Estamos muy agradecidos al señor Winkelbauer-Hurt, E. Ibrahim, P. Valencia, K. Dufu, H. Cheng útil para los debates. Las células HeLa fueron obtenidos de la célula Nacional Culture Center (Minneapolis, MN). Agradecemos también a Eisai Co., Ltd. para proporcionar E7107 y el Centro de Nikon Imaging en Harvard Medical School en busca de ayuda con microscopía de luz. Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH GM043375 a RR y el EGF y el compañerismo NRSA a JLH.

1. Crecimiento de las células HeLa para la extracción nuclear <ol><li> Placas células HeLa en tres placas de 150 mm con medio DMEM suplementado con FBS al 10% y 1% de penicilina / estreptomicina. Crecer en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2 hasta que las células son el 90% confluente. </li></ol> Dividir Consejo-las células de una placa de 1:10 confluentes y la cosecha 3 días después de dividir. Tip-Una placa adicional que se puede cultivar en caso de que no son suficientes células con tres placas (por ejemplo, si las células son menos del 90% confluentes). 2. Preparar y Chill Soluciones extracto nuclear <ol><li> Prepare nuevas soluciones como se indica en la Tabla 2. </li><li> Alícuota de 10 ml de tampón hipotónico en un tubo Falcon de 15 ml. Alícuotas de 1 ml de tampón salino alto y 1 ml de tampón de sal baja en 1,5 ml tubos Eppendorf. Enfríe los topes en el hielo. Agregar los volúmenes apropiados de PMSF y TDT a cada tampón inmediatamente antes de su uso (ver <strong&gt; Tabla 1). </li></ol> 3. Recolección de las células HeLa para la extracción nuclear <ol><li> Aspirar medios de las células y se lavan las células una vez con 13 ml de PBS 1X a temperatura ambiente por placa. </li><li> Aspirar el lavado con PBS. </li></ol> Tip-Aspirar la mayor cantidad de PBS como sea posible por primera aspiración, a continuación, la placa de pie sobre su lado, esperando unos segundos, y aspirar el resto. <ol start="3"><li> El uso de un levantador de células, raspar las células hasta el borde inferior de las placas, y luego transferir las células a un tubo Eppendorf. Evite hacer burbujas. Las 3 placas de células tomadas por raspado debe caber en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. </li></ol> Tip-Es más fácil calcular el volumen de las células, si un tubo Eppendorf se utiliza. Para la escala, utilizar tubos Falcon. <ol start="4"><li> Centrifugar a 4 ° C en una microcentrífuga durante 5 minutos a 100 xg para sedimentar las células. </li></ol> 4. Oleaje células HeLa en tampón hipotónico </p&gt; <ol><li> Aspirar cuidadosamente la PBS del sedimento celular y estimar el volumen de células empaquetadas (PCV) mirando a la gradación en el tubo. Tres placas confluentes de células HeLa producir aproximadamente 500 l de PCV. </li><li> Añadir 2 veces el PCV de tampón hipotónico al sedimento celular. Agitar suavemente para resuspender las células. Use un Pipetman P1000 para volver a suspender con suavidad las células pipeteando arriba y hacia abajo si es necesario. </li><li> Centrifugar a 4 ° C en una microcentrífuga durante 5 minutos a 100 xg para sedimentar las células. * Las células se han comenzado a hincharse por este tiempo, y el volumen de la celda debe ser ahora alrededor de 750 l-1000 l. </li><li> Aspirar cuidadosamente el tampón hipotónico y añadir tampón hipotónico nuevo a un volumen final de 1,5 ml. Resuspender las células. </li><li> Se incuban las células resuspendidas hinchadas en hielo durante 10 min. </li></ol> 5. Lisis de las células utilizando un homogeneizador Dounce <ol><li> Utilice tampón hipotónico para enjuagar el Dounce y luego enfriar en hielo. Limpie la mano del mortero seco con una delicada tarea wiper (por ejemplo, Kimwipe). Retire el resto del búfer de la Dounce con una punta de 1.000 l micropipeta extendida. </li><li> Transferencia de células inflamadas en el Dounce. Mueva lentamente la mano del mortero apretado de la Dounce arriba y hacia abajo 5 veces para lisar las células, teniendo cuidado de evitar las burbujas. </li><li> Ensayo para la lisis de las células usando una alícuota de 5 l de células de la Dounce. Colocar la parte alícuota en un tubo Eppendorf y añadir un volumen igual de azul tripán. Ponga la mezcla en un portaobjetos y examinar las células utilizando un microscopio de luz. Los núcleos de las células lisadas se aparecen de color azul. Aproximadamente el 90% de lisis es ideal. </li></ol> Tip-El número de veces que las células deben ser dounced variará dependiendo de la estanqueidad de la Dounce. Al llevar a cabo este protocolo, por primera vez, determinar el número de veces para Dounce mediante la realización de paso 5,3 después de cada golpe con el Dounce. No sobre-Dounce, douncing excesiva destruye los núcleos. <ol start="4"><li> Transferir las células lisadas a un pre-Chilled tubo Eppendorf y el giro en una microcentrífuga 4 ° C por 5 min a 1500 x g. El sedimento contiene los núcleos. Transferir cuidadosamente el sobrenadante a un tubo nuevo sin interrumpir los núcleos. El sobrenadante contiene el citoplasma. </li></ol> Tip-El citoplasma puede utilizarse tal cual o procesado para un S100 mediante la misma alta velocidad de centrifugado utilizada para los extractos a granel (véase 1 para la preparación de un activo a partir de extractos S100 a granel). 6. Sal-Extraer los Núcleos <ol><li> Estimar el volumen del concentrado Nuclear (PNV) mirando a la graduación en el tubo. Un PCV de 500 l por lo general se obtiene un PNV de 400 l. </li><li> Añadir ½ X PNV de tampón Sal baja a los núcleos mediante la inserción de una punta de la micropipeta a la parte inferior del tubo y lentamente chorros del buffer en los núcleos mientras que suavemente la mezcla. No utilice la pipeta hacia arriba y hacia abajo. Agitar suavemente los tubos para asegurarse de que el sedimento se resuspendió completamente en el tampón de sal de baja antes de continuar. </li> &lt;li&gt; Agregar ½ X PNV de tampón de sal y mezclar rápidamente una vez invirtiendo el tubo. No agite. Girar a 4 ° C durante 30 min. </li></ol> Consejo-Sé amable con los núcleos cuando están en tampón salino alto para evitar la lisis de ellos. <ol start="4"><li> Derivado a 4 ° C en una microcentrífuga durante 15 min a 18.000 x g. El sobrenadante es el extracto de altas concentraciones de sal nuclear (HS-NE). Tres placas de células generalmente obtienen 500-600 l de HS-NE. </li></ol> 7. Concentrado y Dializar el extracto nuclear <ol><li> Transferencia de 500 l de la SA-NE en frío mini centricons (Amicon) y vuelta por 50 min a 4 ° C en una microcentrífuga a 14000 x g. Invertir el mini-Centricon (Amicon) y colocarlo en un nuevo tubo Eppendorf. Girar durante 2 min a 4 ° C 1000 xg para recuperar el SA-NE. El HS-NE se concentró hasta aproximadamente 115 l. </li><li> El uso de un Pipetman P200, transferir 45 ml de alícuotas de la SA-NE en mini-diálisis Slide-A Lyzers, y colocarlos en el 500 ml de tampón de diálisis refrigerados. Asegurarse de que la parte inferior de la diapositiva-A-Lyzer está alineado con la parte inferior del flotador. Se agita durante 1-2 horas a 4 ° C. El NE aparecerán nubes después de la diálisis. </li></ol> Tip-No centrifugar para eliminar el precipitado turbio que se observa después de la diálisis, ya que esto reduce la actividad de la centrifugación del extracto. <ol start="3"><li> El NE puede ser utilizado inmediatamente o alícuotas. Alícuotas debe destello congelaron en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. El NE se puede almacenar y se someten al menos dos ciclos de congelación-descongelación sin perder actividad. </li></ol> 8. Los resultados representativos Recientemente, eficiente en sistemas in vitro para acoplar la transcripción RNAP II de empalme se desarrollaron 2-5. Estos sistemas emplean células HeLa que crecen a granel y por lo tanto no son susceptibles a la rápida probar los efectos de los tratamientos específicos celulares en múltiples muestras. Basado en este necesita unª de la utilidad general de un protocolo de extracto de pequeña escala (ver Discusión), hemos establecido una sólida pequeña escala método de extracto nuclear. Los datos representativos que comparan la RNAP II transcripción / empalme de reacción en el extracto nuclear de pequeña escala con el extracto nuclear a granel se muestra en la Figura 2. Un constructo de CMV-ADN, que contiene el promotor de CMV y codifica un sustrato de empalme estándar (Ftz 3, la Figura 2A) se utilizó para el análisis. Cuando esta construcción se incubó en la mayor parte (carriles 1-3) o en pequeña escala (carriles 4-6) extracto, niveles similares de la naciente pre-ARNm se sintetizaron por el punto de tiempo de 5 minutos (Figura 2, carriles 1 y 4 ). Después de la adición de α-amanitina para bloquear la transcripción adicional, los compuestos intermedios de empalme y productos empalmados acumulada en el tiempo con la cinética similares en ambos tipos de extractos (Figura 2, calles 2, 3, 5, 6). Estos resultados representativos muestran que la eficacia del golpe<html> dirigida por RNAP II transcripción / empalme sistema es similar en los extractos nucleares a granel y en pequeña escala. Para demostrar la utilidad del método de extracto de pequeña escala, se prepararon extractos de células HeLa tratadas con el inhibidor de empalme, E7107, o el control de pladienolide compuesto negativo F 6,7 y luego el acoplado RNAP II transcripción / empalme ensayo se llevó a cabo. Como se muestra en la Figura 3, la transcripción por RNAP II producido eficientemente en extractos preparados a partir tanto de la F Pladienolide y E7107 células tratadas (10 puntos de tiempo min). En contraste, el empalme se produjo normalmente en el extracto preparado a partir de los tratados con Pladienolide F-células, pero fue suprimido en las células tratadas con E7107 (Figura 3, 20-60 puntos de tiempo min). Estos datos proporcionan una prueba de concepto para el uso de los extractos nucleares de pequeña escala para el tratamiento especial de las células en pequeña escala. jpg &quot;/&gt; Figura 1. Esquema del Protocolo de extracto de pequeña escala. Paso P1. Las células se cultivan como monocapas, cosechados a partir de placas utilizando un levantador de células y se hincha por la adición de tampón hipotónico. Paso P2. Las células se lisaron usando un homogeneizador Dounce y se centrifugó para sedimentar los núcleos. Paso P3. Los núcleos se separan del citoplasma y se someten a la extracción de sal. Paso P4. El extracto nuclear se concentra y se dializa. Paso P5. Los resultados se obtienen que muestran que los extractos nucleares son funcionales (véase la Figura 2 para mayor detalle). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig2.jpg" /> Figura 2. Los pequeños extractos nucleares son robustos en un acoplado RNAP II transcripción / empalme de ensayo. A. Esquema de la plantilla de la DNA del CMV Ftz utilizado para acoplado RNAP II transcripción / empalme. El promotor de CMV y los tamaños de los exones y el intrón se indican. B. Comparación de acoplamiento RNAPII transcripción / empalme de ensayo utilizando el extracto a granel nuclear o de pequeña escala extracto nuclear. α-amanitina se añadió después de 5 minutos de la transcripción y de empalme se permitió que se produzca durante 30 min y 60. Se extrajo el ARN y se fraccionó en un gel de poliacrilamida al 5% de desnaturalización y detectado por phosphoimager. Los compuestos intermedios de empalme y productos se indican. El endógeno snRNA U6 y ARNt presentes en el extracto y que son 32 marcada con P durante la incubación se indican. Ver 3 para un protocolo detallado sobre el acoplado de transcripción RNAP II / empalme del sistema. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig3.jpg" /> Figura 3. Los pequeños extractos nucleares preparados a partir de células HeLa tratadas con el fármaco inhibidor de empalme E7107 son defectuosas en el empalme. Las células fueron tratadas con 3 Pladienolide mM F o E7107 comodescrito 6 y luego se usa para preparar los pequeños extractos nucleares. Un curso de tiempo se llevó a cabo utilizando la misma transcripción / empalme ensayo como en la Figura 2. Los compuestos intermedios de empalme y productos, y U6 snRNA y ARNt se indican.

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	<li>Krainer, A. R., Maniatis, T., Ruskin, B., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+and+mutant+human+beta-globin+pre-mRNAs+are+faithfully+and+efficiently+spliced+in+vitro.">Normal and mutant human beta-globin pre-mRNAs are faithfully and efficiently spliced in vitro.</a> Cell. 36, 993-1005 (1984).</li><li>Ghosh, S., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+in+vitro+synthesis+and+splicing+of+RNA+polymerase+II+transcripts.">Coupled in vitro synthesis and splicing of RNA polymerase II transcripts.</a> Rna. 6, 1325-1334 (2000).</li><li>Das, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coupling+of+RNAP+II+transcription+to+spliceosome+assembly.">Functional coupling of RNAP II transcription to spliceosome assembly.</a> Genes Dev. 20, 1100-1109 (2006).</li><li>Hicks, M. J., Yang, C. R., Kotlajich, M. V., Hertel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+splicing+to+Pol+II+transcription+stabilizes+pre-mRNAs+and+influences+splicing+patterns.">Linking splicing to Pol II transcription stabilizes pre-mRNAs and influences splicing patterns.</a> PLoS Biol. 4, e147 (2006).</li><li>Yu, Y., Das, R., Folco, E. G., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+in+vitro+system+for+co-transcriptional+splicing.">A model in vitro system for co-transcriptional splicing.</a> Nucleic Acids Res. 38, 7570-7578 (2010).</li><li>Kotake, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+factor+SF3b+as+a+target+of+the+antitumor+natural+product+pladienolide.">Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide.</a> Nat. Chem Biol. 3, 570-575 (2007).</li><li>Folco, E. G., Coil, K. E., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-tumor+drug+E7107+reveals+an+essential+role+for+SF3b+in+remodeling+U2+snRNP+to+expose+the+branch+point-binding+region.">The anti-tumor drug E7107 reveals an essential role for SF3b in remodeling U2 snRNP to expose the branch point-binding region.</a> Genes. 25, 440-444 (2011).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).</li><li>Lee, K. A., Bindereif, A., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-scale+procedure+for+preparation+of+nuclear+extracts+that+support+efficient+transcription+and+pre-mRNA+splicing.">A small-scale procedure for preparation of nuclear extracts that support efficient transcription and pre-mRNA splicing.</a> Gene Anal. Tech. 5, 22-31 (1988).</li></ol>

La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por Abcam, Plc.

Hemos establecido un método rápido y reproducible para la preparación de extractos nucleares de pequeñas cantidades de células HeLa que crecen como monocapas. Hemos demostrado que estos extractos son robustos al mostrar que la cinética y la eficiencia de RNAP II transcripción / empalme ensayos son similares en los extractos nucleares de pequeña escala y volumen. Hemos demostrado la utilidad de los extractos mediante la demostración de que los extractos preparados a partir de células tratadas con un fármaco inhibidor de empalme son activos para la transcripción pero defectuoso en el empalme. Nuestro método para preparar los pequeños extractos nucleares se estableció mediante la combinación y la optimización de los métodos previamente establecidos para la fabricación de extractos de células HeLa que crecen en suspensión en gran escala 1,8 y un método para la pequeña preparación de extractos 9. Se estableció el protocolo porque los anteriores pequeños extractos no eran funcionales para algunos ensayos, tales como la transcripción acoplado / splicing ensayo. Una diferencia importante entre el anterior protocolo de pequeña escala 9 y la nuestra es que hemos optimizado las condiciones para la lisis de las células utilizando un Dounce mini-mientras que el protocolo anterior se lisaron las células empujándolas a través de una pequeña aguja de calibre 9. Los resultados de lisis de agujas en las burbujas, lo cual puede explicar por qué los extractos estaban inactivos y / o difíciles de reproducir en algunos ensayos. También hemos añadido una etapa de concentración en nuestro protocolo. Este paso aumenta la actividad de los extractos, los cuales son extremadamente sensibles a la concentración, y también limita la variabilidad entre los extractos que es inherente a pequeña escala preparaciones. Finalmente, nuestra preparación se lleva a cabo habitualmente con sólo tres placas de 150 mm de monocapa de células, sin ningún efecto significativo sobre la actividad frente a los extractos de a granel. Por lo tanto, el procedimiento es que se presta fácilmente a los pequeños preparados que requieren reactivos costosos o la disponibilidad limitada de células. Por ejemplo, hemos preparado SMAll escala extractos de células RNAi desmontables y de una leucemia linfática crónica (LLC paciente), y utilizar estos extractos para los ensayos funcionales y / o bioquímicos (EGF, JLH, TY y RR, inédito). Hemos encontrado que los extractos son valiosos para RNAi seguido por ensayos bioquímicos específicos, tales como immunopreciptations, western y tinción de plata. Después de establecer la eficacia de abatir una proteína particular, un estudio más detallado puede llevarse a cabo haciendo una caída estable línea celular, que puede ser utilizada para preparar extractos adicionales a menor costo. La espectrometría de masas de las proteínas presentes en inmunoprecipitados obtenidos a partir de estas líneas celulares desmontables también será una aplicación útil del método. Además de la transcripción acoplado / empalme ensayo que se utilizó como un ejemplo para nuestra descripción protocolo aquí, los extractos de pequeña escala debe ser aplicable en general a numerosos ensayos funcionales y bioquímicas, tales como los utilizados para el pt diferenteeps en la expresión génica (por ejemplo, nivelación, el empalme, la transcripción, poliadenilación, procesamiento de microARN). El protocolo también puede adaptarse para tipos de células del paciente que pueden ser obtenidos ya sea en suspensión (tal como las células CLL) o en cultivos (tales como los fibroblastos del paciente). Finalmente, la fracción citoplásmica obtenida durante el procedimiento debería ser útil para ensayos funcionales y bioquímicas que requieren el citoplasma.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Nombre completo del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 4 - (2-hidroxietil) piperazina-1-etanosulfónico </td><td> Sigma </td><td> H3375-500G </td></tr><tr><td> MgCl 2 .6 H 2 O </td><td> Hexahidrato de cloruro de magnesio </td><td> Sigma </td><td> M2670-500G </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Cloruro de Potasio </td><td> Pescador </td><td> P335-212 </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Fluoruro de fenilmetanosulfonilo </td><td> Sigma </td><td> P7626-100G </td></tr><tr><td> TDT </td><td> Ditiotreitol </td><td> América Bioanalítica </td><td> AB00490-5G </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Ácido etilendiaminotetraacético, disódica, dihidrato </td><td> América Bioanalítica </td><td> AB00500-01000 </td></tr><tr><td> Glicerol </td><td></td><td> MP Biomedicals </td><td> 800689 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Medio Esencial Mínimo de Dulbecco </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-073 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Suero Bovino Fetal </td><td> Gibco </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> La penicilina / estreptomicina </td><td></td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Tampón fosfato salino </td><td> Cellgro </td><td> 21 a 040 CV </td></tr><tr><td> Trypan mancha azul del 0,4% </td><td></td><td> Gibco </td><td> 15250 </td></tr><tr><td> Elevadores de celulares </td><td></td><td> Corning </td><td> 29442-200 </td></tr><tr><td> Las placas de 150 mm </td><td></td><td> VWR </td><td> 353025 </td></tr><tr><td> Extendido punta de la micropipeta </td><td></td><td> Denville </td><td> P1126 </td></tr><tr><td> Homogeneizador Dounce, 1 ml, con su correspondiente mano apretada </td><td></td><td> Wheaton </td><td> 357538 </td></tr><tr><td> Slidealyzers, MWCO 10 kDa </td><td></td><td> ThermoScientific </td><td> 69572 </td></tr><tr><td> Mini-Centricons, MWCO 3kDa </td><td></td><td> Millipore (Amicon) </td><td> UFC500396 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos y equipos específicos. <table border="1"><tbody><tr><td> Solución </td><td> Final </td><td> Valores </td><td> Dispensar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hipotónica </td><td> HEPES 10 mM, pH 7,9 </td><td> HEPES 1M, pH 7,9 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td> &lt;td&gt; 1,5 mM MgCl 2 </td><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 750 l </td></tr><tr><td></td><td> 10 mM de KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 1,67 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM PMSF </td><td> 200 mM de PMSF </td><td> 500 l </td></tr><tr><td></td><td> 0,5 mM de DTT </td><td> 2M TDT </td><td> 125 l </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Llevar hasta 500 ml con agua </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bajo en Sal </td><td> HEPES 20 mM, pH 7,9 </td><td> HEPES 1M, pH 7,9 </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td></td><td> 1,5 mM de MgCl 2 </td><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 150 l </td></tr><tr><td></td><td> 20 mM de KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 667 l </td></tr><tr><td> &amp; Nbsp; </td><td> 0,2 mM de EDTA </td><td> 0,5 M EDTA </td><td> 40 l </td></tr><tr><td></td><td> 25% de glicerol </td><td> Glicerol </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM PMSF </td><td> 200 mM de PMSF </td><td> 100 l </td></tr><tr><td></td><td> 0,5 mM de DTT </td><td> 2M TDT </td><td> 25 l </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Trae hasta 100 ml con agua </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Salinidad </td><td> HEPES 20 mM, pH 7,9 </td><td> HEPES 1M, pH 7,9 </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td></td><td> 1,5 mM de MgCl 2 </td><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 150 l </td></tr><tr><td></td><td> 1,4 M KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 48 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM de EDTA </td><td> 0,5 M EDTA </td><td> 40 l </td></tr><tr><td></td><td> 25% de glicerol </td><td> Glicerol </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM PMSF </td><td> 200 mM de PMSF </td><td> 100 l </td></tr><tr><td></td><td> 0,5 mM de DTT </td><td> 2M TDT </td><td> 25 l </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Trae hasta 100 ml con agua </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diálisis </td><td> HEPES 20 mM, pH 7,9 </td><td> HEPES 1M, pH 7,9 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td></td><td> 100 mM de KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 16.625 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM de EDTA </td><td> 0,5 M EDTA </td><td> 200 l </td></tr><tr><td></td><td> 20% de glicerol </td><td> Glicerol </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM PMSF </td><td> 200 mM de PMSF </td><td> 500 l </td></tr><tr><td></td><td> 0,5 mM de DTT </td><td> 2M TDT </td><td> 125 l </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Llevar hasta 500 ml con agua </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Soluciones para la preparación del extracto nuclear.

small-scale nuclear extracts for functional assays of gene-expression machineries

Una gran cantidad de avances en la expresión de la comprensión genética se ha realizado utilizando sistemas in vitro. Para la mayoría de los estudios, ensayos funcionales se llevó a cabo utilizando extractos que se preparan en grandes cantidades a 10-50 o más litros de células cultivadas en suspensión. Sin embargo, estas preparaciones a gran escala no son susceptibles de prueba rápida de los efectos in vitro que resultan de una variedad de tratamientos celulares in vivo o condiciones. Este artículo de vídeo revista muestra un método para preparar funcionales pequeños extractos nucleares, utilizando células HeLa como un ejemplo. Este método se lleva a cabo utilizando tan sólo tres placas de 150 mm de las células cultivadas como monocapas adherentes. Para ilustrar la eficacia de los extractos de pequeña escala, que demostrar que son tan activos como los extractos nucleares a granel para acoplados a la RNA polimerasa II transcripción / empalme de las reacciones. Para demostrar la utilidad del protocolo extracto, se muestra que el empalme se suprime en los extractos preparados a partir de células HeLas tratados con el fármaco inhibidor de empalme E7107. El protocolo de pequeña escala deben ser aplicables a cualquier proceso o tipo de célula que puede ser investigado in vitro utilizando extractos celulares. Estas incluyen las células del paciente que sólo están disponibles en cantidades limitadas o las células expuestas a numerosos agentes como las drogas, los agentes que dañan el ADN, los ARNi, o de transfección, que requieren el uso de las poblaciones de células pequeñas. Además, pequeñas cantidades de células recién cultivadas son convenientes y / o necesario para algunas aplicaciones.

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Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Un protocolo para la preparación de los sólidos, los pequeños extractos nucleares HeLa se describe. Este protocolo es muy valioso para los ensayos que requieren el uso de pequeñas poblaciones de células, como las células tratadas con drogas o RNAi. El método debe ser aplicable a una amplia variedad de ensayos de expresión de genes y otros tipos de células, incluyendo células del paciente.

Los pequeños extractos nucleares para ensayos funcionales de los mecanismos de expresión de genes

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

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Research

JoVE Journal

Biology

25.8K vistas.  Harvard Medical School. Un protocolo para la preparación de los sólidos, los pequeños extractos nucleares HeLa se describe. Este protocolo es muy valioso para los ensayos que requieren el uso de pequeñas poblaciones de células, como las células tratadas con drogas o RNAi. El método debe ser aplicable a una amplia variedad de ensayos de expresión de genes y otros tipos de células, incluyendo células del paciente.

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Gen bacteriano y Análisis de Expresión El uso de microarrays

Investigación

Biología

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

En la Asamblea Vitro nucleares utilizando fraccionado extractos de huevo Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 2 of 3.

Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

La médula espinal de Electrofisiología

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Un alelo-específicas Gene ensayo de expresión para probar la base funcional de las asociaciones genéticas

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...