבועות ללא ירידה משמעותית בהישרדות (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור culturing המורחבת, להחליף בינוני culturing כל שבוע עם המדיום Neurobasal/B27 מוכן טרי שלם. </li></ol> 5. נציג תוצאות נוירונים בתרבית בשקופיות קאמרית זכוכית יכולה להיות נתונה immunocytochemistry. איור 1 מציג תמונה אופיינית של נוירון קורטיקלי קבוע לאחר חמישה ימים של תרבות immunolabeled עם נוגדן אנטי-MAP-2 כדי להראות תהליכים עצביים. תרשים 2 מציג תמונה מייצגת של תא עצב בהיפוקמפוס חולדה לאחר 3 שבועות בתרבות. מורפולוגיה העצבית של התא הבדיל באופן מלא מסומן על ידי MAP-2 אניmmunolabeling (MAP-2 סמן העצבית, נוגדן חד שבטי העכבר שיבוט AP-20, ג&#39;ין טקס, אירווין, קליפורניה), בעקבות הליך רגיל כפי שתואר קודם 1. התמונות היו דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי Eclipse E400 Nikon זקוף מצויד EXI אקווה המצלמה (Qimaging), ממונע Z-ציר ולאחר SlideBook5 הרכישה / deconvolution תוכנה (Intelligent הדמיה Innovations, Inc, דנוור, CO). סדרה של תמונות תלת ממדיות של כל תמונה אישית היו deconvoluted לתמונה דו מימדי אחד נפתרה על ידי התאמת אות חתך כדי בעוצמה מקסימלית קרוב להגדיל את הרזולוציה. איור 3 מציג טוהר תרבויות עצביים. Lysates חלבון התקבלו DIV7 תרבויות חולדה עצביים (ctx) וממנה במקרה של גליובלסטומה האנושי (GBM). כצפוי, lysate העצבית היא חיובית מאוד של חלבון העצבית MAP-2 ו שלילי GFAP סמן astrocytic, בעוד lysate חלבון GBM היא שלילית ואו MAP-2 חיובי עבור GFAP. למרות בפרוטוקול שלנו אנו עושים שימוש E שינה במשך כמה שנים לנתח ושטיפה בינוני, לאחרונה אנו בחנו שימוש נוסף ומעשי מאוד זה לשמור על רקמות המוח לשימוש נוסף. איור 4 ממחיש כמה ימים במבחנה 5 (DIV5) התרבות של נוירונים בקליפת המוח של עכברים מבודד הקורטקס שמרו על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע אחד שינה E + B27 לאחר דיסקציה המקורי שלהם העובר. נוירונים היו מצופה על זכוכית דו קאמרית השקופית מצופה PDL ו laminin כפי שתואר לעיל. התמונה רכשה היה deconvoluted באמצעות רכישת SlideBook5 / תוכנה deconvolution כמתואר לעיל (איור 2). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig1.jpg" /> באיור 1. התמונה נציג תא עצב בקליפת המוח nucleofected עם pmaxGFP (Amaxa, Lonza, Walkersville, MD) ו immunolabeled עם MAP-2 נוגדנים, באדום. ההגדלה המקורי 100x. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig2.jpg" /> איור 2. תמונת מראה נציג MAP-2 immunolabeling, באדום, של נוירונים בהיפוקמפוס לאחר 3 שבועות בתרבות. מכתים DAPI, בכחול, מראה גרעיני התאים. ההגדלה המקורי 40X. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig3.jpg" /> 3. איור המערבי כתם מראה טוהר בתרביות תאים עצביים. 30 מיקרוגרם של נוירונים האדם חולדה lysates GBM, חלבון הופרדו על ידי אלקטרופורזה ו נתון ניתוח כתם המערבי בעקבות הליכים סטנדרטיים 1. Anti-MAP-2 היה ארנב polyclonal מן התא איתות (דאנוורס, MA), אנטי GFAP נוגדן חד שבטי העכבר היה מן Chemicon (Millipore, Billerica, MA), ועכבר חד שבטי נגד GRB2 נוגדנים היה ממעבדות BD התמרה ( ד&quot;ר ניצוצות). GRB2 שימש בקרת הטעינה. </p&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig4.jpg" /> באיור 4. נציג תמונות של ימים במבחנה 5 (DIV5) נוירונים בקליפת המוח של עכברים המתקבלים קליפת המוח שנותרו שינה E + B27 על 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע לאחר הניתוח שלהם. א) שלב ניגודיות של נוירונים בתרבית על משטח הזכוכית של שתי קאמרית שקופיות. ההגדלה המקורי 20X. ב) immunofluorescence מראה ביטוי של MAP-2 בתהליכים עצביים, בירוק, התרבות היה שלילי GFAP סמן astrocytic. מכתים DAPI, בכחול, מצביע על גרעין התא. ההגדלה המקורי 40X.

<ol>
	<li>Aprea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin-mediated+binding+of+human+immunodeficiency+virus-1+Tat+to+the+cytoskeleton+causes+proteasomal-dependent+degradation+of+microtubule-associated+protein+2+and+neuronal+damage.">Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage.</a> J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).</li><li>Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+culture+of+rat+post-natal+and+fetal+brainstem+neurons.">Serum-free culture of rat post-natal and fetal brainstem neurons.</a> Brain Res. Dev. Brain Res. 120, 199-210 (2000).</li><li>Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+serum-free+culture+of+late+fetal+and+early+postnatal+rat+brainstem+neurons.">Method for serum-free culture of late fetal and early postnatal rat brainstem neurons.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 6, 91-99 (2001).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+B27/neurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum,+substantia+nigra,+septum,+cerebral+cortex,+cerebellum,+and+dentate+gyrus.">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing nerve cells. , (1998).</li><li>Eletto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+SNAP25+expression+by+HIV-1+Tat+involves+the+activity+of+mir-128a.">Inhibition of SNAP25 expression by HIV-1 Tat involves the activity of mir-128a.</a> J. Cell Physiol. 216, 764-770 (2008).</li><li>Gualco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-IR-dependent+expression+of+Survivin+is+required+for+T-antigen-mediated+protection+from+apoptosis+and+proliferation+of+neural+progenitors.">IGF-IR-dependent expression of Survivin is required for T-antigen-mediated protection from apoptosis and proliferation of neural progenitors.</a> Cell Death Differ. 17, 439-451 (2010).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+differentiation+of+adult+neuronal+progenitor+cells+transplanted+to+the+adult+brain.">Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11879-11883 (1995).</li><li>Keyser, D. O., Pellmar, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+in+the+hippocampus:+critical+role+for+glial+cells.">Synaptic transmission in the hippocampus: critical role for glial cells.</a> Glia. 10, 237-243 (1994).</li><li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro.">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 (1997).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

שיטת לנתיחה והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדות ועל קליפת המוח המתואר כאן מאפשר ביצוע ניסויים באמצעות תרביות נוירונים טהורים כמעט שגודלו בינוני הגדרה כימית (איור 3). אף על פי פרוטוקולים של נוירונים culturing טהורים כמעט בסרום ללא מדיה תוארו בעבר 2,3,4, י...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> ריכוז </td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> 98% </td></tr><tr><td> B27 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 0.5 מ&quot;מ </td></tr></tbody></table> לוח ט Neurobasal/B27 שלם בינוני. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> ריכוז </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 16 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 22 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 160 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 2 </td><td> 0.22 mM </td></tr><tr><td> גנטמיצין </td><td> 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr&gt; <tr><td> Fungizone </td><td> 250 ng / mL </td></tr><tr><td> ה-pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td> Osmolarity </td><td> 320-330 mOsm </td></tr></tbody></table> לוח ב. דיסקציה בינוני. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> נפח (μl) </td></tr><tr><td> Neurobasal/B27 שלם בינוני </td><td> 240 </td></tr><tr><td> Trypan כתם כחול 0.4% </td><td> 250 </td></tr><tr><td> סך הכל </td><td> 490 </td></tr></tbody></table> לוח ג. 50x ספירת פתרון. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> החתול. מספר </td></tr><tr><td> שינה E </td><td> Brainbits </td><td> 767171 </td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> גנטמיצין סולפט </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> G1264 </td></tr><tr><td> Glutamax 200 מ&quot;מ </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> TrypLE Express W / O פנול אדום </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 12604 </td></tr><tr><td> ציטוסין-β-D-arabinofuranoside hydrochloride </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> C6645 </td></tr><tr><td> פולי-D-ליזין </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminin 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> Trypan כתם כחול 0.4% </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15250 </td></tr></tbody></table&gt; לוח ד. חומרים כימיים מסוימים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ציוד </td><td> חברה </td><td> החתול. מספר </td></tr><tr><td> סטריאו מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> SZ61 </td></tr><tr><td> מלקחיים גדולים </td><td> FST </td><td> 11022-14 </td></tr><tr><td> בסדר שקצהו מלקחיים </td><td> מוריה </td><td> MC40B </td></tr><tr><td> מיקרו בסדר שקצהו מלקחיים </td><td> מוריה </td><td> MC31 </td></tr><tr><td> חדות כתער מספריים </td><td> Roboz </td><td> RS-6820 </td></tr><tr><td> מספריים המבתרים מיקרו </td><td> FST </td><td> 91460-11 </td></tr><tr><td> מיקרו הביתור מספריים עקומים </td><td> FST </td><td> 14067-11 </td></tr><tr><td> זכוכית 2-קאמרית שקופיות </td><td> Lab-Tek </td><td> 154461 </td></tr><tr><td> 60 מנות מ&quot;מ </td&gt; <td> BD פלקון </td><td> 353002 </td></tr><tr><td> 100 מנות מ&quot;מ </td><td> קורנינג </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 15 מ&quot;ל צינורות </td><td> BD פלקון </td><td> 352099 </td></tr><tr><td> 1.5 מ&quot;ל cryo-צינור בקבוקון </td><td> Nunc </td><td> 375353 </td></tr></tbody></table> לוח ו &#39;ספציפית ציוד.

isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol

אנו מתארים שיטה מהירה לנתק ותרבות נוירונים בהיפוקמפוס או קליפת המוח של E15-17 עוברי עכברים. ההליך יכול להיות מיושם בהצלחה את הבידוד של העכבר הנוירונים העיקריים אדם אבות עצביים. נוירונים ניתק נשמרות בינוני סרום ללא עד מספר שבועות. תרבויות אלה יכולים לשמש nucleofection, immunocytochemistry, חומצות גרעין הכנה, כמו גם electrophysiology. תרבויות נוירונים מבוגרים יותר ניתן גם transfected עם שיעור יעיל על ידי התמרה lentiviral ו, פחות יעיל, עם סידן פוספט או שומנים על בסיס שיטות כגון lipofectamine.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol at JoVE.com

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

אנו מתארים מתודולוגיה מהירה לבודד ותרבות נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח של עוברי מכרסמים. פרוטוקול זה מאפשר לנו לבצע ניסויים שבהם תרבויות עצביים כמעט טהור נדרשים.

בידוד והתרבות של תאים עובריים עצביים עכברוש: ​​פרוטוקול מהיר

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

isolation-and-culture-of-rat-embryonic-neural-cells-a-quick-protocol

Research

JoVE Journal

Neuroscience

38.0K Views.  LSU Health Sciences Center - New Orleans. אנו מתארים מתודולוגיה מהירה לבודד ותרבות נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח של עוברי מכרסמים. פרוטוקול זה מאפשר לנו לבצע ניסויים שבהם תרבויות עצביים כמעט טהור נדרשים.

Video: Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

בידוד הרחבה של תאים בוגרים עכבר גזע עצביים שימוש Assay Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

בידוד ותרבות של תאי גזע עצביים קרסט מזקיקי שיער אנושיים

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

לקטינים מבוססי בידוד תרבות Motoneurons עכבר עובריים

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple stimuli and complex chemical molecules contained in foods. In human, individual fungiform papillae contain from zero to as many as 20 taste buds. There is no established protocol for culturing human taste cells, although the ability to maintain taste papillae cells in culture for multiple cell cycles would be of considerable utility for characterizing the molecular, regenerative, and functional properties of these unique sensory cells. Earlier studies of taste cells have been done using freshly isolated cells in primary culture, explant cultures from rodents, or semi-intact taste buds in tissue slices1,2,3,4. Although each of these preparations has advantages, the development of long-term cultures would have provided significant benefits, particularly for studies of taste cell proliferation and differentiation. Several groups, including ours, have been interested in the development and establishment of taste cell culture models. Most attempts to culture taste cells have reported limited viability, with cells typically not lasting beyond 3-5 d5,6,7,8. We recently reported on a successful method for the extended culture of rodent taste cells9. We here report for the first time the establishment of an in vitro culture system for isolated human fungiform taste papillae cells. Cells from human fungiform papillae obtained by biopsy were successfully maintained in culture for more than eight passages (12 months) without loss of viability. Cells displayed many molecular and physiological features characteristic of mature taste cells. Gustducin and phospholipase C &beta;2, (PLC-&beta;2) mRNA were detected in many cells by reverse transcriptase-polymerase chain reaction and confirmed by sequencing. Immunocytochemistry analysis demonstrated the presence of gustducin and PLC-&beta;2 expression in cultured taste cells. Cultured human fungiform cells also exhibited increases in intracellular calcium in response to appropriate concentrations of several taste stimuli indicating that taste receptors and at least some of the signalling pathways were present. These results sufficient indicate that taste cells from adult humans can be generated and maintained for at least eight passages. Many of the cells retain physiological and biochemical characteristics of acutely isolated cells from the adult taste epithelium to support their use as a model taste system. This system will enable further studies of the processes involved in proliferation, differentiation and function of mammalian taste receptor cells in an in vitro preparation.
Human fungiform taste papillae used for establishing human fungiform cell culture were donated for research following proper informed consent under research protocols that were reviewed and approved by the IRB committee. The protocol (#0934) was approved by Schulman Associates Institutional Review Board Inc., Cincinnati, OH. Written protocol below is based on published parameters reported by Ozdener et al. 201110.

We aimed to develop a reproducible protocol for isolating and maintaining long-term cultures of human fungiform taste papillae cells. Cells from human fungiform papillae obtained by biopsy were successfully maintained in culture for more than eight passages (12 months) without loss of viability.

בידוד והתרבות של האדם בחוש הטעם תאים Fungiform גבשושיות

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissection, תרבות וניתוח של<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; רקמת רשתית עוברית

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

בידוד והתרבות של תאים עובריים עצביים עכברוש: ​​פרוטוקול מהיר

בידוד והתרבות של תאים עובריים עצביים עכברוש: פרוטוקול מהיר