Os autores gostariam de agradecer a Catherine Alford para sugestões de dissociação celular e métodos Weller Kevin, Flaherty e David Matlock Bretanha para apoio no Resource Citometria de Fluxo compartilhada no Vanderbilt University Medical Center e Melissa A. Musser de assistência artística com ilustrações. Agradecemos os drs. Jack Mosher e Sean Morrison para o conselho na implementação de isolamento de células progenitoras neuronais. O recurso de Citometria de Fluxo VMC partilhada é suportado pela Ingram Vanderbilt Câncer Center (P30 CA68485) ea Digestive Disease Vanderbilt Research Center (P30 DK058404). Este trabalho foi financiado por recursos do EUA National Institutes of Health bolsas DK064251, DK086594 e DK070219.

1. Preparação de meios de (Todos os passos feito em capuz cultura de tecidos) <ol><li> Combinar o seguinte: 44 L-15 ml de Meio, 0,5 ml 100X penicilina / estreptomicina (P / S), 0,5 ml de 100 mg / ml de Albumina de Soro Bovino (BSA), 0,5 ml de HEPES 1M, 5 ml de água de grau Tissue Culture. Certifique-se de misturar BSA e P / S bem antes de adicionar. Este volume deve ser adequada para a dissociação de até cinco tipos diferentes tecidos. Esse tipo de material será usado no Passo 3,4 para preparar soluções Quenching para uso após dissociação enzimática de tecido. </li><li> Meio Filtrante embora de 0,22 Polietersulfona filtro (PES). </li><li> Prepare a solução de 1X de Hank (HBSS) e fosfato 1X Buffered Saline (PBS) de Stocks 10X com tecido de água grau cultura. Filtrar através de filtro de 0,22 PES. Grandes volumes de estes reagentes podem ser preparados antes do tempo e armazenadas a 4 ° C, alíquotas volumes mais pequenos em um capuz de cultura de tecido, conforme necessário. </li><li> Encha múltiplos 15 ml tubos cónicos com 1x HBSS, (número de tubos para igualar o número de tecidos a programar no sub-dissecando), mantendo tubos em gelo. </li></ol> 2. Dissecação <ol><li> Euthanize cronometrado rato grávidas, em conformidade com cuidado animal institucional e protocolos de uso aprovado pela comissão e útero de transferência de 60 ou 100 mm placa de Petri contendo gelada 1X PBS. </li><li> Remover embriões do útero e eutanásia por decapitação no gelada 1X PBS. Tela individualmente sob iluminação fluorescente, dividindo-se positivos transgênicos e do tipo selvagem (WT) piscinas não transgênicas. Mantenha em embriões gelada 1X PBS durante dissecção. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, sub-dissecar do tracto urogenital. Segure o embrião no local no nível do membro anterior com pinça fina. Remover as vísceras a partir do fígado para baixo para o tubérculo genital através da inserção de uma pinça ao nível do diafragma, em seguida, rapidamente puxando os órgãos internos para baixo e para longe da parede do corpo dorsal. </li><li> Além disso sub-dissecar o tecido deinteresse para longe do tecido circundante (Figura 1). Coloque cada um individualmente sub-tipo de tecido dissecado para um tubo de 15 ml cónico contendo geladas HBSS 1X. Piscina cada tipo de tecido em conjunto de acordo com o fenótipo embrião (ou seja, todos GFP + amostras de intestino fetal são agrupados em um tubo cônico 15 ml único). </li><li> Em paralelo, dissecar tecidos comparáveis ​​de tipo selvagem embriões a serem usados ​​para os controlos de compensação em citometria de fluxo. </li></ol> 3. Dissociação de tecidos Subdissected <ol><li> Pellet sub-dissecados de tecidos por centrifugação a força relativa 210 centrífuga (RCF), 4 ° C durante 5 min. Após centrifugação, aspirar fora como HBSS tanto quanto possível. </li><li> Ressuspender o sedimento em tecido Accumax (Cell Technologies, Inc Inovadoras), certificando-se de trocar a ponteira entre cada amostra para evitar a contaminação cruzada dos tipos de tecidos. A quantidade de Accumax agregado pode ser escalado para quantidades maiores ou menores de tecido. Tipicamente para uma-5 Amostras intestino fetal, 1 ml de Accumax seria usado mas piscinas maiores do tecido exigirá um maior volume de alcançar dissociação. </li><li> Colocar os tubos em 37 ° C banho de água durante 20-45 min, dependendo fase do tecido a ser isolado (por exemplo, 13,5 intestino DPC 20 min, 15,5 intestino DPC 35 min). Na metade que o tempo dissociação, manualmente quebrar o tecido batendo o tubo contra o lado do banho de água (ou qualquer superfície sólida) e por &quot;sacudir&quot; o tubo (como seria de chacoalhar um antiquado termômetro de mercúrio). No final do tempo de dissociação repetir a agitação para baixo procedimento várias vezes para continuar a dissociar a amostra. Para amostras mais frágeis, reduzir o vigorousness do Shake Down e use pipeta de trituração durante a Etapa de 3,5 a atingir um nível adequado de dissociação. Tempos típicos de dissociação para 14,5 e 15,5 DPC DPC LUT são 35 e 45 min, respectivamente. </li><li> Enquanto o tecido é incubado no Accumax, compõem Quenching assimluções, denominado Têmpera e Têmpera 1:5. Têmpera é feita pela adição de 45 uL de 5 mg / ml de DNase I a 6 ml de L-15 Media. Têmpera 01:05 é feita por adição de 45 uL de 5 mg / ml de DNase I a 30 ml de L-15 Media. </li><li> No final da dissociação, mover tubos de 15 ml sobre gelo e imediatamente adicionar 1 Quench ml a cada tubo. Tritura-se cada amostra para cima e para baixo até que o tecido é quase completamente dissociado (Figura 2). Haverá ainda alguns pequenos pedaços de tecidos presentes na solução. Conseguir uma amostra completamente homogénea não é nem desejável nem facilmente realizável como pode resultar em viabilidade celular pobre. </li><li> Manter amostra em gelo, tanto quanto possível para o restante do protocolo. Certifique-se de usar uma ponteira fresco ao pipetar até Têmpera Têmpera ou 1:5 a evitar a contaminação cruzada das amostras. </li></ol> 4. Filtragem suspensão de células <ol><li> Utilizando uma pinça que foram embebidos em etanol a 70%, coloque a 3 centímetros quadrados de 38 mesh membrana de nylon (iM Sefar América) ao longo doboca de um novo tubo de 15 ml cónico. Filtro de células através de malha de pipetagem em centro de membrana utilizando estreitas dicas furo. Se a membrana se torna saturado enquanto filtragem, removê-lo, secar a boca do tubo, com uma Kimwipe, e usar um novo pedaço de malha de nylon para filtrar o restante da suspensão de células. Uma vez que todas as células foram filtrados, utilizar 1 ml Quench 1:05 para enxaguar o tubo e filtrar quaisquer células restantes. </li><li> Quando a filtragem é completa, ou quando a substituição de uma membrana entupido, utilize uma pinça para enrolar os lados do tecido e limpe a membrana através da parte superior do tubo para remover quaisquer gotas de suspensão de células. </li><li> Pellet suspensão de células por centrifugação a 210rcf, 4 ° C durante 5 min. Aspirar fora o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml Quench 1:5. </li><li> Suspensão de células através de filtro de malha de nylon em 5 ml tubos de poliestireno. Lavar a 15 ml de tubo com 1 ml Quench 1:5 e filtro para capturar quaisquer células restantes. </li></ol> 5. Preparação de amostras para FACS <ol&gt; <li> Se usando o mesmo tecido para classificação e para os controlos de compensação, transferir 1/10 th a 1/20 th do volume da amostra para um novo tubo de poliestireno 5 ml de usar para os controlos de compensação. Dividir a amostra de tecido do tipo selvagem em duas porções. Uma porção será unstained de tipo selvagem (WT Apenas), enquanto que a segunda metade terá 7-Aminoactinomycin D (7-AAD, um intercalador fluorescente excluídos a partir de células vivos utilizados como um &quot;viabilidade mancha&quot;) adicionado a ele (7-AAD apenas ). Esses controles individuais são necessários para permitir a compensação de qualquer sobreposição espectral entre a emissão de fluoróforos discretos no classificador de fluxo. Por exemplo, para um repórter único fluorescente como EGFP, controlos necessários iria incluir: apenas EGFP, não coradas células em peso, e um tubo coradas com 7-AAD só (Figura 3). </li><li> Preencher todos os 5 tubos ml contendo suspensão de células com 01:05 Têmpera e centrifugar a 210rcf, 4 ° C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante, deixando cerca de 200 uL de líquidoem tubo. </li><li> Diluir 7-AAD 1:1000 em 1:5 de têmpera. Adicionar 7-AAD diluição coloração para 7-AAD controle de compensação somente e amostras a serem classificadas. Não adicione 7-AAD para a EGFP apenas WT ou controles de compensação apenas. Volume de 7-AAD a ser adicionado irá variar com base na quantidade de material de partida e do tamanho do sedimento celular obtido. Uma vez 7-AAD foi adicionado a tubos adequados, as amostras estão prontas a ser classificado. <table border="1"><tbody><tr><td> Tecido </td><td> Tamanho do pool de amostra </td><td> Volume 7-AAD a ser adicionado ao * tubo </td></tr><tr><td> 15,5 Intestino dpc </td><td> 1-5 </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> 15,5 dpc LUT </td><td> 1-5 </td><td> 150 ul </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Quantidade de 7-AAD adicionado a dissocia de tecidos diferentes * A quantidade total final de cada tubo irá variar de acordo com uma quantidade variando de 50-100 uL uma vez que a aspiração dos meios de comunicação é umn processo aproximada e realizada a fim de evitar o sedimento. Volumes finais não são medidos de modo a minimizar manipulação de células em solução. </li><li> Preparar tubos de recolha para capturar as células para isolamento de RNA por adição de 0,75 ml TRIzol-LS a 1,5 tubos de microcentrífuga ml. </li><li> Se recolha de células para a cultura in vitro, em vez de isolamento de RNA, as células de classificação directamente para a auto-renovação meios de comunicação em 6 placas de cultura de tecidos, revestidas com fibronectina e preenchido com meios de comunicação, como descrito anteriormente. 2,6,7 </li></ol> 6. Citometria de Fluxo <ol><li> No citômetro de fluxo, avaliar a compensação primeiros controles, tendo a certeza de voltar lavar entre cada amostra para evitar a contaminação. Use os perfis das amostras de compensação para definir tensões / portões para a classificação. Note-se que se as células positivas no tecido desejado estão presentes em números limitantes, um tecido distinto podem ser utilizados para estabelecer as configurações de compensação, desde que a intensidade de fluorescência e tamanho das célulasentre as amostras são comparáveis. </li><li> Definir os parâmetros de compensação e portões para evitar as células mortas, que ocupam 7-AAD corante e recolher células que exibem elevada intensidade de fluorescência da GFP em relação aos controlos não coradas (Figura 4). </li><li> Classificar màxima 25.000 células em cada tubo de microcentrífuga. Triagem deve ser realizada na pressão mais baixa possível com um bocal de largura furo e baixa taxa de fluxo (por exemplo, 17psi, 100 uM bocal, 3.000 eventos por segundo) para preservar a viabilidade do progenitor neuronal. Para os tipos para isolar células EGFP + de realizamos nossos isolamentos em um BD Biosciences FACSAriaII usando um laser de 488nm 20mW para excitar o repórter EGFP. </li><li> Se as amostras contêm concentrações elevadas de células, é aconselhável para diluir a suspensão de células mais usando 1:1000 7-AAD mancha para alcançar uma maior eficiência de captura quando a classificação. </li><li> Tubo Vortex cada uma das células capturado em TRIzol-LS imediatamente após a triagem. </li></ol> 7. Os resultados representativos Tecido de dissociação para produzir um suspensões de células para triagem de fluxo é um equilíbrio delicado entre a digestão enzimática adequada e evitar o excesso de digestão, que pode resultar em viabilidade de células de baixo custo. Um exemplo de nível desejado de tecido de dissociação é mostrado na Figura 2. No tecido adequadamente digerido antes de trituração peças manuais de órgãos sub-dissecados ainda são claramente evidentes (Figura 2B, 2F). Em tecidos que são enzimaticamente tratados durante um período muito longo de tempo, ou em uma concentração demasiado elevada de enzima, a suspensão resultante não possui quaisquer peças residuais grandes de tecido (Figura 2d, 2H). Dissociação apropriado e filtragem manual produzir perfis de classificação em citometria de fluxo que exibem tipicamente superior a 90% de células viáveis ​​e apresentam níveis elevados de expressão EGFP (Figura 4). Populações de células obtidas por este método ilustrar boaviabilidade e podem ser capturados para a cultura subseqüente ou análise de expressão gênica pela passagem para a captura de EGFP + progenitores neuronais. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig1.jpg" /> Figura 1. Distribuição de TH-EGFP + neuronais progenitores em LUT rato fetal. Whole-mount trato urogenital em 15,5 dpc visto ventralmente sob iluminação de campo claro (a) em relação à distribuição de células EGFP + de rotuladas por TH-EGFP expressão do transgene identificado sob iluminação de fluorescência (b). TH EGFP-expressão está presente em glândulas supra-renais (a) e gânglios celíaco medialmente localizado (cg). Ver (c) Lateral de 15,5 Dpc TH-EGFP sub-dissecados exposições bexiga de fluorescência a partir de expressão do transgene em gânglios pélvica (pg), a parede da bexiga (bla) e da uretra (u). Em vista dorsal (d) As células EGFP + são evidentes na uretra anterior dorsal. Outros rótulos: rins (k), testículos (t), bexiga (bla) e tubérculo genital (TG). <imgalt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4188/4188fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Imagens de campo claro de 15 LUT DPC fetal (a) e do intestino (e), respectivamente, trabalhada a meio do período de incubação de dissociação, no final da incubação dissociação antes ruptura (b, f), após ruptura manual (c, g), e em uma amostra que tem sido muito dissociada (d, h). <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig3.jpg" /> Figura 3. Diagrama esquemático ilustra a compensação necessária para estabelecer controles rigorosos parâmetros FACS gating. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig4.jpg" /> Figura 4. Imagem representativas dos perfis de classificação de fluxo em 14,5 DPC (a) e 15,5 DPC (b). População negra é composta por células isoladas com base na dispersão para a frente e de lado, que são mortos e rotulados por7-AAD de fluorescência. População cinza é composta por células singlete baseado em dispersão frontal e lateral que ter excluído 7-AAD e são, portanto, viável. População gated verde é indicada por &quot;GFP +&quot; encaixotado área e é composta de células únicas que têm excluídos 7-AAD (viável) e exibem fluorescência EGFP.

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	<li>Gong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Kruger, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+persist+in+the+adult+gut+but+undergo+changes+in+self-renewal,+neuronal+subtype+potential,+and+factor+responsiveness.">Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness.</a> Neuron. 35, 657-669 (2002).</li><li>Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+differences+between+stem+cells+from+different+regions+of+the+peripheral+nervous+system+regulate+the+generation+of+neural+diversity.">Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity.</a> Neuron. 35, 643-656 (2002).</li><li>Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+impacts+developmental+potential+of+enteric+neural+crest-derived+progenitors+in+the+Sox10Dom+model+of+Hirschsprung+disease.">Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).</li><li>Skarnes, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Harding, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GUDMAP+database--an+online+resource+for+genitourinary+research.">The GUDMAP database--an online resource for genitourinary research.</a> Development. 138, 2845-2853 (2011).</li><li>Joseph, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li><li>Newgreen, D. F., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+outgrowth+cultures+and+the+analysis+of+cell+migration.">Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Linhas de rato que expressam repórter repórteres fluorescentes estão se tornando amplamente disponível através de múltiplos esforços no murino genética comunidade 1,8,9. Como resultado do método de dissociação ilustrado aqui pode ser amplamente aplicado para o isolamento de discretas subtipos neuronais com base em neurotransmissor ou padrões de expressão de receptor a partir de ambos os tecidos fetais ou adulto. Embora tenhamos optimizado este método baseado na expressão de um transgene repórt...

The authors middle initials were omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/4188">An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice</a>.

Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Vendedor </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Sigma (MFR: Cell Technologies Inovadoras) </td><td> A7089-100ML </td><td> Armazenar congelados em alíquotas de 1 ml </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D-4527 </td><td> Armazenadas congeladas a -20 ° C 5 mg / ml em 1xHBSS, (Usado em Têmpera, Têmpera 1:5) </td></tr><tr><td> PH 7,4 PBS 10X </td><td> Gibco </td><td> 70011-044 </td><td> Faça até 1x com água grau cultura de tecido, em seguida, filtro estéril </td></tr><tr><td> 10X HBSS w / o Ca ou Mg </td><td> Gibco </td><td> 14185-052 </td><td> Faça até 1x com água grau cultura de tecido, em seguida, filtro estéril </td></tr><tr><td> L-15 de Leibovitz médio </td><td> Gibco </td><td> 21083027 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina 100X </td><td> Gibco </td><td>15140-133 </td><td> Loja aliquotadas a -20 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3912-100G </td><td> Armazenar aliquotadas a -20 ° C, 100 mg / ml em água </td></tr><tr><td> BioWhittaker 1M HEPES em NaCl 0,85% </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> 38 mM Nitex membrana de náilon </td><td> Sefar América </td><td> 3-38/22 </td><td> Corte em quadrados ~ 3 cm. UV tratar durante a noite para esterilizar no capuz de cultura de tecidos. </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> Invitrogen </td><td> A1310 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> TRIzol LS </td><td> Invitrogen </td><td> 10296-028 </td><td></td></tr><tr><td> 5 tubos de poliestireno ml </td><td> Falcão </td><td> 352058 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubos cónicos </td><td> Corning </td><td> 430790 </td><td></td></tr><tr><td> Belas Pinças de dissecação </td><td> Belas instrumentos científicos </td><td> 11251-30 </td><td> Dumont # 5 forcep, Dumoxel, padrão ponta 0.1x0.06mm </td></tr><tr><td> Dissecando Colher </td><td> Belas instrumentos científicos </td><td> 10370-18 </td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice

Durante o desenvolvimento da crista neural (CN) derivados progenitores neuronais migrar do tubo neural para formar gânglios autonômicos em órgãos viscerais, como o intestino e do trato urinário inferior. Tanto durante o desenvolvimento e em tecidos maduros estas células são muitas vezes muito dispersos ao longo tecidos de modo a que o isolamento de populações discretas usando métodos como a laser de captura de micro-dissecção é difícil. Podem, contudo, ser directamente visualizadas por expressão de repórteres fluorescentes conduzidos a partir de regiões reguladoras de genes específicos de neurónios como tirosina hidroxilase (TH). Nós descrevemos um método optimizado para altos rendimentos de TH + de viável progenitoras neuronais a partir de tecidos de rato fetal viscerais, incluindo intestino e inferior do tracto urogenital (LUT), com base na dissociação e de fluorescência-activated separação de células (FACS). O gene codifica Th a enzima limitante para a produção de catecolaminas. Entéricas progenitores neuronais começam a expressar TH durção a sua migração no intestino fetal 1 e TH também está presente em um subconjunto de adultos neurónios dos gânglios pélvicos 2-4. O primeiro aparecimento dessa linhagem ea distribuição destes neurónios em outros aspectos da LUT, e seu isolamento não foi descrita. Progenitores neuronais que expressam TH pode ser prontamente visualizadas por expressão de GFP em ratinhos que transportam o transgene construto Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. Nós imaged expressão deste transgene em ratinhos fetais para documentar a distribuição de TH + células na LUT desenvolver-se a 15,5 dias pós coito (DPC), designando a manhã de detecção do conector como 0,5 DPC, e observou-se que um subconjunto de células progenitoras neuronais no coalescência pélvica gânglios expressa EGFP. Para isolar TH LUT + progenitores neuronais, otimizamos métodos que foram inicialmente utilizados para purificar células da crista neural estaminais do intestino do rato fetal 2-6. Esforços anteriores para isolar NC derivados populações invocadosdigestão com um cocktail de colagenase e tripsina para se obter suspensões de células por citometria de fluxo. Nas nossas mãos estes métodos produzido suspensões de células a partir da LUT com viabilidade relativamente baixo. Dada a incidência já baixo de progenitores neuronais nos tecidos fetais LUT, partimos para otimizar métodos de dissociação de tal forma que a sobrevivência da célula nos dissocia finais seriam aumentados. Nós determinamos que a dissociação suave em Accumax (Cell Technologies, Inc Inovadoras), manual de filtragem, classificação e fluxo a baixas pressões nos permitiram alcançar consistentemente maior sobrevivência (&gt; 70% do total de células) com rendimentos posteriores de progenitores neurais suficientes para a análise a jusante. O método descrevemos podem ser amplamente aplicado para isolar uma variedade de populações neuronais a partir de qualquer fetais ou adultos tecidos de murino.

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An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Um procedimento otimizado para purificar crista neural derivados progenitores neuronais a partir de tecidos fetais de camundongos é descrito. Este método tira partido da expressão a partir de alelos repórter fluorescente para isolar populações discretas por fluorescência-activated separação de células (FACS). A técnica pode ser aplicada para isolar subpopulações neuronais ao longo do desenvolvimento ou a partir de tecidos adultos.

Um procedimento otimizado para fluorescência-ativado Isolamento classificação celular (FACS) da Autônomo progenitores neurais a partir de vísceras de ratos fetais

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

an-optimized-procedure-for-fluorescence-activated-cell-sorting-facs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

13.7K visualizações.  Vanderbilt University School of Medicine. Um procedimento otimizado para purificar crista neural derivados progenitores neuronais a partir de tecidos fetais de camundongos é descrito. Este método tira partido da expressão a partir de alelos repórter fluorescente para isolar populações discretas por fluorescência-activated separação de células (FACS). A técnica pode ser aplicada para isolar subpopulações neuronais ao longo do desenvolvimento ou a partir de tecidos adultos.

Vídeo: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

Geração de células-tronco neurais de Discarded tecido fetal humano Cortical

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Neurociência

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout the developing vertebrate embryo. In addition to providing peripheral glia and neurons, NCC generate melanocytes as well as most of the cranio-facial skeleton. NCC migration and differentiation is controlled by a combination of their axial origin along the neural tube and their exposure to regionally distinct extracellular cues. Such contribution of extracellular ligands is especially evident during the formation of the enteric nervous system (ENS), a complex interconnected network of neural ganglia that locally controls (among other things) gut muscle movement and intestinal motility. Most of the ENS is derived from a small initial pool of NCC that undertake a long journey in order to colonize - in a rostral to caudal fashion - the entire length of the prospective gut. Among several signaling pathways known to influence enteric NCC colonization, GDNF/RET signaling is recognized as the most important. Indeed, spatiotemporally controlled secretion of the RET ligand GDNF by the gut mesenchyme is chiefly responsible for the attraction and guidance of RET-expressing enteric NCC to and within the embryonic gut. Here, we describe an ex vivo cell migration assay, making use of a transgenic mouse line possessing fluorescently labeled NCC, which allows precise quantification of enteric NCC migration potential in the presence of various growth factors, including GDNF.

We present an ex vivo cell migration assay that allows precise quantification of enteric neural crest cell migration potential in the presence of various growth factors.

Um ensaio de migração celular quantitativo para murinos progenitores neurais entéricas

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Um rato, duas culturas: isolamento e cultivo de células-tronco neurais Adulto de as duas zonas neurogênica Individual Ratos

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Usando fluorescência celular ativado Classificando a Examine-Cell-tipo específico Expressão Gênica em Tissue cérebro de um rato

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific sets of sparsely distributed activated neurons called neuronal ensembles that mediate learned associations. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) has recently been optimized for adult rat brain tissue and allowed isolation of activated neurons using antibodies against the neuronal marker NeuN and Fos protein, a marker of strongly activated neurons. Until now, Fos-expressing neurons and other cell types were isolated from fresh tissue, which entailed long processing days and allowed very limited numbers of brain samples to be assessed after lengthy and complex behavioral procedures. Here we found that yields of Fos-expressing neurons and Fos mRNA from dorsal striatum were similar between freshly dissected tissue and tissue frozen at -80 &#186;C for 3 - 21 days. In addition, we confirmed the phenotype of the NeuN-positive and NeuN-negative sorted cells by assessing gene expression of neuronal (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) and microgial (Iba1) markers, which indicates that frozen tissue can also be used for FACS isolation of glial cell types. Overall, it is possible to collect, dissect and freeze brain tissue for multiple FACS sessions. This maximizes the amount of data obtained from valuable animal subjects that have often undergone long and complex behavioral procedures.

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Here we present a Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol to study molecular alterations in Fos-expressing neuronal ensembles from both fresh and frozen brain tissue. The use of frozen tissue allows FACS isolation of many brain areas over multiple sessions to maximize the use of valuable animal subjects.

Fluorescência de células activadas (FACS) e Gene Análise da expressão de Fos-expressando neurônios de fresco e congelado cérebro de um rato Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. Additionally, epigenetic chromatin modifications, like histone methylation, have an important role for establishing and maintaining specific cell fates within this process. The vast majority of histone methylation occurs on the flexible histone tail, which is accessible to histone modifiers, erasers, and histone reader proteins. In contrast, H3K79 methylation is located in the globular domain of histone 3 and is implicated in different developmental functions. H3K79 methylation is evolutionarily conserved and can be found in a wide range of species from Homo sapiens to Saccharomyces cerevisiae. The modification occurs in different cell populations within organisms, including neural progenitors. The location of H3K79 methylation in the globular domain of histone 3 makes it difficult to assess. Here, we present methods to isolate and culture cortical progenitor cells (CPCs) from embryonic cortical brain tissue (E11.5-E14.5) or cerebellar granular neuron progenitors (CGNPs) from postnatal tissue (P5-P7), and to efficiently immunoprecipitate H3K79me2 for quantitative PCR (qPCR) and genome-wide sequencing.

We present an effective and reproducible method to isolate and culture neural progenitor cells from embryonic and postnatal brain tissue for chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - a histone mark located within the globular domain of histone 3.

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

Cultura de células primárias de neurônios Gabaérgicos ou glutamatérgicos purificados estabelecidos através da triagem de células ativadas por fluorescência

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Dissection of Pelvic Autonomic Ganglia and Associated Nerves in Male and Female Rats

The bilateral major pelvic ganglia (MPG; synonym, pelvic ganglia) are the primary source of postganglionic sympathetic and parasympathetic neurons innervating pelvic organs of rodents; the functionally equivalent structure in humans is the inferior hypogastric plexus. The major pelvic ganglia also provide the route by which lumbar and sacral sensory axons reach the pelvic organs. These complex, mixed ganglia can prove challenging to identify and dissect for further experimental study of normal autonomic mechanisms or to establish preclinical models of disease, injury or visceral pain. Here we describe a protocol to access and visualize these ganglia and their associated nerve tracts. We provide this protocol with schematics for both male and female rats, as the ganglion size and landmarks for identification differ between sexes. The protocol describes removal of the ganglion for in vitro studies, but this method can be integrated into a surgical recovery protocol for experimental interventions (e.g., nerve crush, nerve resection) or for mapping neuronal circuits (e.g., by microinjection of neural tracers). We also demonstrate the primary structures of the ganglion and its associated nerves immediately following dissection and following immunohistochemical staining.

The major pelvic ganglia contain parasympathetic and sympathetic neurons that innervate pelvic organs. Here we describe a dissection method and provide schematics for identification of these ganglia and their associated nerves. These methods can be applied to experimental manipulation of these ganglia in vivo or removal post-mortem for further study.

Dissecção de Gânglios Autônomos Pélvicos e Nervos Associados em Ratos Masculinos e Femininos

The bilateral major pelvic ganglia (MPG; synonym, pelvic ganglia) are the primary source of postganglionic sympathetic and parasympathetic neurons ...

High-Content Screening Differentiation and Maturation Analysis of Fetal and Adult Neural Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Precursor Cell Cultures

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance between in vitro simplification and recreating the complex in vivo environment, along with the main aim, shared by all screening strategies, of obtaining robust and reliable data, highly predictive for in vivo translation.
In the field of demyelinating diseases, the majority of drug screening strategies are based on immortalized cell lines or pure cultures of isolated primary oligodendrocyte precursor cells (OPCs) from newborn animals, leading to strong biases due to the lack of age-related differences and of any real pathological condition or complexity.
Here we show the setup of an in vitro system aimed at modeling the physiological differentiation/maturation of neural stem cell (NSC)-derived OPCs, easily manipulated to mimic pathological conditions typical of demyelinating diseases. Moreover, the method includes isolation from fetal and adult brains, giving a system which dynamically differentiates from OPCs to mature oligodendrocytes (OLs) in a spontaneous co-culture which also includes astrocytes. This model physiologically resembles the thyroid hormone-mediated myelination and myelin repair process, allowing the addition of pathological interferents which model disease mechanisms. We show how to mimic the two main components of demyelinating diseases (i.e., hypoxia/ischemia and inflammation), recreating their effect on developmental myelination and adult myelin repair and taking all the cell components of the system into account throughout, while focusing on differentiating OPCs.
This spontaneous mixed model, coupled with cell-based high-content screening technologies, allows the development of a robust and reliable drug screening system for therapeutic strategies aimed at combating the pathological processes involved in demyelination and at inducing remyelination.

We describe the production of mixed cultures of astrocytes and oligodendrocyte precursor cells derived from fetal or adult neural stem cells differentiating into mature oligodendrocytes, and in vitro modeling of noxious stimuli. The coupling with a cell-based high-content screening technique builds a reliable and robust drug screening system.

Análise de diferenciação e maturação de rastreamento de alto conteúdo das culturas celulares precursoras do Oligodendrocyte, derivadas de células-tronco-tronco-tronco-de-alto teor

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance ...