ونحن ممتنون لإبراهيم إ. م. Winkelbauer-هيرت،، P. فالنسيا، K. Dufu، H. تشنغ لإجراء مناقشات مفيدة. وقد تم الحصول على خلايا هيلا من مركز الخلية الثقافة الوطنية (مينيابوليس، مينيسوتا). كما نشكر ايساي المحدودة لتوفير E7107 ومركز التصوير نيكون في كلية هارفارد الطبية للمساعدة في المجهر الضوئي. وأيد هذا العمل من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة GM043375 إلى RR وEGF وزمالة NRSA إلى JLH.

1. خلايا هيلا المتزايد على استخراج النووية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستكمل لوحة خلايا هيلا على ثلاث لوحات 150 مم مع وسائل الاعلام DMEM مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين عقار. تنمو في الحاضنة 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2 حتى الخلايا هي متكدسة 90٪. </li></ol> بلاغ تقسيم الخلايا 1:10 من لوحة متكدسة وحصاد 3 أيام بعد انفصالها. يمكن زراعتها بلاغ لوحة اضافية في حال عدم وجود ما يكفي من الخلايا مع ثلاث لوحات (على سبيل المثال، إذا كانت الخلايا أقل من 90٪ متموجة). 2. إعداد والبرد حلول استخراج النووية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حلول جديدة على النحو المبين في الجدول رقم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 10 مل من الاحتياطي منخفض التوتر في أنبوب 15 مل الصقر. قسامة 1 مل من مخزن الملح و 1 مل من الاحتياطي ملح قليلة إلى 1.5 أنابيب إيبندورف مل. البرد المخازن المؤقتة على الجليد. إضافة كميات مناسبة من PMSF وDTT إلى كل العازلة مباشرة قبل استخدامها (انظر <strong&gt; الجدول 1). </li></ol> 3. حصاد خلايا هيلا لاستخراج النووية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وسائل الاعلام من الخلايا، ويغسل خلايا مرة واحدة مع 13 مل من درجة حرارة الغرفة 1X PBS لكل لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح غسل برنامج تلفزيوني. </li></ol> بلاغ نضح قدر من برنامج تلفزيوني ممكن عن طريق الشفط الأولى، ثم يقف لوحة على جانبها، والانتظار بضع ثوان، والشفط بقية. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام رافع الخلية، كشط الخلايا إلى الحافة السفلى من لوحات، ومن ثم نقل الخلايا إلى أنبوب إيبندورف. تجنب الوقوع في فقاعات. وينبغي لوحات 3 من خلايا كشط تنسجم مع واحدة 1،5 أنبوب إيبندورف مل. </li></ol> بلاغ من السهل تقدير حجم الخلايا إذا تم استخدام أنبوب إيبندورف. ليصل الحجم، واستخدام أنابيب الصقر. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في درجة مئوية 4 في microfuge لمدة 5 دقائق عند 100 XG إلى خلايا بيليه. </li></ol> 4. تتورم خلايا هيلا في الواق منخفض التوتر </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية في برنامج تلفزيوني من بيليه الخلية وتقدير حجم الخلية جاهزة (PCV) من خلال النظر في تدرج على أنبوب. ثلاث لوحات متكدسة من خلايا هيلا تسفر عن حوالي 500 ميكرولتر من PCV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بمقدار 2X في PCV من الاحتياطي منخفض التوتر على بيليه الخلية. هز بلطف إلى resuspend الخلايا. استخدام Pipetman P1000 إلى resuspend بلطف الخلايا بواسطة pipetting صعودا وهبوطا إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في درجة مئوية 4 في microfuge لمدة 5 دقائق عند 100 XG إلى خلايا بيليه. * وبدأت الخلايا إلى تضخم من قبل هذا الوقت، وحجم الخلية يجب أن تكون الآن عن ميكرولتر ميكرولتر-1000 750. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية الواق الواق منخفض التوتر وإضافة جديدة إلى منخفض التوتر الحجم النهائي من 1.5 مل. Resuspend الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا معلق منتفخة على الجليد لمدة 10 دقيقة. </li></ol> 5. ليز خلايا باستخدام الخالط Dounce <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الاحتياطي منخفض التوتر لشطف dounce ومن ثم فتور على الجليد. مسح جاف مدقة مع WIP مهمة حساسةإيه (على سبيل المثال Kimwipe). إزالة المنطقة العازلة المتبقي من dounce باستخدام 1000 ميكرولتر طرف micropipette الموسعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا تورم في dounce. تحرك ببطء مدقة ضيق من dounce صعودا وهبوطا إلى 5 مرات ليز الخلايا، والحرص على تجنب الفقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص للتحلل الخلية باستخدام قسامة 5 ميكرولتر من الخلايا من dounce. وضع قسامة في أنبوب إيبندورف وإضافة حجم مساو من أزرق التريبان. ضعي المزيج على شريحة ودراسة الخلايا باستخدام مجهر الضوء. ونوى الخلايا هي lysed تظهر باللون الأزرق. حوالي 90٪ تحلل مثالية. </li></ol> معلومات سرية وعدد المرات التي ينبغي dounced الخلايا سوف تختلف تبعا لضيق من dounce. عند تنفيذ هذا البروتوكول للمرة الأولى، وتحديد عدد المرات إلى dounce من خلال تنفيذ الخطوة 5.3 بعد كل السكتة الدماغية مع dounce. لا تبالغ في dounce، سوف douncing المفرط تدمير نوى. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا هي lysed إلى ما قبل chilleد إيبندورف أنبوب وتدور في microfuge 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في 1500 × ز. وبيليه يحتوي على نواة. نقل بعناية وطاف على أنبوب جديد دون تعطيل نوى. وطاف يحتوي على السيتوبلازم. </li></ol> معلومات سرية ويمكن استخدامها السيتوبلازم كما هو أو مواصلة تجهيزها لS100 باستخدام نفس عالية السرعة تستخدم لزيادة ونقصان مقتطفات السائبة (انظر 1 لإعداد S100 نشط من مقتطفات بالجملة). 6. الملح استخراج النواة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقدير حجم جاهزة النووية (الباسكي) من خلال النظر في تدرج على أنبوب. وPCV من 500 ميكرولتر ينتج عادة الباسكي من 400 ميكروليتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ½ X الباسكي من الاحتياطي سولت الأقل إلى النواة عن طريق إدراج معلومات سرية micropipette إلى أسفل الأنبوب والتدفق ببطء المخزن المؤقت في نواة في حين خلط بلطف. لا الماصة صعودا وهبوطا. نفض الغبار بلطف الأنابيب للتأكد من أن يتم معلق تماما بيليه في المخزن المؤقت ملح قليلة قبل الشروع في الاستمرار. </li> &lt;لى&gt; إضافة ½ X الباسكي من مخزن الملح وتخلط بسرعة 1 مرة بواسطة أنبوب للقلب. لا تهز. تناوب على 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. </li></ol> بلاغ كن لطيفا مع نواة عندما يكونون في مخزن الملح لتجنب lysing لهم. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في درجة مئوية 4 في microfuge لمدة 15 دقيقة في ز س 18000. وطاف هو استخراج الملح ارتفاع النووية (HS-NE). ثلاث لوحات من الخلايا تنتج عادة 500-600 ميكروليتر من HS-NE. </li></ol> 7. وتركز Dialyze استخراج النووية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 500 ميكرولتر من HS-NE إلى مبرد مصغرة centricons (Amicon)، وتدور لمدة 50 دقيقة في 4 درجات مئوية في microfuge في ز س 14000. عكس المصغرة centricon (Amicon) ووضعها في أنبوب إيبندورف جديد. تدور لمدة 2 دقيقة في 4 درجة مئوية 1000 x ج لاسترداد HS-NE. وسوف تتركز HS-NE إلى ما يقرب من 115 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام Pipetman P200، نقل 45 aliquots ميكرولتر من HS-NE إلى شريحة مصغرة لغسيل الكلى، Lyzers-A، ووضعها في 500 مل من مخزن مبرد غسيل الكلى. ضمان أن يتم محاذاة الجزء السفلي من الشريحة-A-Lyzer مع الجزء السفلي من العوام. يقلب لمدة 1-2 ساعات في 4 درجة مئوية. سوف تظهر NE غائم بعد لغسيل الكلى. </li></ol> معلومات سرية لا الطرد المركزي لإزالة راسب غائم الذي لوحظ بعد لغسيل الكلى، حيث ان هذا الطرد المركزي يقلل من نشاط للاستخراج. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن استخدام NE فورا أو aliquoted. وينبغي Aliquots فلاش مجمدة في النيتروجين السائل وتخزينه في درجة مئوية -80 ويمكن تخزين الشرق الأدنى والخضوع لاثنين على الأقل تجميد ذوبان دورات دون فقدان النشاط. </li></ol> 8. ممثل النتائج مؤخرا، تم تطوير كفاءة في أنظمة الأنابيب لتوصيل RNAP الثاني النسخ إلى الربط 2-5. هذه الأنظمة تستخدم خلايا هيلا تزرع بكميات كبيرة، وبالتالي فهي غير قابلة للاختبار بسرعة من آثار العلاجات الخلوية محددة على عينات متعددة. بناء على هذا في حاجة الىالثانية الأداة المساعدة العامة لبروتوكول استخراج الصغيرة (انظر المناقشة)، أنشأنا قوية صغيرة الحجم طريقة استخراج النووية. ويظهر بيانات تمثيلية مقارنة الثاني RNAP النسخ / الربط رد فعل في استخراج صغار النووية مع استخراج النووية السائبة في الشكل 2. تأنشا CMV الحمض النووي، التي تحتوي على مروج CMV وتشفير كانت تستخدم ركيزة الربط القياسي (المنطقة الحرة برأس 3، الشكل 2A) للتحليل. وعندما حضنت هذا البناء في الجزء الأكبر (الممرات 1-3) أو على نطاق صغير (الممرات 4-6) استخراج، وتوليفها مستويات مماثلة من الوليدة قبل مرنا من قبل نقطة دقيقة وقت 5 (الشكل رقم 2، 1 و 4 حارات ). بعد إضافة α-أمانيتين لمنع مزيد من النسخ، والربط وسيطة ومنتجات تقسم المتراكمة على مر الزمن مع حركية مماثلة في كلا النوعين من مقتطفات (الشكل 2، والممرات 2، 3، 5، 6). هذه النتائج تدل على أن ممثل كفاءة للانقلاب<html> بقيادة RNAP الثاني النسخ / الربط نظام مشابه في مقتطفات النووية السائبة وعلى النطاق الصغير. للتدليل على فائدة من طريقة استخراج الصغيرة الحجم، وأعدت مقتطفات من خلايا هيلا تعامل مع المانع الربط، E7107، أو مجمع سيطرة سلبية pladienolide F 6،7 ومن ثم تم تنفيذ RNAP الديناميكي الثاني النسخ / الربط فحص خارج. كما هو مبين في الشكل (3)، النسخ الثاني RNAP حدث بكفاءة في مقتطفات من استعداد كلا F Pladienolide وE7107 الخلايا المعالجة (10 نقاط الوقت دقيقة). في المقابل، وقعت الربط عادة في استخراج الخلايا المحضرة من طراز F-المعالجة Pladienolide لكن ألغي في الخلايا E7107 المعالجة (الشكل 3، نقطة 20-60 مرة دقيقة). هذه البيانات تقدم دليلا على مفهوم لاستخدام مقتطفات صغيرة الحجم النووي لمعاملة خاصة من الخلايا في نطاق ضيق. JPG &quot;/&gt; الشكل 1. التخطيطي من البروتوكول استخراج الصغيرة. الخطوة P1. وتزرع الخلايا كما monolayers، تحصد من لوحات باستخدام رافعة للخلية ومنتفخة من خلال إضافة العازلة منخفض التوتر. الخطوة P2. وهي lysed الخلايا باستخدام الخالط Dounce وطرد لتكوير نوى. الخطوة P3. يتم فصل النوى من السيتوبلازم والخضوع لاستخراج الملح. الخطوة P4. ويتركز استخراج النووية ومدال. الخطوة P5. ويتم الحصول على النتائج التي تظهر أن مقتطفات النووية وظيفية (انظر الشكل 2 لمزيد من التفاصيل). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig2.jpg" /> الشكل 2. على نطاق صغير مقتطفات النووية القوية في فحص RNAP الديناميكي النسخ / الربط الثاني. A. التخطيطي لقالب الحمض النووي CMV، المنطقة الحرة برأس المستخدمة لالديناميكي RNAP الثاني النسخ / الربط. يشار إلى المروج CMV وأحجام إلى exons والإنترون. B. مقارنة RNAP الديناميكيثانيا النسخ / الربط فحص باستخدام مستخلص النووية السائبة أو صغيرة الحجم استخراج النووية. أضيف α-أمانيتين بعد 5 دقائق ولم يسمح النسخ والربط للتحدث لمدة 30 و 60 دقيقة. تم استخراج الحمض النووي الريبي ومجزأة على هلام 5٪ بولكرلميد تبديل طبيعة والكشف عنها بواسطة phosphoimager. يشار إلى أن وسيطة الربط والمنتجات. والذاتية U6 snRNA والحمض الريبي النووي النقال الموجودة في استخراج والتي هي مبينة 32 ف وصفت خلال حضانة. انظر 3 للبروتوكول مفصلة عن النظام الديناميكي RNAP النسخ / الربط الثاني. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig3.jpg" /> الشكل 3. على نطاق صغير مقتطفات النووية المعدة من خلايا هيلا تعامل مع المخدرات E7107 الربط المانع معيبة في الربط. وعولج خلايا مع Pladienolide ميكرومتر 3 F أو كما E7107ووصف (6) وبعد ذلك تستخدم لإعداد صغار مقتطفات النووية. وأجريت الدورة مهلة باستخدام نفس النسخ / الربط الفحص كما في الشكل رقم 2. يشار إلى أن وسيطة الربط والمنتجات، وU6 snRNA والحمض الريبي النووي النقال.

<ol>
	<li>Krainer, A. R., Maniatis, T., Ruskin, B., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+and+mutant+human+beta-globin+pre-mRNAs+are+faithfully+and+efficiently+spliced+in+vitro.">Normal and mutant human beta-globin pre-mRNAs are faithfully and efficiently spliced in vitro.</a> Cell. 36, 993-1005 (1984).</li><li>Ghosh, S., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+in+vitro+synthesis+and+splicing+of+RNA+polymerase+II+transcripts.">Coupled in vitro synthesis and splicing of RNA polymerase II transcripts.</a> Rna. 6, 1325-1334 (2000).</li><li>Das, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coupling+of+RNAP+II+transcription+to+spliceosome+assembly.">Functional coupling of RNAP II transcription to spliceosome assembly.</a> Genes Dev. 20, 1100-1109 (2006).</li><li>Hicks, M. J., Yang, C. R., Kotlajich, M. V., Hertel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+splicing+to+Pol+II+transcription+stabilizes+pre-mRNAs+and+influences+splicing+patterns.">Linking splicing to Pol II transcription stabilizes pre-mRNAs and influences splicing patterns.</a> PLoS Biol. 4, e147 (2006).</li><li>Yu, Y., Das, R., Folco, E. G., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+in+vitro+system+for+co-transcriptional+splicing.">A model in vitro system for co-transcriptional splicing.</a> Nucleic Acids Res. 38, 7570-7578 (2010).</li><li>Kotake, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+factor+SF3b+as+a+target+of+the+antitumor+natural+product+pladienolide.">Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide.</a> Nat. Chem Biol. 3, 570-575 (2007).</li><li>Folco, E. G., Coil, K. E., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-tumor+drug+E7107+reveals+an+essential+role+for+SF3b+in+remodeling+U2+snRNP+to+expose+the+branch+point-binding+region.">The anti-tumor drug E7107 reveals an essential role for SF3b in remodeling U2 snRNP to expose the branch point-binding region.</a> Genes. 25, 440-444 (2011).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).</li><li>Lee, K. A., Bindereif, A., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-scale+procedure+for+preparation+of+nuclear+extracts+that+support+efficient+transcription+and+pre-mRNA+splicing.">A small-scale procedure for preparation of nuclear extracts that support efficient transcription and pre-mRNA splicing.</a> Gene Anal. Tech. 5, 22-31 (1988).</li></ol>

وترعى الإنتاج وحرية الوصول إلى هذه المادة من قبل Abcam، والمجلس التشريعي.

قمنا بتأسيس طريقة سريعة وقابلة للتكرار لإعداد مقتطفات النووية من كميات صغيرة من خلايا هيلا كما نمت monolayers. أثبتنا أن هذه المقتطفات هي قوية من خلال إظهار أن حركية وكفاءة فحوصات RNAP النسخ / الربط الثاني تتشابه في مقتطفات النووية الصغيرة الحجم وكبيرة الحجم. وأظهرت لنا فائدة مقتطفات من خلال إظهار أن أعدت مقتطفات من الخلايا تعامل مع الربط المخدرات المانع نشطة للنسخ ولكن عيب في الربط. أنشئت لدينا وسيلة لإعداد صغار مقتطفات النووية من خلال الجمع بين وتحسين أساليب المحددة سابقا لصنع مقتطفات من خلايا هيلا نمت في التعليق على نطاق واسع في 1،8 وطريقة لصغار إعداد مقتطفات 9. أنشأنا لدينا بروتوكول لأن السابقة على نطاق صغير مقتطفات لم تكن وظيفية لبعض المقايسات، مثل النسخ إلى جانب / ليرة سوريةlicing فحص. فارق مهم بين البروتوكول على نطاق صغير السابقة (9) ولنا هو أننا أمثل الظروف لlysing الخلايا باستخدام dounce صغيرة في حين أن بروتوكول السابقة هي lysed الخلايا من خلال دفعهم من خلال إبرة صغيرة عيار 9. نتائج إبرة تحلل في فقاعات، وهو ما قد يفسر السبب في أن مستخلصات كانت نشطة و / أو صعوبة في إعادة إنتاج لبعض المقايسات. وأضاف نحن أيضا خطوة تركيز على بروتوكول لدينا. هذه الخطوة يزيد من نشاط المقتطفات، والتي هي حساسة للغاية للتركيز، ويحد أيضا من التباين بين المقتطفات التي هي ملازمة لصغار الاستعدادات. أخيرا، ويتم بشكل روتيني إعداد للخروج مع ثلاثة فقط 150 ملم لوحات من الخلايا أحادي الطبقة، من دون أي تأثير كبير على النشاط مقارنة مقتطفات السائبة. وبالتالي، فإن الإجراء غير قابلة بسهولة لصغار الاستعدادات التي تتطلب الكواشف مكلفة أو محدودية توفر الخلية. على سبيل المثال، قمنا بإعداد SMAتستخدم ليرة لبنانية على نطاق مقتطفات من الخلايا ورني ضربة قاضية من خلايا سرطان الدم الليمفاوي المزمن المريض (CLL)، وهذه مقتطفات لفحوصات وظيفية و / أو البيوكيميائية (EGF، JLH، وTY RR، غير منشورة). لقد وجدنا أن لا تقل قيمة عن مقتطفات رني تليها فحوصات البيوكيميائية محددة، مثل immunopreciptations، الغرب، وتلطيخ الفضة. بعد تأسيس فعالية هدمت بروتين معين، ويمكن إجراء دراسة أكثر تفصيلا من خلال جعل ضربة قاضية مستقر خلية الخط، والتي يمكن استخدامها لإعداد مقتطفات إضافية بتكلفة أقل. مطياف الكتلة من البروتينات الموجودة في immunoprecipitates تم الحصول عليها من هذه الخطوط الخلية ضربة قاضية ستكون أيضا مفيدة لتطبيق هذه الطريقة. بالإضافة إلى فحص النسخ / الربط إلى جانب ذلك كنا كمثال لوصف بروتوكول لدينا هنا، ينبغي على مقتطفات صغيرة الحجم قابلة للتطبيق بشكل عام إلى العديد من المقايسات الفنية والكيمياء الحيوية، مثل تلك المستخدمة في الحادي ومختلفالعائد على السهم في التعبير الجيني (مثل وضع حد أقصى، الربط، النسخ، وتجهيز تذييل بعديد الأدينيلات microRNA،). ويمكن أيضا أن البروتوكول يمكن تكييفها لأنواع الخلايا المريضة التي يمكن الحصول عليها إما في تعليق (مثل خلايا CLL) أو تزرع في ثقافة (مثل الخلايا الليفية المريض). أخيرا، يجب على جزء السيتوبلازمية التي تم الحصول عليها أثناء عملية مفيدة لكلا المقايسات الفنية والبيوكيميائية التي تتطلب السيتوبلازم.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> الاسم الكامل للكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 4 - (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين-1-ethanesulfonic حامض </td><td> سيغما </td><td> H3375-500G </td></tr><tr><td> MgCl 2 0.6 H 2 O </td><td> المغنيسيوم كلوريد هيدرات </td><td> سيغما </td><td> M2670-500G </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> كلوريد البوتاسيوم </td><td> الصياد </td><td> P335-212 </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Phenylmethanesulfonyl فلوريد </td><td> سيغما </td><td> P7626-100G </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Dithiothreitol </td><td> الأمريكي Bioanalytical </td><td> AB00490-5G </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Ethylenediaminetetraacetate، الصوديوم، ثنائي الهيدرات </td><td> الأمريكي Bioanalytical </td><td> AB00500-01000 </td></tr><tr><td> الغليسيرول </td><td></td><td> النائب Biomedicals </td><td> 800689 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Dulbecco والوسيلة الأساسية الدنيا </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11995-073 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> الأبقار مصل الجنين </td><td> Gibco </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتومايسين عقار </td><td></td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> برنامج تلفزيوني </td><td> التخزين المؤقت فوسفات المالحة </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CV </td></tr><tr><td> التريبان البقع الزرقاء بنسبة 0.4٪ </td><td></td><td> Gibco </td><td> 15250 </td></tr><tr><td> خلية الرافعون </td><td></td><td> كورنينج </td><td> 29442-200 </td></tr><tr><td> 150mm لوحات </td><td></td><td> VWR </td><td> 353025 </td></tr><tr><td> الموسعة Micropipette تلميح </td><td></td><td> Denville </td><td> P1126 </td></tr><tr><td> الخالط Dounce، 1ml، مع ضيق مدقة </td><td></td><td> ويتون </td><td> 357538 </td></tr><tr><td> Slidealyzers، MWCO 10kDa </td><td></td><td> ThermoScientific </td><td> 69572 </td></tr><tr><td> مصغرة Centricons، MWCO 3kDa </td><td></td><td> ميليبور (Amicon) </td><td> UFC500396 </td></tr></tbody></table> الجدول رقم 1. الكواشف ومعدات معينة. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> حل </td><td> نهائي </td><td> الأوراق المالية </td><td> الاستغناء </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ناقص التوتر </td><td> 10 HEPES مم، درجة الحموضة 7.9 </td><td> 1M HEPES، ودرجة الحموضة 7.9 </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td></td> &lt;TD&gt; 1.5 ملم MgCl 2 </td><td> 1M MgCl 2 </td><td> 750 ميكرولتر </td></tr><tr><td></td><td> 10 ملي بوكل </td><td> 3M بوكل </td><td> 1.67 مل </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 ملم PMSF </td><td> 200 ملي مول PMSF </td><td> 500 ميكرولتر </td></tr><tr><td></td><td> 0.5 مم DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 125 ميكرولتر </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> جلب ما يصل الى 500 مل مع الماء </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> منخفض الملح </td><td> 20 HEPES مم، درجة الحموضة 7.9 </td><td> 1M HEPES، ودرجة الحموضة 7.9 </td><td> 2 مل </td></tr><tr><td></td><td> 1.5 ملم MgCl 2 </td><td> 1M MgCl 2 </td><td> 150 ميكرولتر </td></tr><tr><td></td><td> 20 ملي بوكل </td><td> 3M بوكل </td><td> 667 ميكرولتر </td></tr><tr><td> &amp; ملاحظة:س؛ </td><td> 0.2 ملم EDTA </td><td> 0.5M EDTA </td><td> 40 ميكرولتر </td></tr><tr><td></td><td> 25٪ الجلسرين </td><td> الغليسيرول </td><td> 25 مل </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 ملم PMSF </td><td> 200 ملي مول PMSF </td><td> 100 ميكرولتر </td></tr><tr><td></td><td> 0.5 مم DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 25 ميكرولتر </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> جلب ما يصل الى 100 ​​مل مع الماء </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ارتفاع ملح </td><td> 20 HEPES مم، درجة الحموضة 7.9 </td><td> 1M HEPES، ودرجة الحموضة 7.9 </td><td> 2 مل </td></tr><tr><td></td><td> 1.5 ملم MgCl 2 </td><td> 1M MgCl 2 </td><td> 150 ميكرولتر </td></tr><tr><td></td><td> 1.4M بوكل </td><td> 3M بوكل </td><td> 48 مل </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 ملم EDTA </td><td> 0.5M EDTA </td><td> 40 ميكرولتر </td></tr><tr><td></td><td> 25٪ الجلسرين </td><td> الغليسيرول </td><td> 25 مل </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 ملم PMSF </td><td> 200 ملي مول PMSF </td><td> 100 ميكرولتر </td></tr><tr><td></td><td> 0.5 مم DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 25 ميكرولتر </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> جلب ما يصل الى 100 ​​مل مع الماء </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> غسيل الكلى </td><td> 20 HEPES مم، درجة الحموضة 7.9 </td><td> 1M HEPES، ودرجة الحموضة 7.9 </td><td> 10 مل </td></tr><tr><td></td><td> 100 ملي مول بوكل </td><td> 3M بوكل </td><td> 16.625 مل </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 ملم EDTA </td><td> 0.5M EDTA </td><td> 200 ميكرولتر </td></tr><tr><td></td><td> 20٪ الجلسرين </td><td> الغليسيرول </td><td> 100 مل </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 ملم PMSF </td><td> 200 ملي مول PMSF </td><td> 500 ميكرولتر </td></tr><tr><td></td><td> 0.5 مم DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 125 ميكرولتر </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> جلب ما يصل الى 500 مل مع الماء </td></tr></tbody></table> الجدول 2. حلول لتحضير مستخلصات النووية.

small-scale nuclear extracts for functional assays of gene-expression machineries

وقد أحرز قدر كبير من التقدم في التعبير الجيني في فهم استخدام نظم المختبر. بالنسبة لمعظم الدراسات، وتجرى فحوصات وظيفية خارج باستخدام مقتطفات التي يتم إعدادها في معظم 10-50 أو أكثر لترا من الخلايا التي تزرع في التعليق. ومع ذلك، هذه الاستعدادات واسعة النطاق ليست قابلة للاختبار سريع في المختبر الآثار التي تنجم عن مجموعة متنوعة من العلاجات الخلوية في الجسم الحي أو شروط. هذه المقالة الفيديو مجلة تظهر طريقة لإعداد وظيفي على نطاق صغير مقتطفات النووية، وذلك باستخدام خلايا هيلا كمثال على ذلك. ويتم هذا الأسلوب من استخدام عدد قليل من 3 150 ملم لوحات من الخلايا كما نمت monolayers ملتصقة. لتوضيح كفاءة مقتطفات صغيرة الحجم، وتبين لنا أن تكون نشطة قدر مقتطفات النووي بكميات كبيرة لردود الفعل الديناميكي بوليميريز الحمض النووي الريبي نسخ / الربط الثاني. للتدليل على فائدة من بروتوكول المقتطف، وتبين لنا أن يتم إلغاء الربط في مقتطفات أعدت من خلية هيلاعلاجه مع المخدرات E7107 الربط المانع. وينبغي أن البروتوكول على نطاق صغير تكون قابلة للتطبيق بشكل عام على أي عملية أو نوع من الخلايا التي يمكن أن يتم التحقيق في المختبر باستخدام خلاصات الخلوية. وتشمل هذه الخلايا المريضة التي لا تتوفر إلا بكميات محدودة أو الخلايا المعرضة للعوامل عديدة مثل الأدوية، وكلاء الحمض النووي الضارة، ورني، أو ترنسفكأيشن، والتي تتطلب استخدام السكان زنزانة صغيرة. وبالإضافة إلى ذلك، كميات صغيرة من الخلايا المزروعة حديثا هي مريحة و / أو المطلوبة لبعض التطبيقات.

Watch this Scientific Journal Video about Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries at JoVE.com

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

يوصف بروتوكول لإعداد قوي وعصائر هيلا الصغيرة النووية. هذا البروتوكول هو قيمة للفحوصات التي تتطلب استخدام المجموعات الصغيرة من الخلايا، مثل الخلايا المعالجة بالأدوية أو رني. ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على طريقة طائفة واسعة من فحوصات الجينات وغيرها من أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا المريض.

على نطاق صغير مقتطفات النووية لفحوصات وظيفي من الجينات التعبير عن مكائن

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

small-scale-nuclear-extracts-for-functional-assays-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

25.8K Views.  Harvard Medical School. يوصف بروتوكول لإعداد قوي وعصائر هيلا الصغيرة النووية. هذا البروتوكول هو قيمة للفحوصات التي تتطلب استخدام المجموعات الصغيرة من الخلايا، مثل الخلايا المعالجة بالأدوية أو رني. ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على طريقة طائفة واسعة من فحوصات الجينات وغيرها من أنواع ال?...

Video: Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

التحليل الجرثومي التعبير الجيني عن طريق ميكروأرس]

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

في المختبر عن طريق الجمعية النووية مجزأ مقتطفات البيض القيطم

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 2 of 3.

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

الحبل الشوكي الكهربية

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

الأليل محددة التعبير الجيني الفحص لفحص الأسس الفنية للجمعيات الوراثية

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

البارافين ، جزءا لا يتجزأ من والمجمدة أقسام ذبابة الفاكهة</emالعضلات الكبار>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...