Biz M. Winkelbauer-Hurt, E. İbrahim P. Valencia, K. Dufu, yararlı tartışmalar için H. Cheng minnettarız. HeLa hücrelerinde Ulusal Hücre Kültür Merkezi (Minneapolis, MN) elde edildi. Ayrıca ışık mikroskobu ile yardım için Harvard Tıp Okulu&#39;nda E7107 ve Nikon Görüntüleme Merkezi sağlamak için Eisai Co, Ltd teşekkür ederim. Bu çalışma JLH RR ve EGF ve NRSA dostluk için bir NIH hibe GM043375 tarafından desteklenmiştir.

1. Nükleer Ekstraksiyon için Büyüyen HeLa Hücreleri <ol><li> DMEM ortamı ile üç 150 mm levha üzerine plakası HeLa hücreleri% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş. Hücrelerinin% 90 konfluent kadar% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör büyür. </li></ol> 3 gün ayrıldıktan sonra bir konfluent plaka ve hasattan 01:10 İpucu-hücreleri ayırır. Tip-Fazladan bir plaka üç plakaları ile yeterince hücreler (örneğin, hücreler% 90&#39;ından daha az birleşik eğer) bulunmaması halinde yetiştirilebilir. 2. Nükleer Özü Çözümler hazırlayın ve soğutun <ol><li> Tablo 2&#39;de belirtildiği gibi taze çözümler hazırlayın. </li><li> 15 ml Falcon tüp içine Hipotonik Buffer tablet 10 ml. 1.5 ml Eppendorf tüpler içine alikotu yüksek tuz Tampon ve Düşük Tuz Tamponu, 1 ml 1 ml. Buz üzerinde tamponlar soğutun. (Bakınız kullanmak üzere, her bir tampon PMSF ve DTT, uygun hacimleri ekleme hemen önce <strong&gt; Tablo 1). </li></ol> 3. Nükleer Ekstraksiyon için HeLa Hücreleri Hasat <ol><li> Hücrelerinden ortamı aspire ve levha oda sıcaklığında 1X PBS 13 ml ile bir kez hücreleri yıkanır. </li><li> PBS yıkama aspire. </li></ol> Sonra birkaç saniye bekleyip, kalan aspire, yan plaka duruyordu, ilk Çekiş tarafından olduğu kadar, PBS mümkün olduğunca Tip-aspire. <ol start="3"><li> Bir hücre yükleyici kullanılarak, plakaların alt kenarına hücreleri sıyırmak ve ardından bir Eppendorf tüpüne hücreleri transfer. Kabarcıkları yapmaktan kaçının. Kazınarak hücrelerin 3 tabak, 1,5 ml Eppendorf tüpe uygun olmalıdır. </li></ol> Tip-O bir Eppendorf tüpüne kullanıldığı takdirde hücrelerinin hacmi tahmin etmek için daha kolaydır. Ölçek için yukarı, Falcon tüpleri kullanın. <ol start="4"><li> Pelet hücrelere xg 100, 5 dakika süre ile, bir mikrofüj içerisinde 4 ° C&#39;de santrifüje. </li></ol> 4. Hipotonik Tampon yılında HeLa hücreleri şişer </p&gt; <ol><li> Dikkatle hücre pelletini gelen PBS aspire ve tüp üzerinde tonlama bakarak Paketli Hücre Hacim (PCV) tahmin ediyoruz. HeLa hücrelerinin Üç konfluent plakaları PCV yaklaşık 500 ul verim. </li><li> Hücre topağı için Hipotonik tampon PCV 2X ekleyin. Hücrelerin tekrar süspansiyon hafifçe sallayın. Hafifçe gerekirse, aşağı ve yukarı pipetleme tarafından hücreleri tekrar süspansiyon bir P1000 Pipetman kullanın. </li><li> Pelet hücrelere xg 100, 5 dakika süre ile, bir mikrofüj içerisinde 4 ° C&#39;de santrifüje. * Hücreleri bu kez şişmeye başlamış olacak ve hücre hacmi şu anda 750 ul-1000 ul hakkında olmalıdır. </li><li> Dikkatle Hipotonik Tampon aspire ve 1.5 ml nihai hacme yeni Hipotonik Buffer ekleyin. Hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> 10 dakika süreyle buz üzerinde inkübe tekrar süspanse şişmiş hücreleri. </li></ol> 5.. Bir Dounce Homojenizatör kullanma Hücreleri Lyse <ol><li> Dounce durulayın ve ardından buz üzerine chill Hipotonik Tampon kullanın. Hassas bir görev wip ile havaneli kurulayınızER (örn. Kimwipe). 1000 ul genişletilmiş mikropipet ucunu kullanarak Dounce geri kalan tamponu çıkarın. </li><li> Dounce içine şişmiş hücreler aktarın. Yavaş yavaş kabarcıkları önlemek için dikkatli olmak, akyuvarlar için 5 kez Dounce sıkı havaneli, yukarı ve aşağı. </li><li> Dounce hücrelerin bir alikotu 5 ul kullanılarak hücre parçalanması için Assay. Bir Eppendorf tüp içinde tablet yerleştirin ve Tripan Mavi eşit hacimde ekleyin. Slayt üzerindeki karışımı koyun ve bir ışık mikroskobu kullanılarak hücrelerin inceleyin. Eridi hücrelerin çekirdekleri mavi görünecektir. Yaklaşık% 90 parçalama idealdir. </li></ol> İpucu-hücreleri dounced gereken zamanlarda sayısı Dounce gerginliğini bağlı olarak değişecektir. Ilk kez bu protokolü taşırken, Dounce her inme sonrası adımı 5.3 yaparak Dounce için sayısını belirler. Aşırı Dounce yapmayın, aşırı douncing çekirdeklerinin yok edecektir. <ol start="4"><li> Bir ön-chille ile lizlendi hücreleri aktarmakd Eppendorf tüpüne ve 1500 x g&#39;de 5 dakika boyunca 4 ° C de mikrofuj spin. Pelet çekirdeği içermektedir. Dikkatle çekirdek bozmadan yeni bir tüpe süpernatant aktarın. Süpernatant sitoplazma içerir. </li></ol> İpucu-sitoplazma toplu özler (toplu özleri etkin bir S100 hazırlamak için 1) için kullanılan aynı yüksek hızlı sıkma kullanarak olarak kullanılabilir veya başka bir S100 için işlenebilir. 6. Çekirdekler Tuz Özü <ol><li> Tüpün üzerinde derecelendirme bakarak Paketli Nükleer Hacim (PNV) tahmin ediyoruz. 500 ul&#39;lik bir PCV tipik olarak 400 ul&#39;lik bir PNV verir. </li><li> Borusunun alt ucu, bir mikropipet ekleme ve yavaş hafifçe karıştırma çekirdek içine tampon squirting tarafından çekirdekler Düşük Tuz Tampon ½ X PNV ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı yapmayın. Yavaşça pelet tamamen devam etmeden önce Düşük Tuz Tampon yeniden süspanse emin olmak için tüp hafifçe vurun. </li> &lt;li&gt; Add ½ X Yüksek Tuz Tampon ve hızlı bir şekilde ters tüp 1 kez karıştırın ve PNV. Sallamayın. 30 dakika süre ile 4 ° C&#39;de dönerler. </li></ol> Onları parçalama önlemek için Yüksek Tuz Tampon bulunan çekirdekleri ile nazik Tip-olun. <ol start="4"><li> 18,000 x g&#39;de 15 dakika boyunca bir mikrofüj içerisinde 4 ° C&#39;de dönerler. Süpernatant yüksek tuz nükleer ekstraktı (HS-NE) &#39;dir. Hücrelerin üç tabak genellikle HS-NE 500-600 ul verim. </li></ol> 7. Nükleer Özü Konsantre ve Dialyze <ol><li> Soğutulmuş mini centricons (Amicon) ve 14000 x g bir mikrofuge&#39;de 4 50 dakika ° C için spin içine HS-KD 500 ul aktarın. Mini-centricon (Amicon) haricindekileri ve yeni bir Eppendorf tüp yerleştirin. 4 2 dakika süreyle Spin ° C HS-NE kurtarmak için 1000 xg. HS-NE yaklaşık 115 ul kadar konsantre olacak. </li><li> Bir P200 Pipetman kullanarak, mini diyaliz Slide-A-Lyzers içine HS-NE 45 ul alikotları aktarabilir ve 50 koyunSoğutulmuş Diyaliz Tampon 0 ml. Slide-A-Lyzer alt şamandıranın altında aynı hizada olduğundan emin olun. 4 ° C&#39;de 1-2 saat için karıştırılmaya KD diyaliz sonra bulanık görünür. </li></ol> İpucu-Do Bu santrifüj ekstresinin aktivitesini azaltır olarak, diyaliz sonrasında gözlenen bulutlu çökelti kaldırmak için santrifüjlenmez. <ol start="3"><li> KD hemen veya bölünüp edilebilir. Örnek kısımları flaş sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve -80 ° C&#39;de muhafaza edilmelidir KD depolanır ve aktivitesini kaybetmeden en az iki donma-çözülme döngüleri tabi olabilir. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar Son zamanlarda, raptetme için RNAP II transkripsiyon akuplaj için in vitro sistemleri etkin 2-5 geliştirilmiştir. Bu sistemler, toplu olarak yetiştirilen HeLa hücrelerinde istihdam ve böylece hızla çoklu numuneler üzerinde spesifik hücresel tedavilerin etkilerini test etmek mümkün olmamakta. Dayanarak, bu bir ihtiyaçnd küçük ölçekli bir özü protokolünün genel yarar (Tartışma bakın), biz sağlam bir küçük ölçekli nükleer özü yöntemi kurdu. Dökme Nükleer ekstresi ile küçük ölçekli nükleer özü RNAP II transkripsiyon / raptetme reaksiyon karşılaştırarak temsili veriler Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. CMV promot.örünü içerir ve standart bir raptetme substrat (Ftz 3, Şekil 2A) Analiz için kullanılan kodlayan bir DNA CMV-yapı,. Bu yapı toplu (şerit 1-3) ya da küçük ölçekli (şerit 4-6) özü inkübe edildiğinde, pre-mRNA doğmakta benzer düzeylerde 5 dakika zaman noktasında (Şekil 2, hat 1 ve 4 ile sentezlenmiştir ). Daha da transkripsiyon engellemek için α-amanitin arasında ilavesinden sonra, raptetme ara ürünler ve raptedilmektedir ekstrelerin her iki tür (Şekil 2, şerit 2, 3, 5, 6) da benzer kinetiği olan zaman içinde birikmiş. Bu temsilcisi sonuçlar gösteriyor ki darbe verimliliği<html> liderliğindeki RNAP II transkripsiyon / yapıştırma sistemi dökme ve küçük ölçekli nükleer özler benzer. Küçük ölçekli özü yöntemin yararlılığını ortaya özü raptetme inhibitörü, E7107 veya negatif kontrol bileşiği pladienolide F 6,7 ve ardından birleştirilmiş RNAP II transkripsiyon / raptetme deneyi yapılmıştır ile muamele HeLa hücreleri hazırlandı. Şekil 3, Pladienolide F ve E7107 tedavi edilen hücreler (10 dk zaman noktalarında) hem de hazırlanan ekstreler içinde etkin bir şekilde meydana RNAP II tarafından transkripsiyonu gösterilmiştir. Buna karşılık, yapıştırma Pladienolide F-tedavi hücrelerinden hazırlanan ekstrenin normal oluştu ama (Şekil 3, 20-60 dakika sürede puan) E7107 ile tedavi edilen hücrelerde kaldırıldı. Bu veriler, küçük ölçekli hücrelerin özel bir tedavi için küçük ölçekli nükleer ekstreleri kullanarak kavramının kanıtı. jpg &quot;/&gt; Şekil 1.. Küçük ölçekli Özü Protokolü şematik. P1 Adım. Hücreler, mono tabakalar gibi yetiştirilen bir hücre yükleyici kullanılarak plakalardan hasat edilmiş ve hipotonik tampon ilave edilerek şişmiş edilir. P2 Adım. Hücreler bir Dounce homojenizatör kullanarak eridi ve pelet için çekirdekleri santrifüj edilir. P3 Adım. Çekirdekler sitoplazma ayrılmış ve tuz ekstraksiyonu geçirilir. P4 Adım. Nükleer ekstrakt konsantre edilir ve diyaliz edildi. P5 Adım. Sonuçları nükleer ekstreleri (daha fazla ayrıntı için bakınız Şekil 2) işlevsel olduğunu olduğunu göstermektedir elde edilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig2.jpg" /> Şekil 2. Küçük ölçekli nükleer özleri eşleşmiş RNAP II transkripsiyon / yapıştırma tayininde sağlamdır. A. Coupled RNAP II transkripsiyon / yapıştırma için kullanılan CMV Ftz DNA örneğinin şematik. CMV promoter ve ekzondan ve intron boyutları gösterilir. Coupled RNAP B. KarşılaştırılmasıToplu nükleer özü veya küçük ölçekli nükleer özü kullanılarak II transkripsiyon / yapıştırma testi. Transkripsiyon ve raptetme 5 dakika 30 ve 60 dakika süre ile meydana gelmesine izin sonra α-amanitin ilave edildi. RNA, bir fraksiyonlara ekstre edilmiş ve% 5 denatüre poliakrilamid jel üzerinde ve phosphoimager ile tespit edildi. Raptetme ara ürünler ve gösterilir. Endojen U6 snRNA ve tRNA özü mevcut ve 32 inkübasyon sırasında P-etiketli belirtilmiştir olduğunu. Kuplajlı RNAP II transkripsiyon / yapıştırma sistemi üzerinde ayrıntılı bir protokol için 3 bakın. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig3.jpg" /> Şekil 3. Kırpılma inhibitörü ilaç E7107 ile tedavi HeLa hücrelerinden hazırlanan küçük ölçekli nükleer özleri ekleme de bozuk. Hücreler 3 mM Pladienolide ile tedavi edildi F veya E7107 gibi6 açıklanan ve daha sonra küçük ölçekli nükleer ekstreler hazırlamak için kullanılmıştır. Bir kez tabii Şekil 2 &#39;de anlatılanla aynı transkripsiyon / raptetme deneyi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Raptetme ara maddeler ve ürün, ve U6 snRNA ve tRNA gösterilir.

<ol>
	<li>Krainer, A. R., Maniatis, T., Ruskin, B., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+and+mutant+human+beta-globin+pre-mRNAs+are+faithfully+and+efficiently+spliced+in+vitro.">Normal and mutant human beta-globin pre-mRNAs are faithfully and efficiently spliced in vitro.</a> Cell. 36, 993-1005 (1984).</li><li>Ghosh, S., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+in+vitro+synthesis+and+splicing+of+RNA+polymerase+II+transcripts.">Coupled in vitro synthesis and splicing of RNA polymerase II transcripts.</a> Rna. 6, 1325-1334 (2000).</li><li>Das, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coupling+of+RNAP+II+transcription+to+spliceosome+assembly.">Functional coupling of RNAP II transcription to spliceosome assembly.</a> Genes Dev. 20, 1100-1109 (2006).</li><li>Hicks, M. J., Yang, C. R., Kotlajich, M. V., Hertel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+splicing+to+Pol+II+transcription+stabilizes+pre-mRNAs+and+influences+splicing+patterns.">Linking splicing to Pol II transcription stabilizes pre-mRNAs and influences splicing patterns.</a> PLoS Biol. 4, e147 (2006).</li><li>Yu, Y., Das, R., Folco, E. G., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+in+vitro+system+for+co-transcriptional+splicing.">A model in vitro system for co-transcriptional splicing.</a> Nucleic Acids Res. 38, 7570-7578 (2010).</li><li>Kotake, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+factor+SF3b+as+a+target+of+the+antitumor+natural+product+pladienolide.">Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide.</a> Nat. Chem Biol. 3, 570-575 (2007).</li><li>Folco, E. G., Coil, K. E., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-tumor+drug+E7107+reveals+an+essential+role+for+SF3b+in+remodeling+U2+snRNP+to+expose+the+branch+point-binding+region.">The anti-tumor drug E7107 reveals an essential role for SF3b in remodeling U2 snRNP to expose the branch point-binding region.</a> Genes. 25, 440-444 (2011).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).</li><li>Lee, K. A., Bindereif, A., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-scale+procedure+for+preparation+of+nuclear+extracts+that+support+efficient+transcription+and+pre-mRNA+splicing.">A small-scale procedure for preparation of nuclear extracts that support efficient transcription and pre-mRNA splicing.</a> Gene Anal. Tech. 5, 22-31 (1988).</li></ol>

Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Abcam, Plc tarafından desteklenmektedir.

Biz monotabaka olarak yetiştirilen HeLa hücrelerinde az miktarda nükleer özler hazırlanması için hızlı ve tekrarlanabilir bir yöntem kurduk. Biz bu özler RNAP II transkripsiyon / yapıştırma tahlillerin kinetik ve verimliliği, küçük ölçekli ve toplu nükleer özler benzer olduğunu göstererek sağlam olduğunu gösterdi. Biz kırpılma inhibitörü ilaç ile tedavi hücrelerinden hazırlanan özler transkripsiyon ama yapıştırma kusurlu için aktif olduklarını göstererek özlerinin yardımcı gösterdi. Küçük ölçekli nükleer ekstreler hazırlanması için yöntem, daha önce büyük ölçekli 1,8 içinde süspansiyon yetiştirilen HeLa hücreleri ekstreler ve ekstre 9 küçük ölçekli hazırlanması için bir yöntem yapmak için yöntemler kurulan birleştirerek ve optimize etmek kurulmuştur. Önceki küçük ölçekli özleri gibi birleştiğinde transkripsiyon / sp, bazı testler için işlevsel değildi, çünkü bizim protokol kurulantahlil licing. Önceki küçük ölçekli protokolü 9 ile bizimki arasında önemli bir fark, önceki protokolü bir küçük iğne ile 9 aktararak hücreleri parçalanır, oysa biz bir mini-Dounce kullanarak hücrelerini parçalayan koşulları optimize olmasıdır. Ekstreleri, bazı testler için yeniden etkin ve / veya zordu neden açıklayabilir kabarcıklar iğne parçalama sonuçları. Biz de protokole bir konsantrasyon adımı ekledi. Bu adım konsantrasyonu son derece duyarlı olan özler, aktivitesini artırır ve aynı zamanda küçük ölçekli hazırlıklarına doğasında vardır özleri arasında değişkenlik sınırlar. Son olarak, rutin olarak hazırlanması dökme ekstreler göre aktivitesi üzerinde anlamlı bir etkisi olmayan, tek tabaka hücrelerin sadece üç 150 mm levha ile gerçekleştirilir. Böylece, işlem masraflı reaktifler veya sınırlı hücre durumu gerektiren küçük ölçekli hazırlıkları için hazır tâbidir. Örneğin, biz sma hazırladıkll ölçekli RNAi Knockdown hücrelerinden ve Kronik Lenfositik Lösemi (KLL) hasta hücreleri alıntılar ve fonksiyonel ve / veya biyokimyasal testler (EGF, JLH, TY ve RR, yayınlanmamış) için bu özleri kullanılmaktadır. Biz RNAi gibi immunopreciptations, Batılıların ve gümüş boyama gibi özel biyokimyasal testler, takip için özler değerli olduğunu bulduk. Belirli bir protein vurma etkinliği kurduktan sonra, daha ayrıntılı bir çalışma düşük maliyetle ilave ekstreler hazırlamak için kullanılabilen bir stabil demonte hücre hattı, yaparak gerçekleştirilebilir. Proteinlerin kütle spektrometrisi, aynı zamanda yöntemin yararlı bir uygulama olacak bu demonte hücre hatları elde immunoprecipitates içinde mevcut. Buradaki protokol açıklama için bir örnek olarak kullanılmaktadır ki çiftli transkripsiyon / assay raptetme ek olarak, küçük ölçekli ekstreler gibi farklı st için kullanılanlar gibi, çok sayıda işlevsel ve biyokimyasal deneyleri için genel olarak uygulanabilir olmalıdırgen ekspresyonu eps (kapatma, yapıştırma, transkripsiyon, poliadenilasyon, mikroRNA işleme gibi). Protokol ayrıca iki süspansiyon elde (örneğin KLL hücreleri gibi) ya da (örneğin hastanın fibroblast gibi) kültür yetiştirilebilir hasta hücre türleri için adapte edilebilir. Son olarak, işlem sırasında elde edilen sitoplazmik fraksiyonu sitoplazma gerektiren işlevsel ve biyokimyasal hem deneyleri için yararlı olmalıdır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Reaktif tam adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 4 - (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit </td><td> Sigma </td><td> H3375-500G </td></tr><tr><td> MgCl2 0,6 H2O </td><td> Magnezyum Klorür hekzahidrat </td><td> Sigma </td><td> M2670-500G </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Potasyum Klorür </td><td> Balıkçı </td><td> P335-212 </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Fenilmetansülfonil florür </td><td> Sigma </td><td> P7626-100G </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Ditiyotretol </td><td> Biyoanalitik Amerikan </td><td> AB00490-5G </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Etilendiamintetraasetat, disodyum, dihidrat </td><td> Biyoanalitik Amerikan </td><td> AB00500-01000 </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td></td><td> MP Biomedicals </td><td> 800689 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Dulbecco Minimal Essential Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-073 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Sığır fetüs serumu </td><td> Gibco </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td></td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Fosfat Tamponlu Salin </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CV </td></tr><tr><td> Tripan Mavi% 0.4 Leke </td><td></td><td> Gibco </td><td> 15250 </td></tr><tr><td> Hücre Kaldıraçlar </td><td></td><td> Corning </td><td> 29442-200 </td></tr><tr><td> 150mm Tabaklar </td><td></td><td> VWR </td><td> 353025 </td></tr><tr><td> Genişletilmiş Mikropipet İpucu </td><td></td><td> Denville </td><td> P1126 </td></tr><tr><td> Sıkı havaneli ile Homojenizatör, 1ml, Dounce </td><td></td><td> Wheaton </td><td> 357538 </td></tr><tr><td> Slidealyzers, MWCO 10kDa </td><td></td><td> ThermoScientific </td><td> 69572 </td></tr><tr><td> Mini-Centricons, MWCO 3kDa </td><td></td><td> Millipore (Amicon) </td><td> UFC500396 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Özel Reaktifler ve Ekipmanları. <table border="1"><tbody><tr><td> Çözüm </td><td> Son </td><td> Stok </td><td> Dağıtmak </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hipotonik </td><td> 10 mM HEPES, pH 7.9 </td><td> 1M HEPES, pH 7.9 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td> &lt;td&gt; 1.5 mM MgCl2 </td><td> 1M MgCl2 </td><td> 750 ul </td></tr><tr><td></td><td> 10 mM KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 1.67 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 mM PMSF </td><td> 200 mM PMSF </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td></td><td> 0.5 mM DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 125 ul </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Su ile 500 ml kadar getirin </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Düşük Tuz </td><td> 20 mM HEPES, pH 7.9 </td><td> 1M HEPES, pH 7.9 </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td></td><td> 1.5 mM MgCl2 </td><td> 1M MgCl2 </td><td> 150 ul </td></tr><tr><td></td><td> 20 mM KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 667 ul </td></tr><tr><td> &amp; Nbsp; </td><td> 0.2 mM EDTA </td><td> 0,5 M EDTA </td><td> 40 ul </td></tr><tr><td></td><td> % 25 Gliserol </td><td> Gliserin </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 mM PMSF </td><td> 200 mM PMSF </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td></td><td> 0.5 mM DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 25 ul </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Su ile 100 ml&#39;ye kadar getirin </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Yüksek Tuz </td><td> 20 mM HEPES, pH 7.9 </td><td> 1M HEPES, pH 7.9 </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td></td><td> 1.5 mM MgCl2 </td><td> 1M MgCl2 </td><td> 150 ul </td></tr><tr><td></td><td> 1.4M KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 48 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 mM EDTA </td><td> 0,5 M EDTA </td><td> 40 ul </td></tr><tr><td></td><td> % 25 Gliserol </td><td> Gliserin </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 mM PMSF </td><td> 200 mM PMSF </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td></td><td> 0.5 mM DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 25 ul </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Su ile 100 ml&#39;ye kadar getirin </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diyaliz </td><td> 20 mM HEPES, pH 7.9 </td><td> 1M HEPES, pH 7.9 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td></td><td> 100 mM KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 16,625 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 mM EDTA </td><td> 0,5 M EDTA </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td></td><td> Gliserol% 20 </td><td> Gliserin </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0.2 mM PMSF </td><td> 200 mM PMSF </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td></td><td> 0.5 mM DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 125 ul </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Su ile 500 ml kadar getirin </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Nükleer Özü hazırlanması için çözümler.

small-scale nuclear extracts for functional assays of gene-expression machineries

Anlayış gen ekspresyonu ilerleme çok sayıda in vitro sistemleri kullanılarak yapılmıştır. Çoğu çalışmaları için, fonksiyonel deneyleri süspansiyon yetiştirilen hücrelerinin 10-50 ya da daha fazla litre toplu olarak hazırlanmıştır ekstreler kullanılarak gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bu büyük ölçekli preparatlar vitro etkileri hızla test edilmesi için müsait değildir vivo hücresel tedavisi ya da koşullarında çok çeşitli sonucu. Bu, Journal Video madde, örnek olarak HeLa hücreleri kullanılarak, fonksiyonel küçük ölçekli nükleer ekstreler hazırlanması için bir yöntemi göstermektedir. Bu yöntem, yapışık mono tabakalar olarak yetiştirilir hücreleri gibi birkaç 150 üç olarak mm levha kullanılarak gerçekleştirilir. Küçük ölçekli özleri etkinliğini göstermek için, biz onlar birleştirilmiş RNA Polimeraz II transkripsiyon / yapıştırma reaksiyonlar için toplu nükleer özler gibi aktif olduğunu göstermektedir. Özü protokol programı göstermek için, yapıştırma HeLa hücre hazırlanan özler kaldırılacaktır olduğunu gösteriyors raptetme inhibitörü ilaç E7107 ile muamele edilmiştir. Küçük ölçekli protokolü hücresel özleri kullanılarak in vitro araştırılması edilebilir herhangi bir işlem veya hücre tipi için genel olarak uygulanabilir olmalıdır. Bunlar, örneğin, küçük hücre popülasyonlarının ilaçların kullanımını gerektirir, DNA zarar verici ajanlar, RNAi veya transfeksiyon gibi çeşitli ajanlar maruz sınırlı miktarda veya hücrelerde yalnızca mevcut hastanın hücreleri içerir. Buna ek olarak, taze yetiştirilen hücreler, az miktarda uygun ve / veya bazı uygulamalar için gereklidir.

Watch this Scientific Journal Video about Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries at JoVE.com

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Sağlam, küçük ölçekli HeLa çekirdek ekstreler hazırlanması için bir protokol tarif edilmektedir. Bu protokol, örneğin ilaçların veya RNAi ile muamele hücreleri gibi hücrelerin küçük popülasyonları, kullanımını gerektiren deneyleri için önemlidir. Metodu gen ifadesi deneyleri ve hasta hücreleri dahil olmak üzere diğer hücre tipleri, geniş bir yelpazede uygulanabilir olması gerekir.

Gen-ifadesi Makinaları Fonksiyonel Tahliller için Küçük ölçekli Nükleer ayıklar

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

small-scale-nuclear-extracts-for-functional-assays-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

25.9K Görüntüleme.  Harvard Medical School. Sağlam, küçük ölçekli HeLa çekirdek ekstreler hazırlanması için bir protokol tarif edilmektedir. Bu protokol, örneğin ilaçların veya RNAi ile muamele hücreleri gibi hücrelerin küçük popülasyonları, kullanımını gerektiren deneyleri için önemlidir. Metodu gen ifadesi deneyleri ve hasta hücreleri dahil olmak üzere diğer hücre tipleri, geniş bir yelpazede uygulanabilir olması gerekir.

Video: Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Vitro Nükleer Meclisi fraksiyonlara Xenopus Yumurta ayıklar kullanma

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Biyoloji

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 1 of 3.

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Omurilik Elektrofizyoloji

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Genetik Dernekleri Fonksiyonel Dayanak Test bir Allel özel Gen İfadesi Testi

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune diseases and cancer2. Our aim is to investigate the antigens recognized by human T cells in the autoimmune disease type 1 diabetes 1,3,4,5. To analyze human T-cell responses against tissue where the antigens recognized by T cells are not identified we developed a method to extract protein antigens from human tissue in a format that is compatible with functional assays 6. Previously, T-cell responses to unpurified tissue extracts could not be measured because the extraction methods yield a lysate that contained detergents that were toxic to human peripheral blood mononuclear cells. Here we describe a protocol for extracting proteins from human tissues in a format that is not toxic to human T cells. The tissue is homogenized in a mixture of butan-1-ol, acetonitrile and water (BAW). The protein concentration in the tissue extract is measured and a known mass of protein is aliquoted into tubes. After extraction, the organic solvents are removed by lyophilization. Lyophilized tissue extracts can be stored until required. For use in assays of immune function, a suspension of immune cells, in appropriate culture media, can be added directly to the lyophilized extract. Cytokine production and proliferation by PBMC, in response to extracts prepared using this method, were readily measured. Hence, our method allows the rapid preparation of human tissue lysates that can be used as a source of antigens in the analysis of T-cell responses. We suggest that this method will facilitate the analysis of adaptive immune responses to tissues in transplantation, cancer and autoimmunity.

A simple protocol for preparing extracts of human tissue to be used as a source of antigens in functional T-cell assays is described. This method allows T-cell responses to tissue-derived antigens to be measured in vitro.

Fonksiyonel Tahliller için Doku Antijenleri çıkarımı

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...