המחברים מבקשים להודות קתרין אלפורד לקבלת הצעות על התא דיסוציאציה שיטות וקווין ולר, דוד פלאהרטי ואת בריטני מטלוק על התמיכה ב משאבים תזרים Cytometry משותף באוניברסיטת ונדרבילט מרכז רפואי ומליסה א Musser לסיוע אמנותי עם איורים. אנו מודים בני הזוג. ג&#39;ק מושר ושון מוריסון עצה יישום הבידוד של אבות עצביים. תזרים VMC Cytometry המשאב המשותף הוא נתמך על ידי אינגרם ונדרבילט במרכז לחקר הסרטן (p30 CA68485) לבין מחלות העיכול ונדרבילט מרכז המחקר (p30 DK058404). עבודה זו נתמכה על ידי ארה&quot;ב במימון מכוני הבריאות הלאומיים מענקים DK064251, DK086594, ו DK070219.

1. הכנת מדיה (כל השלבים נעשה מכסה המנוע בתרבית רקמה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב הבא: 44 מ&quot;ל L-15 בינוני, 0.5 מ&quot;ל 100x פניצילין / סטרפטומיצין (P / S), 0.5 מ&quot;ל 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​שור סרום אלבומין (BSA), 0.5 HEPES מ&quot;ל 1M, 5 רקמות מ&quot;ל מים תרבות כיתה. יש להקפיד לערבב BSA ו-P / S היטב לפני הוספת. נפח זה אמור להיות מספיק דיסוציאציה של עד חמישה סוגי רקמות שונות. מדיה זה ישמש בשלב 3.4 להכין פתרונות מרווה לשימוש לאחר ניתוק האנזימטית של רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Media סינון אם כי 0.22 מיקרומטר Polyethersulfone (PES) מסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסת מלח מאוזן 1X של האנק (HBSS) ופוספט 1X שנאגרו מלוחים (PBS) ממניות 10x באמצעות תרביות רקמה מים בכיתה. לסנן דרך 0.22 מיקרומטר סינון PES. כמויות גדולות של חומרים כימיים אלה אפשר להכין מראש ולאחסן ב 4 ° C, aliquoting כמויות קטנות יותר של מכסה המנוע בתרבית רקמה לפי הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא מספר 15 צינורות חרוטי מ&quot;ל עם 1x HBSS, (מספר צינורות שווה את מספר רקמות אתה מתכנן המשנה לנתח) שמירה על צינורות על הקרח. </li></ol> 2. בתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים בעיתוי העכבר בהריון בהתאם טיפול בבעלי חיים המוסדית הוועדה להשתמש בפרוטוקולים מאושרים והרחם העברת לתוך 60 או 100 מ&quot;מ צלחת פטרי המכילה קרח קר 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עוברים מן הרחם להרדים על ידי עריפת ראש של קר כקרח 1X PBS. מסך בנפרד תחת תאורה פלואורסצנטי, חלוקת לתוך חיוביות (WT) בריכות מהונדס ופרוע מסוג nontransgenic. שמור עוברים קר כקרח 1X PBS ברחבי לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, משנה לנתח את מערכת המין ודרכי השתן. להחזיק את העובר במקום ברמה forelimb עם מלקחיים עדינים. הסר את הקרביים מהכבד אל גבשושית איברי המין על ידי החדרת מלקחיים ברמה של הסרעפת ואז בזריזות מושך את האיברים הפנימיים כלפי מטה מהקיר הגוף הגבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן משנה לנתח את הרקמה שלעניין מן הרקמה הסובבת (איור 1). מניחים כל סוג בנפרד המשנה גזור רקמה לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל המכיל קרים כקרח HBSS 1X. בריכת כל סוג רקמה יחד לפי פנוטיפ העובר (כלומר את כל ה-GFP + דגימות של המעי העובר הם אספו בצינור אחד 15 מ&quot;ל חרוטית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל, לנתח רקמות דומים של wild-type עוברים לשימוש עבור פקדים פיצויים על cytometry הזרימה. </li></ol> 3. דיסוציאציה של רקמות Subdissected <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה המשנה גזור רקמות על ידי צנטריפוגה לעבר כוח צנטריפוגלי 210 יחסית (RCF), 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, לשאוב את HBSS כמו רבים ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend רקמות גלולה ב Accumax (התא טכנולוגיות חדשניות, Inc), אך יש להקפיד לשנות טיפים פיפטה בין מדגם זה, כדי למנוע זיהום צולבות של סוגי רקמות. סכום נוסף של Accumax וניתן לשנותם על כמויות גדולות יותר או קטן יותר של רקמת גוף. בדרך כלל 1-5 דגימות המעי העובר, 1 מ&quot;ל של Accumax ישמשו אך בריכות רקמות גדולות יותר ידרוש נפח גדול יותר כדי להשיג ניתוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום צינורות לתוך 37 ° C אמבט מים במשך 20-45 דקות, תלוי בשלב של רקמת בידוד (למשל 13.5 DPC המעי 20 דק &#39;, 15.5 דקות 35 DPC המעי). באמצע הדרך כי הזמן דיסוציאציה, באופן ידני לשבור את הרקמה על ידי דפיקות צינור על הצד של האמבטיה במים (או כל משטח מוצק) ועל ידי &quot;מצליף&quot; צינור (כפי שניתן היה ללחוץ את המדחום הישן כספית). בתום הזמן לחזור על ניתוק ללחוץ כלפי מטה מספר פעמים ההליך עוד יותר לנתק את המדגם. לקבלת דוגמיות יותר שבירים, להפחית את נחישות של שייק למטה במקום להשתמש טחינה דקה פיפטה במהלך שלב 3.5 כדי להשיג רמה נאותה של דיסוציאציה. טיפוסי פעמים דיסוציאציה עבור 14.5 ו 15.5 DPC DPC LUT הם 35 ו 45 דקות, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד רקמות דוגרים על Accumax, איפור מרווה כךlutions, כינה דובדבני לרוות את 01:05. להרוות נעשית על ידי הוספת 45 μl 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​DNase אני עד 6 מ&quot;ל L-15 מדיה. להרוות 01:05 מיוצר על ידי הוספת 45 μl 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​DNase אני ל -30 מ&quot;ל L-15 מדיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של דיסוציאציה, להעביר 15 מ&quot;ל צינורות אל הקרח ומיד להוסיף 1 מ&quot;ל כדי להרוות צינור אחד. Triturate כל מדגם מעלה ומטה עד רקמת כמעט ניתק לחלוטין (איור 2). עדיין יהיו כמה גושים קטנים של רקמה בתמיסה. השגת דגימה הומוגנית לחלוטין אינו בר השגה בקלות ואינו רצוי כיוון שהיא יכולה לגרום כדאיות התא עניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על מדגם על הקרח כמה שיותר עד סוף הפרוטוקול. הקפד להשתמש קצה פיפטה טרי כאשר pipetting עד לצנן או דובדבני 1:05, כדי למנוע זיהום צולבות של דגימות. </li></ol> 4. סינון השעיה Cell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים, כי כבר מושרים אתנול 70%, מקום 3 ס&quot;מ רבועים של קרום ניילון 38 מיקרומטר (רשת Sefar אמריקה) עלהפה של צינור חדש מ&quot;ל 15 חרוטי. תאים לסנן דרך רשת על ידי pipetting למרכז של הממברנה באמצעות טיפים נשא צרים. אם הקרום הופך להיות רווי תוך סינון, להסיר אותו, לייבש את קצה הצינור עם kimwipe, ולהשתמש קטע חדש של רשת ניילון לסנן את יתרת ההשעיה התא. לאחר כל התאים כבר מסוננים, השתמש 1 מ&quot;ל דובדבני 1:05 לשטוף את צינור ולסנן את כל התאים הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת סינון הושלמה, או בעת החלפת הממברנה סתום, להשתמש במלקחיים להפשיל את הצדדים של רשת ולנגב את הקרום לרוחב החלק העליון של הצינור ולהסיר כל טיפות תלויים של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה ההשעיה התא על ידי צנטריפוגה ב 210rcf, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לשאוב את supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל להרוות 01:05. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא ההשעיה סינון דרך רשת ניילון לתוך 5 מ&quot;ל צינורות קלקר. לשטוף את הצינור 15 מ&quot;ל 1 מ&quot;ל עם דובדבני 01:05 וסינון כדי ללכוד את כל התאים הנותרים. </li></ol> 5. הכנת דוגמאות עבור FACS <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם באמצעות רקמות זהה למיון של פקדים פיצויים, להעביר 1/10 עד ה ה 1/20 של היקף המדגם כדי צינור חדש 5 מ&quot;ל קלקר להשתמש עבור פקדי פיצויים. מחלקים את המדגם wild-type רקמות לשני חלקים. חלק אחד יהיה בלא כתם wild-type (&#39;ט&#39; בלבד), ואילו המחצית השנייה תהיה 7-Aminoactinomycin D (7-AAD, intercalator ניאון מחוץ תאים חיים המשמשים &quot;הכדאיות כתם&quot;) הוסיף לו (7-AAD בלבד ). בקרות אלה בודדים יש צורך, כדי לאפשר פיצוי על כל חפיפה בין ספקטרום פליטה של ​​fluorophores בדידים ב סדרן לזרום. למשל, על הכתב ניאון אחד כמו EGFP, פקדי הדרושים יכלול: EGFP בלבד, תאים WT בלא כתם, וכן צינור מוכתם 7-AAD בלבד (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את כל 5 מ&quot;ל צינורות המכילים ההשעיה התא עם 01:05 להרוות ו צנטריפוגות ב 210rcf, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. Aspirate supernatant, והשאיר כ 200 μl של הנוזלבצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 7-AAD 1:1000 ב 01:05 להרוות. הוסף 7-AAD דילול מכתים לשליטה 7-AAD פיצוי רק דגימות להיות מסודר. אל תוסיף 7-AAD כדי EGFP בלבד או WT שולטת פיצויים בלבד. נפח 7-AAD כדי להוסיף ישתנו בהתאם כמות החומר ההתחלתי וגודל התא גלולה להשיג. לאחר 7-AAD נוספה צינורות מתאימים, דגימות מוכנים להיות מסודר. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רקמה </td><td> בריכת גודל המדגם </td><td> כרך 7-AAD כדי להוסיף * צינור </td></tr><tr><td> 15.5 DPC המעי </td><td> 1-5 </td><td> 200 μl </td></tr><tr><td> 15.5 DPC LUT </td><td> 1-5 </td><td> 150 μl </td></tr></tbody></table> טבלה 1. סכום של 7-AAD נוסף dissociates רקמות שונות * הסכום הכולל הסופי של צינור זה משתנה בהתאם לסכום הנע בין 50-100 μl מאז השאיפה של התקשורתעכ תהליך משוער וביצע להימנע גלולה. הכרכים האחרונים אינם נמדדים על מנת למזער את הטיפול התאים בתמיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צינורות איסוף ללכוד תאים של בידוד RNA על ידי הוספת 0.75 ml TRIzol-LS ל 1.5 צינורות microcentrifuge מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם איסוף תאים עבור בתרבות חוץ גופית, ולא בידוד RNA, תאים המיון ישירות לתוך עצמי חידוש התקשורת 6 צלחות תרבות גם רקמות, מצופה fibronectin ומלא התקשורת כפי שתואר לעיל. 2,6,7 </li></ol> 6. תזרים Cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב cytometer את זרימת, להעריך את הפיצוי פקדי 1, אך יש להקפיד לשטוף את הגב בין מדגם זה, כדי למנוע זיהום. שימוש בפרופילים של דגימות פיצויים להגדיר מתח / שערים למיון. שים לב שאם תאים חיוביים רקמות הרצוי נמצאים מספרים מגבילים, רקמה ייחודית שניתן להשתמש בהם כדי להקים את הגדרות פיצוי, כל עוד עוצמת הקרינה ואת גודל התאבין מדגמים דומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת פרמטרים פיצויים ושערים להימנע תאים מתים כי לקחת את 7-AAD צבע ולאסוף תאים המציגים בעוצמה גבוהה יחסית של הקרינה GFP לבקרות בלא כתם (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיין בצורה מקסימלית על 25,000 תאים לתוך צינור אחד microcentrifuge. מיון יש לבצע בלחץ הנמוך ביותר עם ​​זרבובית משעמם רחב ספיקה נמוכה (למשל, 17psi, 100 מיקרומטר זרבובית, 3,000 אירועים / sec) כדי לשמר את הכדאיות אבי העצבית. עבור מיני לבודד EGFP + תאים אנו מבצעים isolations שלנו על Biosciences BD FACSAriaII באמצעות לייזר 20mW 488nm לעורר את כתב EGFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הדגימות מכילות ריכוזים גבוהים סלולריים, רצוי לדלל עוד יותר את ההשעיה התא באמצעות 1:1000 7-AAD כתם על מנת להשיג יעילות גבוהה יותר ללכוד בעת מיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל צינור מערבולת של תאים בשבי TRIzol-LS מיד לאחר מיון. </li></ol> 7. נציג תוצאות רקמת הניתוק כדי לייצר תאים השעיות למיון הזרימה היא איזון עדין בין עיכול אנזימטי מספקת והימנעות יתר מערכת העיכול שיכולה לגרום viabilities סלולריים נמוכים. דוגמה הרמה הרצויה של רקמת ניתוק מוצג באיור 2. ברקמת מתעכל כראוי לפני חתיכות טחינה דקה ידנית של איברי המשנה גזור עדיין בבירור (איור 2b, 2F). ברקמות כי מטופלים enzymatically למשך זמן רב מדי זמן או בריכוז גבוה מדי של האנזים, וכתוצאה מכך הפסקת חסר כל חלקים גדולים שאריות של רקמות (איור 2 ד, 2h). דיסוציאציה המתאים ידנית סינון לייצר פרופילי המיון בבית cytometry זרימה, כי בדרך כלל מציגים יותר מ -90% תאים קיימא ולהראות רמות גבוהות של ביטוי EGFP (איור 4). אוכלוסיות תאים המתקבלים בשיטה זו המחשה טובההכדאיות והוא יכול ליפול בפח לתרבות לאחר ניתוח או של ביטוי גנים על ידי gating על לכידתו של EGFP + אבות עצביים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig1.jpg" /> באיור 1. התפלגות TH-EGFP + נוירונים אבות ב LUT העכבר העובר. שלמה, הר בדרכי המין ודרכי השתן ב 15.5 DPC הנצפים ventrally תחת תאורה בשדה בהיר (א) לעומת חלוקת EGFP + תאים המסומנים ע&quot;י ביטוי TH-EGFP transgene מזוהה תחת תאורה פלואורסצנטי (ב). TH-EGFP הביטוי קיים יותרת הכליה (א) ו הגרעינים צליאק ממוקם מדיאלית (CG). מבט לרוחב (ג) 15.5 DPC TH-EGFP משנה גזור תערוכות שלפוחית ​​השתן הקרינה מן הביטוי transgene בגרעיני האגן (PG), קיר שלפוחית ​​השתן (בלה) ו השופכה (U). לאור הגבי (ד) EGFP + תאים ניכרים השופכה הגבית קדמית. תוויות אחרות: כליות (K), testis (T), שלפוחית ​​השתן (בלה) ו גבשושית איברי המין (GT). <imgalt = &quot;איור 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4188/4188fig2.jpg&quot; /&gt; איור 2. תמונות brightfield של LUT DPC 15 עוברי (א) ו המעי (ה), בהתאמה, צילמו באמצע תקופת הדגירה דיסוציאציה, בסוף הדגירה לפני ניתוק הפרעה (ב, ו), לאחר שיבוש ידנית (ג, ז), וכן במדגם כי כבר ניתק יתר על המידה (ד, ח). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig3.jpg" /> איור 3. תרשים סכמטי ממחיש פיצוי שולט צורך להקים מחמירות FACS פרמטרים gating. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig4.jpg" /> איור 4. התמונה נציג פרופילים מיון הזרימה ב 14.5 DPC (א) ו 15.5 DPC (ב). האוכלוסייה השחורה מורכב של תאים בודדים על בסיס פיזור קדימה בצד, כי הם מתים ומסומן על ידי7-AAD פלואורסצנטי. האוכלוסייה גריי מורכב תאים גופיית המבוססים על פיזור קדימה הצד אשר נכללו 7-AAD הם ישימים מבחינה בכך. אוכלוסייה מגודרת הירוק, הכיתוב &quot;GFP +&quot; התאגרף האזור מורכב של תאים בודדים אשר נכללו 7-AAD (בת קיימא) ולהציג הקרינה EGFP.

<ol>
	<li>Gong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Kruger, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+persist+in+the+adult+gut+but+undergo+changes+in+self-renewal,+neuronal+subtype+potential,+and+factor+responsiveness.">Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness.</a> Neuron. 35, 657-669 (2002).</li><li>Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+differences+between+stem+cells+from+different+regions+of+the+peripheral+nervous+system+regulate+the+generation+of+neural+diversity.">Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity.</a> Neuron. 35, 643-656 (2002).</li><li>Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+impacts+developmental+potential+of+enteric+neural+crest-derived+progenitors+in+the+Sox10Dom+model+of+Hirschsprung+disease.">Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).</li><li>Skarnes, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Harding, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GUDMAP+database--an+online+resource+for+genitourinary+research.">The GUDMAP database--an online resource for genitourinary research.</a> Development. 138, 2845-2853 (2011).</li><li>Joseph, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li><li>Newgreen, D. F., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+outgrowth+cultures+and+the+analysis+of+cell+migration.">Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

הכתב עכבר קווים המבטאים כתבים ניאון הופכים להיות זמינים באופן נרחב באמצעות מאמצים מרובים Murine גנטיקה הקהילה 1,8,9. כתוצאה מכך שיטת ניתוק מאויר כאן יכולים להיות מיושמים באופן נרחב על בידודו של תת נוירונים בדידים המבוססים על עצבי או ביטוי דפוסי הקולטן מ משני רקמות ?...

The authors middle initials were omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/4188">An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice</a>.

Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב שם </td><td> מוכר </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> סיגמא (המימון המינימלי הנדרש: התא טכנולוגיות חדשניות) </td><td> A7089-100 מ&quot;ל </td><td> אחסן קפוא 1 aliquots מ&quot;ל </td></tr><tr><td> אני DNase </td><td> סיגמא </td><td> D-4527 </td><td> מאוחסן קפוא ב -20 ° C 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב 1xHBSS, (משמש להרוות, תכבו 01:05) </td></tr><tr><td> PH 7.4 10X PBS </td><td> Gibco </td><td> 70011-044 </td><td> לעשות עד 1x במים תרבות רקמות כיתה ואז מסנן סטרילי </td></tr><tr><td> 10X HBSS W / O CA או Mg </td><td> Gibco </td><td> 14185-052 </td><td> לעשות עד 1x במים תרבות רקמות כיתה ואז מסנן סטרילי </td></tr><tr><td> ליבוביץ של L-15 בינוני </td><td> Gibco </td><td> 21083027 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין 100x </td><td> Gibco </td><td>15140-133 </td><td> חנות aliquoted ב -20 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> סיגמא </td><td> A3912-100 גרם </td><td> אחסן aliquoted ב -20 ° C, 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במים </td></tr><tr><td> Biowhittaker 1M HEPES ב NaCl 0.85% </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> 38 מיקרומטר NITEX ניילון קווי ממברנה </td><td> Sefar אמריקה </td><td> 3-38/22 </td><td> חותכים ~ 3 ריבועים ס&quot;מ. UV לטיפול לילה לעקר בשכונה בתרבית רקמה. </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> Invitrogen </td><td> A1310 </td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> TRIzol LS </td><td> Invitrogen </td><td> 10296-028 </td><td></td></tr><tr><td> 5 מ&quot;ל צינורות קלקר </td><td> בז </td><td> 352058 </td><td></td></tr><tr><td> 15 צינורות חרוטי מ&quot;ל </td><td> קורנינג </td><td> 430790 </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים המבתרים יפות </td><td> המדע מכשירים דקים </td><td> 11251-30 </td><td> דומון # 5 Forcep, Dumoxel, רמת עצה 0.1x0.06mm </td></tr><tr><td> לנתח את כף </td><td> המדע מכשירים דקים </td><td> 10370-18 </td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice

במהלך ההתפתחות העצבית לפסגה (NC) הנגזרות אבות נוירונים נודדים מן הצינור העצבי ליצירת הגרעינים האוטונומית באיברים כמו המעי בטן ועל דרכי השתן התחתונות. הן במהלך פיתוח ברקמות בוגרים תאים אלה הם לעתים קרובות מפוזרים באופן נרחב בכל הרקמות, כך בידוד אוכלוסיות נפרדות באמצעות שיטות כמו לכידת לייזר מיקרו לנתיחה קשה. הם יכולים עם זאת דמיינו ישירות על ידי הביטוי של עיתונאים המונעים על ניאון מאזורים הרגולציה של נוירון גנים ספציפיים כמו hydroxylase טירוזין (ה &#39;). אנו מתארים את שיטת אופטימיזציה עבור תשואות גבוהות של TH + קיימא אבות עצביים מרקמות העכבר בטן העובר, כולל המעי בדרכי המין ודרכי השתן התחתונה (LUT), המבוסס על דיסוציאציה הקרינה המופעל מיון תאים (FACS). ה &#39;הגן המקודד את האנזים מגביל את שיעור לייצור catecholamines. אבות עצביים אנטרי מתחילים להביע TH durלאינג ההגירה שלהם במעי העובר 1 ו TH נוכחת גם משנה של נוירונים בוגרים הגרעינים האגן 2-4. ההופעה הראשונה של שושלת זו לבין חלוקת נוירונים אלה בהיבטים אחרים של LUT, ובידוד שלהם לא תוארה. אבות נוירונים המבטאים TH ניתן דמיינו בקלות על ידי ביטוי EGFP בעכברים נושאי מבנה transgene Tg (TH-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. אנחנו צילמו ביטוי transgene זה בעכברים עובריים כדי לתעד את חלוקת TH + תאים LUT פיתוח ב 15.5 ימים שלאחר משגל (DPC), מייעדים הבוקר של זיהוי plug כמו 0.5 DPC, ו ציין כי תת קבוצה של אבות העצבית התגבשו האגן הגרעינים אקספרס EGFP. לבודד TH + LUT אבות עצביים, אנו אופטימיזציה שיטות ששימשו בתחילה לטהר גזע עצביים לפסגה תאים מהמעי העכבר העובר 2-6. מאמצים קודמים לבודד NC-derived אוכלוסיות לסמוך עלעיכול עם קוקטייל של collagenase ו טריפסין להשיג השעיות התא עבור cytometry הזרימה. בידינו שיטות אלה מיוצרים השעיות סלולריים מ LUT עם כדאיות נמוכה יחסית. לאור השכיחות הנמוכה ממילא של אבות עצביים ברקמות העובר LUT, יצאנו כדי לייעל את שיטות ניתוק כאלה הישרדות התא של dissociates האחרונים היה להיות מוגברת. קבענו כי ניתוק עדינה Accumax (התא טכנולוגיות חדשניות, Inc), הוראות סינון, מיון וזרימה בלחצים נמוכים אפשרה לנו להשיג שרידות גבוהה יותר באופן עקבי (&gt; 70% של תאים הכולל של הפורום) עם תשואות הבאות של אבות עצביים מספיקים לניתוח במורד הזרם. שיטת הפעולה המתואר יכול להיות מיושם באופן כללי לבודד מגוון של אוכלוסיות נוירונים מ משני Murine רקמות עובריות או מבוגר.

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice at JoVE.com

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

הליך אופטימיזציה לטהר עצביים לפסגה הנגזרות אבות עצביים מרקמות העכבר העובר מתוארת. שיטה זו מנצלת את הביטוי של אללים הכתב ניאון לבודד אוכלוסיות נפרדות על ידי מיון הקרינה המופעל תאים (FACS). הטכניקה ניתן ליישם על מנת לבודד subpopulations עצביים לאורך ההתפתחות או ברקמות בוגרים.

נוהל אופטימליים עבור Fluorescence המופעל בידוד מיון (FACS) תא של אבות עצביות האוטונומית מאיברים בטן של עכברים עוברית

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

an-optimized-procedure-for-fluorescence-activated-cell-sorting-facs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

13.6K Views.  Vanderbilt University School of Medicine. הליך אופטימיזציה לטהר עצביים לפסגה הנגזרות אבות עצביים מרקמות העכבר העובר מתוארת. שיטה זו מנצלת את הביטוי של אללים הכתב ניאון לבודד אוכלוסיות נפרדות על ידי מיון הקרינה המופעל תאים (FACS). הטכניקה ניתן ליישם על מנת לבודד subpopulations עצביים לאורך ההתפתחות או ברקמות בוג?...

Video: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout the developing vertebrate embryo. In addition to providing peripheral glia and neurons, NCC generate melanocytes as well as most of the cranio-facial skeleton. NCC migration and differentiation is controlled by a combination of their axial origin along the neural tube and their exposure to regionally distinct extracellular cues. Such contribution of extracellular ligands is especially evident during the formation of the enteric nervous system (ENS), a complex interconnected network of neural ganglia that locally controls (among other things) gut muscle movement and intestinal motility. Most of the ENS is derived from a small initial pool of NCC that undertake a long journey in order to colonize - in a rostral to caudal fashion - the entire length of the prospective gut. Among several signaling pathways known to influence enteric NCC colonization, GDNF/RET signaling is recognized as the most important. Indeed, spatiotemporally controlled secretion of the RET ligand GDNF by the gut mesenchyme is chiefly responsible for the attraction and guidance of RET-expressing enteric NCC to and within the embryonic gut. Here, we describe an ex vivo cell migration assay, making use of a transgenic mouse line possessing fluorescently labeled NCC, which allows precise quantification of enteric NCC migration potential in the presence of various growth factors, including GDNF.

We present an ex vivo cell migration assay that allows precise quantification of enteric neural crest cell migration potential in the presence of various growth factors.

Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

ביטוי גנים מסוג התא ספציפי באמצעות סלולארי קרינה המופעל מיון לבדיקת רקמות במוח החולדה

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

מיון תא של תאי גזע ועצביים ממבוגרי עכבר Subventricular האזור וחי-הדמיה של Dynamics תא המחזור שלהם

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific sets of sparsely distributed activated neurons called neuronal ensembles that mediate learned associations. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) has recently been optimized for adult rat brain tissue and allowed isolation of activated neurons using antibodies against the neuronal marker NeuN and Fos protein, a marker of strongly activated neurons. Until now, Fos-expressing neurons and other cell types were isolated from fresh tissue, which entailed long processing days and allowed very limited numbers of brain samples to be assessed after lengthy and complex behavioral procedures. Here we found that yields of Fos-expressing neurons and Fos mRNA from dorsal striatum were similar between freshly dissected tissue and tissue frozen at -80 &#186;C for 3 - 21 days. In addition, we confirmed the phenotype of the NeuN-positive and NeuN-negative sorted cells by assessing gene expression of neuronal (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) and microgial (Iba1) markers, which indicates that frozen tissue can also be used for FACS isolation of glial cell types. Overall, it is possible to collect, dissect and freeze brain tissue for multiple FACS sessions. This maximizes the amount of data obtained from valuable animal subjects that have often undergone long and complex behavioral procedures.

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Here we present a Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol to study molecular alterations in Fos-expressing neuronal ensembles from both fresh and frozen brain tissue. The use of frozen tissue allows FACS isolation of many brain areas over multiple sessions to maximize the use of valuable animal subjects.

רקמות קרינה הופעלו מיון תאים (FACS) וניתוח ביטוי גנים של נוירונים Fos להביע מ טרי קפוא מוח החולדה

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. Additionally, epigenetic chromatin modifications, like histone methylation, have an important role for establishing and maintaining specific cell fates within this process. The vast majority of histone methylation occurs on the flexible histone tail, which is accessible to histone modifiers, erasers, and histone reader proteins. In contrast, H3K79 methylation is located in the globular domain of histone 3 and is implicated in different developmental functions. H3K79 methylation is evolutionarily conserved and can be found in a wide range of species from Homo sapiens to Saccharomyces cerevisiae. The modification occurs in different cell populations within organisms, including neural progenitors. The location of H3K79 methylation in the globular domain of histone 3 makes it difficult to assess. Here, we present methods to isolate and culture cortical progenitor cells (CPCs) from embryonic cortical brain tissue (E11.5-E14.5) or cerebellar granular neuron progenitors (CGNPs) from postnatal tissue (P5-P7), and to efficiently immunoprecipitate H3K79me2 for quantitative PCR (qPCR) and genome-wide sequencing.

We present an effective and reproducible method to isolate and culture neural progenitor cells from embryonic and postnatal brain tissue for chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - a histone mark located within the globular domain of histone 3.

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

התא הראשי תרבות של מטוהרים GABAergic או Glutamatergic נוירונים הוקמה באמצעות מיון תאים פלואורסצנטית מופעל

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Dissection of Pelvic Autonomic Ganglia and Associated Nerves in Male and Female Rats

The bilateral major pelvic ganglia (MPG; synonym, pelvic ganglia) are the primary source of postganglionic sympathetic and parasympathetic neurons innervating pelvic organs of rodents; the functionally equivalent structure in humans is the inferior hypogastric plexus. The major pelvic ganglia also provide the route by which lumbar and sacral sensory axons reach the pelvic organs. These complex, mixed ganglia can prove challenging to identify and dissect for further experimental study of normal autonomic mechanisms or to establish preclinical models of disease, injury or visceral pain. Here we describe a protocol to access and visualize these ganglia and their associated nerve tracts. We provide this protocol with schematics for both male and female rats, as the ganglion size and landmarks for identification differ between sexes. The protocol describes removal of the ganglion for in vitro studies, but this method can be integrated into a surgical recovery protocol for experimental interventions (e.g., nerve crush, nerve resection) or for mapping neuronal circuits (e.g., by microinjection of neural tracers). We also demonstrate the primary structures of the ganglion and its associated nerves immediately following dissection and following immunohistochemical staining.

The major pelvic ganglia contain parasympathetic and sympathetic neurons that innervate pelvic organs. Here we describe a dissection method and provide schematics for identification of these ganglia and their associated nerves. These methods can be applied to experimental manipulation of these ganglia in vivo or removal post-mortem for further study.