קולטני P2X7 הם מאוד תכליתי לתפקד באופן שונה בהתאם לכמות של אגוניסט הנוכחי. בדרך זו, P2X7 יש פונקציות שונות והוא יכול לווסת את הפיזיולוגיה של מערכות רבות ושונות. פרוטוקול זה מאפשר חקירה של שלוש הפונקציות העיקריות של קולטן P2X7.
זוהי שיטה מהירה, ניתנת לשחזור וכימות להבנת תפקידה. ההתמקדות שלנו באופן שבו קולטני P2X7 יכולים לווסת בתאי ניוון עצביים. עם זאת שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות כדי להתאים לכל סוג תא.
תלמידים שקראו מספיק ספרות לפני שניסו את ההליך הזה יכולים ללמוד את זה ביום אחד בלבד ויהיו מסוגלים להריץ את זה לבד אחרי שניים או שלושה ניסיונות. התחל הליך זה על ידי קבלת תאים סניטריים עצביים מן אזור subventricular והיפוקמפוס של עכברים בוגרים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לשמור על תרבויות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
נוירוספרות צריך להיווצר לאחר שבעה עד 10 ימים היא המעבר אפס תרבות אזור sub חדרים ואחרי 15 עד 20 ימים בתרבות ההיפוקמפוס. לאחר שלב המעבר הראשוני אפס תרבות, מעבר כל שבעה עד 10 ימים לפי הצורך באמצעות ארון בטיחות ביולוגי ושיטות תרבות רקמות סטנדרטיות. מעבר הכדורים כאשר הם מגיעים 150 עד 200 מיקרון בקוטר.
לאסוף את הכדורים ואת המדיום בצינור 15 מיליליטר ולסובב במהירות נמוכה במשך שתי דקות. מוציאים את המדיום ומדגרים את התאים עם ניתוב בריאגנט למשך שבע עד עשר דקות ב-37 מעלות צלזיוס בהתאם לגודל הספירות. לבסוף, לספור את התאים באמצעות מד חמוציט או מונה תאים אוטומטי.
אנחנו משהים את התאים הבודדים במיליליטר אחד של מדיום נתרן ללא סידן. לאחר מכן לטעון את התאים עם שני ninigrams למיליליטר של צבע מחוון סידן ו 10 microliters של 5%חומצה פלורית. דגירה התאים במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
לשטוף את התאים על ידי הוספת שלושה עד חמישה מיליליטר של נתרן ללא סידן בינוני בעדינות צנטריפוגה. הסר את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים במדיום נתרן נטול סידן, ושטף בפעם השנייה. להשעות מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיום נתרן ללא סידן.
ואז למקם את התאים על קרח ולאפשר להם de-esterify במשך 30 דקות. לשטוף את התאים שוב על ידי הוספת שלושה עד חמישה מיליליטר של אשלגן בינוני צנטריפוגה כמו קודם. לאחר השעיית התאים מחדש במדיום אשלגן, יש להפוך אותם למיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות או צינורות FACS בריכוז של מיליון תאים לכל 500 מיקרוליטרים לכל צינור FACS.
מניחים את צינורות FACS על קרח עד התאים מוכנים לניתוח. אין להשאיר את התאים על הקרח לתקופה ממושכת, אלא להתחיל בחקירה בהקדם האפשרי. עבור דגימות מסוימות, טרום הדגירה התאים עם מעכב P2X7 ספציפי לקולטן כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
כמה דקות לפני הפעלת המדגם הראשון, מוסיפים סידן כלורי לריכוז סופי של מילימולר אחד וממקמים את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס כדי להתאושש. זרוק ערבוב מגנטי קטן ונקי לתוך צינור FACS ולמקם את הצינור במודול הזמן אשר מקושר אמבט מים במחזור 37 מעלות צלזיוס כדי לשלוט בטמפרטורת המדגם. בחר מהירות ערבוב נמוכה כדי להבטיח תנועה של המדגם מבלי להציג אפקט מערבולת.
מניחים את כד המים ומתאם הצינור על פלטפורמת הדגימה וסגרו את זרוע הידית של מכונת FACS. ליזום רכישה לדוגמה ולהפעיל את המדגם במשך שלוש דקות בסביבות 1,000 אירועים לשנייה. בסימן 40 השני, להסיר במהירות את הצינור ולהוסיף את אגוניסט P2X7.
או ATP מילימולר אחד או 300 BzATP מיקרומולר. ואז להחליף את הצינור כדי להמשיך את הרכישה. בעוד המדגם הראשון הוא הקלטה, להכין את המדגם השני עם סידן כלורי.
מניחים אותו 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר מספיק זמן לתאים להתחמם לפני הניתוח. לאחר סיום הדגימה הראשונה, לנקות את הצריכה על ידי הפעלת דגימת מים. לאחר מכן רכישת המדגם השני יכולה להתחיל כבעבר.
תמיד לנקות את הצריכה בין דגימות. צור השעיה של תא יחיד כבעבר ושמור כמה מיליליטר של המדיום המותנה. השתמש במדיום כדי להשעות מחדש את התאים בריכוז של מיליון תאים לכל 100 microliters לכל צינור FACS ולה מניח את התאים על קרח עד מוכן.
לפני הפעלת המבחן, מוסיפים 900 מיקרוליטרים של מדיום אשלגן לנפח סופי של מיליליטר אחד. מניחים את הצינורות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להתאושש. אם ישים, טרום הדגירה את התאים עם טיפולים כולל מעכבי P2X7 ספציפי.
מיד לפני הפעלת ההתראה, להוסיף 25 ברומיד אתידיום מיקרומולארי לצינור FACS. לאחר מכן מוסיפים את המערבב המגנטי, מניחים את הצינור על מכונת FACS ומתחילים את הרכישה כמו קודם. כדי לגרום להיווצרות של נקבוביות בממברנה התא, להוסיף ATP מילימולרי אחד או 100 BzATP מיקרומולרי 40 שניות לאחר תחילת הרכישה.
הפעל את הדגימות בסביבות 1,000 אירועים לשנייה במשך שש דקות. בזמן שהדגימה הראשונה פועלת, קחו את הדגימה השנייה מהקרח והצבו אותה באמבט המים של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר מספיק זמן לתאים להתאושש לפני הניתוח. לאחר שרכישת הדגימה הראשונה הסתיימה והצריכה נוקתה, ניתן להציב את הדגימה השנייה במחשב כדי להתחיל בהקלטה.
אנחנו משהים את התאים הבודדים במדיום מותנה ומאלצים אותם לצינורות FACS בריכוז של לפחות מיליון תאים לכל 100 מיקרוליטרים לכל צינור FACS. מדללים את התאים לריכוז סופי של מיליון תאים למיליליטר עם מדיום נתרן ומ מניחים את התאים על הקרח עד שהניתוח מבוצע. השתמש במיקרון אחד רחב G-חרוזים כמו מטרות phagocytic עבור בדיקות phagocytosis בזמן אמת.
לפני הפעלת המדגם הראשון, להעביר את התאים לאמבט מים 37 מעלות צלזיוס דגירה אותם במשך כ 7 עד 10 דקות כדי לאפשר לתאים להתאושש. הוסיפו את כל הטיפולים הדורשים הדגירה מראש לצינורות שלהם, כולל ATP, ATP מחומצן, ציטוקליסין D ו-4% פרפורמלדהיד. אין צורך בטרום דגירה עבור 5% סרום אנושי.
אם טיפולים מתווספים בערך באותו זמן, הדגימות ניתן לרוץ ברציפות בעוד אחרים ממשיכים דגירה כי זמני הדגירה שלהם משתנים. מניחים את המדגם על הציטרומטר עם המערבב המגנטי ויוזם רכישת מדגם כבעבר. הסר את צינור הדגימה מהמכונה 15 עד 20 שניות לאחר תחילת הרכישה והוסף חמישה מיקרוליטרים של קדילי YG לא מזוהים.
החזר את צינור FACS לדוגמה למכשיר והמשך הרכישה. הפעל את הדגימות במשך שבע עד שמונה דקות בסביבות 1,000 אירועים לשנייה. בזמן שהדגימה הראשונה פועלת, קחו את הדגימה השנייה מהקרח והצבו אותה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר מספיק זמן לתאים להתאושש לפני הניתוח.
לאחר המדגם הראשון סיים את הצריכה נוקה, להתחיל רכישה על המדגם השני. כאשר זוממים לאורך זמן, זרם הסידן היה בדרך כלל דומה בתאי ההיפוקמפוס והתת-חדרי של האב העצבי. אגוניסטים נוספו בסימן 42.
BzATP מפעיל במהירות קולטני P2X7, פותח את ערוץ היונים ומאפשר זרם סידן הנקשר לפלאו-8 ולפלואורסצנטיות. יישום ATP בדרך כלל תוצאות זרם סידן הדרגתי יותר. יש לו זיקה נמוכה יותר P2X7 בהשוואה BzATP וגם יגרום להפעלת קולטן מזוגג חלבון G.
בעקבות היישום של ATP של אגוניסט ו BzATP, ציטומטריה זרימה לפתור זמן לוכדת את האתידיום ברומיד נכנס לתאים דרך נקבוביות transmembrane בזמן אמת. השפעה זו הומתה על ידי מעכב P2X7 ספציפי. תרסיסי תגובת ריכוז ATP ממחישים את ההשפעות של ריכוז אגוניסט על היווצרות נקבוביות P2X7 באמצעות שינוי באתידיום ברומיד פלואורסצנטיות לאורך זמן.
כאן P2X7 קולטן מעורב phagocytosis על ידי היפוקמפוס ותאי עצבי אזור subventricular הוא הראה בזמן אמת. רמות phagocytosis ללא מעצורים של חרוזי לטקס YG הוקמו כשליטה חיובית. ATP עיכב את phagocytosis של גם YG חרוזים באותה מידה כמו מעכבים שאינם ספציפיים, כלומר קיבעון paraformaldehyde ואת מעכב פולמריזציה actin cytokelisine D.5%סרום ביטל את כל phagocytosis innate.
שמירה על אוכלוסיית תאים בריאה והפחתת זמן על הקרח חיונית להשגת תוצאות לשחזור. ניתן למזער את השונות באמצעות אותה אצווה של ATP עבור המדאת של התא כולו. התוצאה המתוזמנות שלנו של ציטומטריית זרימה שהודגמה כאן היא המסר היחיד שיכול להמשיך בכמויות נבחרות לזרימות ושינויים בתת-אוכלוסייה ממוקדת.
שיטה חלופית היא מיקרוסקופ פלואורסצנטי וקורא פלטות פלואורסצנטיות. עם זאת, שיטה זו אינה יכולה למדוד ללא הרף שינויים פלואורסצנטיים בגלל תוכנית הזיקה הפלואורסצנטית. P2X7 הוא רב מודאלי ייחודי.
גילוי הביטוי שלו על תא של עניין לפתוח סדרה של שאלות ייחודיות לחוקרים לחקור.
