אנו מודים Winkelbauer מ-הארט, א איברהים, פ ולנסיה, ק Dufu, ה &#39;נג לדיונים מועילים. תאים הלה התקבלו התרבות הלאומית Cell מרכז (מיניאפוליס, מינסוטה). כמו כן, אנו מודים Eisai Co, Ltd למתן E7107 ו דימות Nikon מרכז בבית הספר לרפואה בהרווארד לעזרה עם מיקרוסקופ אור. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH GM043375 כדי RR ו EGF ו NRSA העמיתים JLH.

1. הלה התאים גוברת להפקת נשק גרעיני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת תאים הלה על שלוש צלחות 150 מ&quot;מ עם DMEM התקשורת השלימו עם 10% ו 1% FBS פניצילין / סטרפטומיצין. לגדול ב 37 ° C חממה עם CO 2 עד 5% תאים הם confluent 90%. </li></ol> טיפ, פיצול תאים 1:10 מהצלחת היבול confluent ו -3 ימים לאחר פיצול. עצה, צלחת נוספת ניתן לגדל במקרה שאין מספיק תאים עם שלוש צלחות (לדוגמה, אם התאים הם פחות מ 90% confluent). 2. הכן וצננו פתרונות תמצית גרעיני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין פתרונות טריים כמתואר בטבלה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 10 מ&quot;ל של מאגר hypotonic לתוך צינור פלקון 15 מ&quot;ל. Aliquot 1 מ&quot;ל של מאגר מלח גבוהה 1 מ&quot;ל של מאגר דלת מלח לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל Eppendorf. לצנן את מאגרים על קרח. מוסיפים את כמויות מתאימות של PMSF ו DTT למאגר זה מיד לפני השימוש (ראה <strong&gt; לוח 1). </li></ol> 3. איסוף תאים הלה להפקת גרעיני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate מדיה מן התאים ולשטוף את התאים פעם אחת עם 13 מ&quot;ל של בטמפרטורת החדר 1X PBS לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate לשטוף PBS. </li></ol> עצה, לשאוב כמה שיותר PBS ככל האפשר על ידי aspirating 1, ולאחר מכן עומדת צלחת בצד שלה, מחכה כמה שניות, ו aspirating את השאר. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מרים התא, מגרדים תאים לקצה התחתון של הצלחות, ולאחר מכן להעביר את התאים צינור Eppendorf. להימנע בועות. 3 לוחות של תאים השרוטות צריך להתאים את צינור 1 1.5 Eppendorf מ&quot;ל. </li></ol> עצה, קל יותר להעריך את עוצמת הקול של תאים אם צינור Eppendorf משמש. על סולם, השתמש צינורות פלקון. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת על 4 מעלות צלזיוס microfuge במשך 5 דקות ב 100 XG כדי גלולה התאים. </li></ol> 4. יופי תאים הלה במאגר hypotonic </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב PBS מן התא גלולה ולהעריך את נפח תא ארוז (PCV) על ידי הסתכלות על הדרגתיות על הצינור. שלוש צלחות confluent של תאים הלה לוותר על 500 μl של PCV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פי 2 PCV מאגר hypotonic כדי גלולה התא. לוחצים בעדינות resuspend התאים. השתמש Pipetman P1000 בעדינות resuspend את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה אם יש צורך בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת על 4 מעלות צלזיוס microfuge במשך 5 דקות ב 100 XG כדי גלולה התאים. * התאים יהיה החלו להתנפח בזמן הזה, לבין נפח התא צריך להיות עכשיו על μl μl-1000 750. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב מאגר hypotonic ולהוסיף מאגר hypotonic חדש בנפח סופי של 1.5 מ&quot;ל. Resuspend התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים נפוחים resuspended על קרח למשך 10 דקות. </li></ol> 5. Lyse תאים באמצעות Homogenizer Dounce <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מאגר hypotonic לשטוף dounce ולאחר מכן לצנן אותו על קרח. נגב יבש העלי עם WIP משימה עדינהER (למשל Kimwipe). הסר חוצץ הנותר מן dounce באמצעות 1000 micropipette μl עצה המורחבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים נפוחות לתוך dounce. לאט לאט להזיז את העלי חזק של dounce למעלה ולמטה 5 פעמים כדי lyse התאים, להיות זהיר, כדי למנוע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay עבור תמוגה התא באמצעות aliquot 5 μl של תאים dounce. מניחים את aliquot בצינור Eppendorf ומוסיפים נפח שווה של Trypan כחול. מכניסים את התערובת על שקף ולבדוק את התאים באמצעות מיקרוסקופ אור. גרעינים של תאים lysed יופיע כחול. כ -90% תמוגה הוא אידיאלי. </li></ol> עצה, מספר הפעמים התאים יש dounced ישתנה בהתאם אטימות של dounce. בעת ביצוע בפרוטוקול זה בפעם הראשונה, לקבוע את מספר פעמים כדי dounce ידי ביצוע צעד 5.3 לאחר שבץ כל אחד עם dounce. לא יתר על המידה dounce, douncing מוגזמת תהרוס גרעינים. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים lysed כדי מראש Chilleד Eppendorf הצינור ספין 4 ° C microfuge 5 דקות ב 1500 x גרם. גלולה המכילה את הגרעינים. בזהירות להעביר supernatant לצינור חדש מבלי לשבש את הגרעינים. Supernatant מכיל את הציטופלסמה. </li></ol> עצה, הציטופלסמה יכול לשמש הוא או עיבוד נוסף כדי S100 באמצעות ספין אותו במהירות גבוהה המשמש תמציות בתפזורת (ראה 1 להכנת S100 פעיל מ תמציות בתפזורת). 6. מלח חלץ את גרעיני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאמוד את היקף גרעיני ארוז (PNV) על ידי הסתכלות על הדרגתיות על הצינור. PCV של μl 500 בדרך כלל מניבה PNV של μl 400. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ½ X PNV של מאגר מלח נמוכה כדי גרעינים ידי הוספת טיפ micropipette לחלק התחתון של הצינור ולאט לאט גמירה לתוך מאגר גרעיני תוך ערבוב בעדינות. לא pipet מעלה ומטה. קפיצי בעדינות את הצינורות על מנת לוודא כי היא גלולה resuspended לחלוטין לפני המשך הצפת דלת מלח. </li> &lt;li&gt; הוסף ½ X PNV של מאגר מלח גבוהה ובמהירות לערבב 1 זמן על ידי צינור היפוך. לא לרעוד. סיבוב על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li></ol> עצה לעתיד עדין עם גרעינים כאשר הם מאגר מלח גבוהה, כדי למנוע lysing אותם. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין על 4 מעלות צלזיוס microfuge במשך 15 דקות על 18,000 X גרם. Supernatant הוא תמצית מלח גבוהה גרעינית (HS-NE). שלוש צלחות של תאים בדרך כלל תשואה 500-600 μl של HS-NE. </li></ol> 7. להתרכז Dialyze תמצית גרעיני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 500 μl של HS-NE לתוך צונן מיני centricons (Amicon) ו - 50 דקות ספין על 4 מעלות צלזיוס microfuge על 14,000 X גרם. מרחב מיני centricon (Amicon) ולמקם אותו צינור Eppendorf חדש. ספין דקות 2 ב 4 ° C 1000 XG להתאושש HS-NE. HS-NE יהיה מרוכז כדי μl כ 115. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש Pipetman P200, להעביר 45 aliquots μl של HS-NE לתוך מיני דיאליזה Slide-A-Lyzers, ומניחים אותם 500 מ&quot;ל של מאגר דיאליזה צונן. ודא התחתון של Slide-A-Lyzer מיושר עם החלק התחתון של מצוף. מערבבים במשך 1-2 שעות ב 4 ° C. NE יופיעו מעונן אחרי דיאליזה. </li></ol> עצה, האם לא צנטריפוגות כדי להסיר משקע עכור הוא ציין כי לאחר דיאליזה, כמו צנטריפוגה זה מפחית את הפעילות של מיצוי. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NE ניתן להשתמש מיד או aliquoted. Aliquots יש פלאש קפואים בחנקן נוזלי המאוחסן ב -80 ° C. NE ניתן לאחסן לעבור לפחות שני מחזורי ההפשרה ההקפאה, מבלי לאבד את הפעילות. </li></ol> 8. נציג תוצאות לאחרונה, יעילה במערכות חוץ גופית עבור צימוד שעתוק RNAP השני שחבור פותחו 2-5. מערכות אלו מועסקים תאים הלה גדל בכמויות גדולות ולכן הם לא מקובל במהירות לבחון את ההשפעות של טיפולים תאיים ספציפיים על דוגמאות רבות. על בסיס זה צריךND השירות הכללי של פרוטוקול בקנה מידה קטן תמצית (ראו דיון), הקמנו שיטה חזקה בקנה מידה קטן תמצית גרעיני. נציג נתונים המשווים II RNAP שעתוק / שחבור התגובה בתמצית בקנה מידה קטן גרעינית עם תמצית גרעיני בתפזורת מוצג באיור 2. CMV-DNA מבנה, המכיל מקדם CMV ו encodes המצע שחבור רגיל (FTZ 3, איור 2 א) שימש לניתוח. כאשר מבנה הודגר בכמויות גדולות (1-3 נתיבים) או בקנה מידה קטן (4-6 נתיבים) תמצית, רמות דומות של המתהווה מראש mRNA היו מסונתז על ידי נקודה 5 דקות זמן (איור 2, מסלולים 1 ו -4 ). בעקבות תוספת של α-amanitin לחסום שעתוק נוסף, את ביניים שחבור ומוצרים החתוכות שנצבר לאורך זמן עם קינטיקה דומה בשני סוגי תמציות (איור 2, נתיבי 2, 3, 5, 6). תוצאות אלו מייצגות מראים את היעילות של ההפיכה<html> LED RNAP II שעתוק / שחבור מערכת דומה תמציות גרעיני בתפזורת ואת בקנה מידה קטן. כדי להדגים את התועלת של השיטה בקנה מידה קטן תמצית, תמציות הוכנו מתאי הלה שטופלו במעכבי שחבור, E7107, או שליטה שלילית מתחם pladienolide F 6,7 ואז RNAP מצמידים II שעתוק / שחבור assay בוצע. כפי שניתן לראות באיור 3, שעתוק על ידי RNAP השנייה התרחשה ביעילות תמציות שהוכנו F הן Pladienolide ו E7107 תאים שטופלו (10 נקודות זמן דקות). לעומת זאת, שחבור התרחשו בדרך כלל תמצית מוכנה מ-F-שטופלו בתאים Pladienolide אך בוטל ב E7107 שטופלו בתאים (איור 3, 20-60 דקות נקודות זמן). נתונים אלה מספקים הוכחה של מושג על שימוש בקנה מידה קטן תמציות גרעיני לטיפול מיוחד של תאים בקנה מידה קטן. jpg &quot;/&gt; באיור 1. סכמטי של פרוטוקול בקנה מידה קטן חלץ. שלב P1. התאים גדלים כמו monolayers, קוצרים הצלחות באמצעות מרים תא נפוחות על ידי תוספת של מאגר hypotonic. שלב P2. תאים lysed באמצעות homogenizer Dounce ו centrifuged כדי גלולה גרעינים. שלב P3. גרעינים מופרדים בציטופלסמה ועוברים תעשיית מלח. שלב P4. תמצית גרעיני מרוכזת ו dialyzed. שלב P5. תוצאות מתקבלים המראים כי תמציות גרעיני תפקודית (ראה איור 2 מפורטת יותר). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig2.jpg" /> איור 2. בקנה מידה קטן תמציות גרעיני הם חזקים ב assay RNAP מצמידים שעתוק / שחבור השנייה. א סכמטי של תבנית CMV-FTZ דנ&quot;א המשמש מצמידים RNAP II שעתוק / שחבור. האמרגן CMV ואת הגדלים של אקסונים ו אינטרון מצוינים. ב השוואת מצמידים RNAPהשנייה שעתוק / שחבור assay שימוש או תמצית גרעיני בתפזורת או בקנה מידה קטן תמצית גרעיני. α-amanitin נוסף לאחר 5 דקות של שעתוק שחבור הורשה להופיע על 30 ו - 60 דקות. RNA הופק ו מופרדים על ג&#39;ל 5% polyacrylamide denaturing ו זוהה על ידי phosphoimager. ביניים של שחבור ומוצרים מצוינים. אנדוגני U6 snRNA ו tRNA להציג בתמצית, וכי הם 32 P-שכותרתו במהלך הדגירה מצוינים. ר &#39;3 לפרוטוקול מפורט על מערכת RNAP מצמידים שעתוק / שחבור השנייה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig3.jpg" /> איור 3. בקנה מידה קטן תמציות גרעיני שהוכנו מתאי הלה שטופלו במעכבי שחבור התרופה E7107 פגומים ב שחבור. תאים טופלו Pladienolide מיקרומטר 3 F או E7107 כמותיאר 6 ולאחר מכן להשתמש כדי להכין בקנה מידה קטן תמציות גרעיני. במהלך הזמן בוצע באמצעות assay אותו שעתוק / שחבור כמו באיור 2. ביניים של שחבור ומוצרים, ואת U6 snRNA ו tRNA מצוינים.

<ol>
	<li>Krainer, A. R., Maniatis, T., Ruskin, B., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+and+mutant+human+beta-globin+pre-mRNAs+are+faithfully+and+efficiently+spliced+in+vitro.">Normal and mutant human beta-globin pre-mRNAs are faithfully and efficiently spliced in vitro.</a> Cell. 36, 993-1005 (1984).</li><li>Ghosh, S., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+in+vitro+synthesis+and+splicing+of+RNA+polymerase+II+transcripts.">Coupled in vitro synthesis and splicing of RNA polymerase II transcripts.</a> Rna. 6, 1325-1334 (2000).</li><li>Das, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coupling+of+RNAP+II+transcription+to+spliceosome+assembly.">Functional coupling of RNAP II transcription to spliceosome assembly.</a> Genes Dev. 20, 1100-1109 (2006).</li><li>Hicks, M. J., Yang, C. R., Kotlajich, M. V., Hertel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+splicing+to+Pol+II+transcription+stabilizes+pre-mRNAs+and+influences+splicing+patterns.">Linking splicing to Pol II transcription stabilizes pre-mRNAs and influences splicing patterns.</a> PLoS Biol. 4, e147 (2006).</li><li>Yu, Y., Das, R., Folco, E. G., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+in+vitro+system+for+co-transcriptional+splicing.">A model in vitro system for co-transcriptional splicing.</a> Nucleic Acids Res. 38, 7570-7578 (2010).</li><li>Kotake, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+factor+SF3b+as+a+target+of+the+antitumor+natural+product+pladienolide.">Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide.</a> Nat. Chem Biol. 3, 570-575 (2007).</li><li>Folco, E. G., Coil, K. E., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-tumor+drug+E7107+reveals+an+essential+role+for+SF3b+in+remodeling+U2+snRNP+to+expose+the+branch+point-binding+region.">The anti-tumor drug E7107 reveals an essential role for SF3b in remodeling U2 snRNP to expose the branch point-binding region.</a> Genes. 25, 440-444 (2011).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).</li><li>Lee, K. A., Bindereif, A., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-scale+procedure+for+preparation+of+nuclear+extracts+that+support+efficient+transcription+and+pre-mRNA+splicing.">A small-scale procedure for preparation of nuclear extracts that support efficient transcription and pre-mRNA splicing.</a> Gene Anal. Tech. 5, 22-31 (1988).</li></ol>

הפקה וגישה חופשית למאמר זה ממומן על ידי Abcam, Plc.

הקמנו שיטה מהירה לשחזור להכנת תמציות גרעיני של כמויות קטנות של תאים הלה גדל כמו monolayers. הראינו כי תמציות אלה הם חזקים ידי מראה כי קינטיקה והיעילות של RNAP השנייה שעתוק / שחבור מבחני דומים תמציות גרעיני בקנה מידה קטן ולא בתפזורת. הראינו את התועלת של תמציות על ידי הוכחת כי תמציות שהוכנו מתאי שטופלו בתרופה מעכב פעילות של שחבור שעתוק אבל פגום שחבור. השיטה שלנו להכנת בקנה מידה קטן תמציות גרעיני הוקמה על ידי שילוב וייעול שיטות שנקבעו בעבר להכנת תמציות מתאי הלה הגדלים להשעיה בקנה מידה גדול 1,8 ואת שיטת הכנה בקנה מידה קטן של תמציות 9. הקמנו פרוטוקול שלנו, כי את הקודמות בקנה מידה קטן תמציות לא פונקציונלי מבחני מסוימים, כגון שעתוק יחד / splicing assay. הבדל חשוב בין הקודמת בקנה מידה קטן פרוטוקול 9 ושלנו היא שאנחנו מותאם התנאים lysing תאים באמצעות dounce מיני ואילו בפרוטוקול הקודם lysed תאים על ידי לחיצה עליהם באמצעות מחט קטנה בקוטר 9. את המחט, תמוגה תוצאות בועות, מה שיכול להסביר מדוע תמציות היו פעילים ו / או קשה לשחזר את מבחני מסוימים. כמו כן הוסיף צעד ריכוז לפרוטוקול שלנו. צעד זה מגדיל את הפעילות של תמציות, אשר רגישים במיוחד הריכוז, וגם מגביל את השונות בין תמציות שהוא חלק קטן בקנה מידה ההכנות. לבסוף, ההכנה שלנו מתבצעת באופן שגרתי עם רק שלוש צלחות 150 מ&quot;מ של תאים monolayer, ללא כל השפעה משמעותית על הפעילות לעומת תמציות בתפזורת. לפיכך, הנוהל אינו מקובל בקלות על בקנה מידה קטן ההכנות הדורשים ריאגנטים יקרים או מקום פנוי בתא מוגבלת. לדוגמה, הכנו SMALL בקנה מידה תמציות מתאי RNAi מציאה ומ לימפוציטית כרונית (CLL) בתאי לוקמיה החולה, שימוש בתמציות אלה מבחני תפקודית ו / או ביוכימי (EGF, JLH, טאי ו RR, לא פורסם). מצאנו כי תמציות הם בעלי ערך עבור RNAi ואחריו מבחני ביוכימיים ספציפיים, כגון immunopreciptations, מערבון, וכן צביעה כסף. לאחר הקמת היעילות של דריסה חלבון מסוים, מחקר מפורט יותר ניתן לבצע על ידי ביצוע מציאה יציבה התא קו, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להכין תמציות נוספות בעלות נמוכה יותר. ספקטרומטריית מסה של חלבונים הנמצאים immunoprecipitates לקבל את שורות תאים מציאה יהיה גם יישום שימושי של השיטה. בנוסף assay שעתוק / שחבור יחד כי היינו כדוגמה לתיאור הפרוטוקול שלנו כאן, בקנה מידה קטן תמציות צריך להיות רלוונטי בדרך כלל מבחני פונקציונלי ביוכימיים רבים, כגון אלו המשמשים רחוב אחרEPS של ביטוי גנים (למשל מכסת, שחבור שעתוק, polyadenylation, עיבוד microRNA). פרוטוקול יכול גם להיות מותאם עבור סוגי תאים חולים, כי ניתן להשיג גם ב ההשעיה (כגון תאים CLL) או גדל בתרבות (כגון fibroblasts המטופל). לבסוף, חלק cytoplasmic לקבל במהלך ההליך צריך להיות שימושי עבור מבחני גם פונקציונלית ביוכימי הדורשים הציטופלסמה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> שם מלא של מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 4 - (2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic חומצה </td><td> סיגמא </td><td> H3375-500 גרם </td></tr><tr><td> MgCl 2 0.6 H 2 O </td><td> מגנזיום כלוריד Hexahydrate </td><td> סיגמא </td><td> M2670-500 גרם </td></tr><tr><td> KCl </td><td> אשלגן כלוריד </td><td> דיג </td><td> P335-212 </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Phenylmethanesulfonyl פלואוריד </td><td> סיגמא </td><td> P7626-100 גרם </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Dithiothreitol </td><td> האמריקאי Bioanalytical </td><td> AB00490-5G </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> , הרכב: Ethylenediaminetetraacetate, dihydrate </td><td> האמריקאי Bioanalytical </td><td> AB00500-01000 </td></tr><tr><td> גליצרול </td><td></td><td> מגה פיקסל Biomedicals </td><td> 800689 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Dulbecco של המדיום מינימלי Essential </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-073 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> בסרום שור עוברית </td><td> Gibco </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td></td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> פוספט שנאגרו מלוחים </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CV </td></tr><tr><td> Trypan כתם כחול 0.4% </td><td></td><td> Gibco </td><td> 15250 </td></tr><tr><td> תא מרימי </td><td></td><td> קורנינג </td><td> 29442-200 </td></tr><tr><td> 150mm צלחות </td><td></td><td> VWR </td><td> 353025 </td></tr><tr><td> Extended micropipette עצה </td><td></td><td> Denville </td><td> P1126 </td></tr><tr><td> Dounce homogenizer, 1ml, עם העלי חזק </td><td></td><td> ויטון </td><td> 357538 </td></tr><tr><td> Slidealyzers, MWCO 10kDa </td><td></td><td> ThermoScientific </td><td> 69572 </td></tr><tr><td> מיני Centricons, MWCO 3kDa </td><td></td><td> Millipore (Amicon) </td><td> UFC500396 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. ריאגנטים ספציפיים וציוד. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פתרון </td><td> סופי </td><td> מניות </td><td> להכין </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hypotonic </td><td> HEPES 10 מ&quot;מ, ה-pH 7.9 </td><td> HEPES 1M, pH 7.9 </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td> &lt;td&gt; 1.5 מ&quot;מ MgCl 2 </td><td> 1M MgCl 2 </td><td> 750 μl </td></tr><tr><td></td><td> 10 mM KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 1.67 מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 מ&quot;מ PMSF </td><td> 200 מ&quot;מ PMSF </td><td> 500 μl </td></tr><tr><td></td><td> 0.5 מ&quot;מ DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 125 μl </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> להביא עד 500 מ&quot;ל מים </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> נמוך מלח </td><td> HEPES 20 מ&quot;מ, ה-pH 7.9 </td><td> HEPES 1M, pH 7.9 </td><td> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td> 1.5 מ&quot;מ MgCl 2 </td><td> 1M MgCl 2 </td><td> 150 μl </td></tr><tr><td></td><td> 20 מ&quot;מ KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 667 μl </td></tr><tr><td> &amp; Nbsp; </td><td> 0.2 mM EDTA </td><td> 0.5m EDTA </td><td> 40 μl </td></tr><tr><td></td><td> 25% גליצרול </td><td> גליצרול </td><td> 25 מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 מ&quot;מ PMSF </td><td> 200 מ&quot;מ PMSF </td><td> 100 μl </td></tr><tr><td></td><td> 0.5 מ&quot;מ DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 25 μl </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> להביא עד 100 מ&quot;ל מים </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> מלח גבוהה </td><td> HEPES 20 מ&quot;מ, ה-pH 7.9 </td><td> HEPES 1M, pH 7.9 </td><td> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td> 1.5 מ&quot;מ MgCl 2 </td><td> 1M MgCl 2 </td><td> 150 μl </td></tr><tr><td></td><td> 1.4M KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 48 מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 mM EDTA </td><td> 0.5m EDTA </td><td> 40 μl </td></tr><tr><td></td><td> 25% גליצרול </td><td> גליצרול </td><td> 25 מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 מ&quot;מ PMSF </td><td> 200 מ&quot;מ PMSF </td><td> 100 μl </td></tr><tr><td></td><td> 0.5 מ&quot;מ DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 25 μl </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> להביא עד 100 מ&quot;ל מים </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> דיאליזה </td><td> HEPES 20 מ&quot;מ, ה-pH 7.9 </td><td> HEPES 1M, pH 7.9 </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td> 100 מ&quot;מ KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 16.625 מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 mM EDTA </td><td> 0.5m EDTA </td><td> 200 μl </td></tr><tr><td></td><td> 20% גליצרול </td><td> גליצרול </td><td> 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 מ&quot;מ PMSF </td><td> 200 מ&quot;מ PMSF </td><td> 500 μl </td></tr><tr><td></td><td> 0.5 מ&quot;מ DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 125 μl </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> להביא עד 500 מ&quot;ל מים </td></tr></tbody></table> טבלה 2. פתרונות להכנת תמצית גרעיני.

small-scale nuclear extracts for functional assays of gene-expression machineries

העסקה הגדולה של התקדמות ביטוי גנים הבנה נעשה שימוש במערכות חוץ גופית. עבור רוב המחקרים, מבחני תפקודית מתבצעות באמצעות תמציות כי הם מוכנים בכמויות גדולות מ 10-50 או יותר ליטרים של התאים הגדלים ההשעיה. עם זאת, אלה בקנה מידה גדול ההכנות אינן ניתנות במהירות לבדיקת אפקטים חוץ גופית הנגרמות כתוצאה ממגוון רחב של טיפולים הסלולר או תנאים vivo. מאמר זה מציג את יומן הווידאו שיטה להכנת תפקודית בקנה מידה קטן תמציות גרעיני, באמצעות תאים הלה כדוגמה. שיטה זו מתבצעת באמצעות כמה כמו 3 150 מ&quot;מ לוחות של תאים שגודלו כמו monolayers חסיד. כדי להמחיש את יעילות בקנה מידה קטן תמציות, אנו מראים כי הם פעילים כמו תמצית גרעיני בכמות גדולה עבור מצמידים RNA פולימראז II שעתוק / שחבור תגובות. כדי להדגים את התועלת של פרוטוקול תמצית, אנו מראים כי שחבור הוא בוטל ב תמציות מוכנות מתא הלהשל מטופלים עם התרופה מעכב שחבור E7107. פרוטוקול בקנה מידה קטן צריך להיות רלוונטי, בדרך כלל, תהליך או סוג התא יכול להיחקר במבחנה באמצעות תמציות סלולריים. אלה כוללים את התאים החולים, כי הם זמינים רק בכמויות מוגבלות או תאים שנחשפו סוכנים רבים כגון תרופות, סוכני ה-DNA, פגיעה, או RNAi transfection, אשר דורשים את השימוש של אוכלוסיות תאים קטנים. בנוסף, כמויות קטנות של תאים בוגרים טריים נוחות ו / או נדרש עבור יישומים מסוימים.

Watch this Scientific Journal Video about Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries at JoVE.com

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

פרוטוקול להכנת חזקים, בקנה מידה קטן תמציות הלה גרעיני מתואר. פרוטוקול זה הוא בעל ערך עבור מבחני הדורשים שימוש של אוכלוסיות קטנות של תאים, כגון תאים שטופלו בתרופות או RNAi. השיטה צריכה להיות ישים למגוון רחב של ביטוי גנים מבחני סוגי תאים אחרים, כולל תאים חולים.

בקנה מידה קטן תמציות גרעיני עבור מבחני פונקציונלית של הגן ביטוי Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

small-scale-nuclear-extracts-for-functional-assays-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

25.8K Views.  Harvard Medical School. פרוטוקול להכנת חזקים, בקנה מידה קטן תמציות הלה גרעיני מתואר. פרוטוקול זה הוא בעל ערך עבור מבחני הדורשים שימוש של אוכלוסיות קטנות של תאים, כגון תאים שטופלו בתרופות או RNAi. השיטה צריכה להיות ישים למגוון רחב של ביטוי גנים מבחני סוגי תאים אחרים, כולל תאים חולים.

Video: Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Gene Expression חיידקית ניתוח שימוש microarrays

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

בשנת העצרת חוץ גופית גרעיני מופרדים באמצעות תמציות Xenopus ביצה

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 2 of 3.

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

חוט השדרה Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

אלל ספציפי Gene Expression Assay כדי לבדוק את בסיס פונקציונלי של אגודות גנטי

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...