אנחנו אוהבים להכיר מרסלו טורו לעזרה עם cytometry הזרימה. מחקר זה נתמך על ידי השוודי לב, ריאות וגם קרן, הנציבות של האיחוד האירופי FP7 &quot;CardioCell&quot;, שוודית מועצת המחקר, AFA ביטוחים ו ALF. OB נתמך על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft.

1. הבידוד של גרעינים לב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge המעיל צינורות (צינורות Beckman צנטריפוגות # 363664) עם 10 מ&quot;ל של תמיסת BSA / PBS 1% ציפוי. מכסה צינורות ולתת להם להסתובב למשך 30 דקות ב Rotator צינור. הסר את פתרון הציפוי ולתת צנטריפוגות צינורות אוויר יבש (1 צינור לכל הלב העכבר נדרש ניתוח לב עכבר אחת, לסירוגין עד 5 לבבות עכבר או 1 גרם של רקמת לב ממספר זנים שונים (למשל אדם) יכול להיות מעובד בצינור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל השלבים הבאים יש לבצע על הקרח. לנתח את החדר השמאלי של הלב העכבר טרי או קפוא הצמד עם אזמל. שים לב, פרוטוקול זה הוא מותאם במיוחד הלב העכבר אבל יכול גם להיות מותאם חולדה או לב אנושי. לחלופין, השתמש עד 1 גרם של רקמת לב מכמה מינים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את הדגימה לתוך תאים קטנים עם אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את חתיכות רקמה לתוך צינור פלקון 50 מ&quot;ל 15 מ&quot;ל מלא של המאגר תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenizeרקמת לב עם T-25-Ultra Turrax בדיקה homogenizer (איקא) בסל&quot;ד 24,000 עבור 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את homogenate עם נפח שווה של חיץ תמוגה ל 30 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש כוס douncer (40 מ&quot;ל) כדי להמשיך homogenize רקמות גרעינים חינם. לבצע שמונה משיכות עם העלי אישור גדולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הגרעינים גולמי לבודד באמצעות 100 מיקרומטר ו 70 מיקרומטר רשת ניילון התא מסננת (BD Biosciences), ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את הגרעינים גולמי לבודד בצנטריפוגה קירור (4 ° C) בשעה XG 700 דקות 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant בקפידה על ידי צינורות היפוך ולנגב את פנים הצינור עם מגבת נייר. להיזהר לא להפריע גרעינים גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את הגרעינים גולמי לבודד ב 5 מ&quot;ל של חיץ סוכרוז על ידי pipetting הפתרון מספר פעמים למעלה ולמטה. הוסף עוד 25 מ&quot;ל של חיץ סוכרוז כדי גלולה המומס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של חיץ סוכרוז מוכן טרי לצינור ultracentrifuge מצופה (ראה שלב 1.1). &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות כיסוי מ&quot;ל מוסף 10 של המאגר סוכרוז עם גרעינים גלולה resuspended מומס חיץ סוכרוז משלב 1.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתרה צינורות צנטריפוגות לפני הצבתם לתוך הרוטור JS13.1 מתנדנד חופשי למקם את הרוטור לתוך הצנטריפוגות במהירות גבוהה (Beckman אוואנטי-S 25). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין גרעיני מדגם XG ב 13,000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ספין השלימה, להסיר את צינורות בקפידה מתוך הרוטור וזורקים supernatant ידי צינורות היפוך ומוחה את הפסולת שנותרה מבפנים של צינורות עם מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את הגרעינים גלולה ב 1ml של למאגר אחסון גרעינים (NSB בתוספת חיץ). הערה: NSB פלוס מכיל 1.5 מ&quot;מ spermine כמייצב DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עם צעד 2.1, immunostaining של גרעיני cardiomyocyte. </li></ol> 2. Immunostaining עבור cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את השליטה שלילי immunostaining. קח את aliquot של 20 μl של המדגם גרעינים וdd 980 μl של NSB בתוספת חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חומר אנטי pericentriolar 1 נוגדנים (הארנב נגד PCM-1, נוגדנים אטלס) מדגם גרעינים בדילול של 1:500 כדי גרעינים immunolabel cardiomyocyte. מוסיפים את הנוגדן isotype בדילול כמו נוגדנים נגד PCM-1 לשליטה שלילי, מוכן בשלב 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שליטה שלילי צינור דגימה ב 4 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השליטה מדגם שלילי לפחות פעם אחת עם NSB בתוספת חיץ (לסובב את הצינורות בצנטריפוגה קירור (4 ° C) בשעה XG 700 דקות 10. מחק supernatant ו לפזר את הגרעינים גלולה ב 1 מ&quot;ל של NSB בתוספת חיץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נגד ארנב נוגדנים משני ניאון (FITC או APC) לשליטה שלילי צינור דגימה בדילול של 1:1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שליטה שלילי צינור דגימה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השליטה מדגם שלילי לפחות פעם אחת עם NSB בתוספת חיץ (לסובב את הצינורות בצנטריפוגה קירור (4 ° C) בשעה XG 700 דקות 10. מחק supernatant ו לפזר את הגרעינים גלולה ב 1 מ&quot;ל של NSB בתוספת חיץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך ניתוח זרימת מיון cytometric ו. </li></ol> 3. תזרים Cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרעינים המעיל איסוף צינורות פלקון (15 מ&quot;ל) עם פתרון BSA / PBS 1% לפני תחילת זרימת cytometry מיון כמתואר בשלב 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן מדגם הביקורת השלילית דרך מסננת 30 מיקרומטר תא המטען הראשון הביקורת השלילית cytometer את זרימת (זרם BD). הגדר את השער הראשון והשני להגדיר גרעינים ו singlets (גרעינים אחת), המבוססת על פיזור קדימה (FSC), פיזור קדימה רוחב הפולס (רוחב הדופק FS) ולפזר בצד (SSC) (איור 2 א &#39;וב&#39;). הוספת ה-DNA כתם (DRAQ5 (1:500)) המדגם יכול לעזור לזהות את האוכלוסייה גרעינים בתחילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מדגם immunolabeled ולהגדיר את השער 3 לבודד גרעינים cardiomyocyte (PCM-1-positve) מן הגרעינים הלא cardiomyocyte (PCM-1-שלילי). להתחיל את המיון(איור 2 ג ו - ד). </li></ol> אופציונלי: כדי לנתח את תוכן ה-DNA הגרעיני (ploidy) ולבצע ניתוח מחזור התא להוסיף DNA המתאים כתם על גרעינים (למשל Hoechst 33342 או DRAQ5) (איור 2 ה). <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מיון cytometry זרימה, הצב את הגרעינים על הקרח מחדש לנתח כדי לקבוע את טוהר מיון (איור 3 א &#39;וב&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את הגרעינים למיין את צינורות לאיסוף XG 1500 בצנטריפוגה בקירור במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את הגרעינים גלולה במאגר תואם יישום במורד הזרם. </li></ol> 4. נציג תוצאות מורפולוגיה גרעינים ויושרה ניתן להעריך על ידי כתמי דנ&quot;א דמיינו ידי מיקרוסקופ (איור 1). מוצלח PCM-1 תיוג ניתן להעריך על ידי מיקרוסקופ epifluorescence ועל ידי cytometry זרימה (איור 1, איור. 2C ו-D). PCM-1-positiיש ואוכלוסיות שליליות צריכים להיות מופרדים היטב זה מזה (איור 2 ג ו - ד). ב החדר השמאלי Murine על 30% גרעינים כל צריך להיות cardiomyocyte גרעינים (איור 2). מיון טוהר אפשר להעריך מחדש על ידי ניתוח מיון גרעינים (איור 3 א &#39;וב&#39;). שתי אוכלוסיות גרעינים צריך טוהר מיון עולה על 95%. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig1.jpg" /> באיור 1. PCM-1 מזהה גרעינים cardiomyocyte. גרעינים לב (א) מגואלות נוגדנים ל PCM-1 (ב) ו Nkx2.5 (ג) בלב עכבר בוגר. (ד) PCM-1-שכותרתו גרעינים מוקפים בציטופלסמה cardiomyocyte (שרשרת כבדה שרירן (MHC)) ולהביע גורם שעתוק Nkx2.5, המתעד את זיהוי מדויק של גרעיני cardiomyocyte ידי מכתים-1 PCM (ברים בקנה מידה 20 ו -10 מיקרומטר מיקרומטר (ד, הבלעה)). (ה) מבודד גרעינים הלב דמיינו עם ה-DNA כתם DRAQ5. (F ו-G) Cardiomyocגרעינים yte מסומנים עם נוגדנים כנגד PCM-1 (מיקרומטר בהיקף 10 בר). שים לב, דפוס מכתים epinuclear של PCM-1 בגרעין myocyte בסעיף רקמות בגרעין מבודד (חיצים). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig2.jpg" /> איור 2. תזרים מיון cytometric של גרעיני cardiomyocyte. (א) גרעיני לב מזוהים פיזור קדימה (FSC) וצד פיזור (SSC). (ב) שער 2 מזהה גרעינים אחד על ידי FSC ו FS רוחב פולס 5. (ג, ד) gating פלורסנט מאפשר הפרדת הגרעינים cardiomyocyte (PCM-1-חיובי) ולא cardiomyocyte (PCM-1-שלילי) גרעינים של רקמת לב. (ה) עכבר cardiomyocyte הם ברובם (&gt; 80%) דיפלואידי (2n), רק קבוצה קטנה הוא tetraploid (4n) 6. שים לב, cardiomyocytes אדם להכיל תדירות גבוהה יותר של גרעינים polyploidy (&gt; 2n) 7,8. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig3.jpg" /> <strong&gt; באיור 3. טוהר ניתוח של גרעיני cardiomyocyte ולא cardiomyocyte מיון. ניתוח מחדש של גרעינים שאינם cardiomyocyte (א) ו cardiomyocyte מיון (ב). שתי האוכלוסיות להראות טוהר מיון עולה על 99%.

<ol>
	<li>Ang, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart.">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).</li><li>Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cardiomyocyte+nuclei+and+assessment+of+ploidy+for+the+analysis+of+cell+turnover.">Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover.</a> Experimental cell research. 327, 188-194 (2011).</li><li>Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+Cardiomyocyte+Renewal+in+Humans.">Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans.</a> Science. 324, 98-102 (1126).</li><li>Walsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+cell+cycle+control+and+growth+estimation.">Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation.</a> Cardiovascular Research. , 1-31 (2010).</li><li>Spalding, K., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B., Druid, H., Frisén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li><li>Adler, C. P., Friedburg, H., Herget, G. W., Neuburger, M., Schwalb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+of+cardiomyocyte+DNA+content,+ploidy+level+and+nuclear+number+in+mammalian+hearts.">Variability of cardiomyocyte DNA content, ploidy level and nuclear number in mammalian hearts.</a> Virchows Arch. 429, 159-164 (1996).</li><li>Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content,+ploidy+level+and+number+of+nuclei+in+the+human+heart+after+myocardial+infarction.">DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 36, 45-51 (1997).</li><li>Adler, C. P., Friedburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+DNA+content.+ploidy+level+and+cell+number+in+geriatric+hearts:+postmortem+examinations+of+human+myocardium+in+old+age.">Myocardial DNA content. ploidy level and cell number in geriatric hearts: postmortem examinations of human myocardium in old age.</a> Mol. Cell Cardiol. 18, 3953-39 (1986).</li><li>Dubois, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIRPA+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 29, 1011-1018 (2011).</li><li>Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 7, 61-66 (2010).</li><li>Fransioli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+c-kit-Positive+Cell+Response+to+Pathological+Challenge+in+the+Myocardium.">Evolution of the c-kit-Positive Cell Response to Pathological Challenge in the Myocardium.</a> Stem Cells. 26, 1315-1324 (2008).</li><li>Elliott, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKX2-5(eGFP/w)+hESCs+for+isolation+of+human+cardiac+progenitors+and+cardiomyocytes.">NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 8, 1037-1040 (2011).</li><li>Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+Cardiomyocyte+Repopulation+by+Extracardiac+Progenitors+in+Transplanted+Human+Hearts.">Evidence for Cardiomyocyte Repopulation by Extracardiac Progenitors in Transplanted Human Hearts.</a> Circulation Research. 90, 634-640 (2002).</li><li>Srsen, V., Fant, X., Heald, R., Rabouille, C., Merdes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+proteins+form+an+insoluble+perinuclear+matrix+during+muscle+cell+differentiation.">Centrosome proteins form an insoluble perinuclear matrix during muscle cell differentiation.</a> BMC cell biology. 10, 28 (2009).</li><li>Spoelgen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flow+cytometry-based+technique+to+measure+adult+neurogenesis+in+the+brain.">A novel flow cytometry-based technique to measure adult neurogenesis in the brain.</a> Journal of neurochemistry. 119, 165-175 (2011).</li><li>Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+DNA+synthesis+and+binucleation+during+murine+development.">Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development.</a> The American journal of physiology. 271, H2183-H2189 (1996).</li><li>Olivetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+cardiac+hypertrophy+and+ischemic+cardiomyopathy+do+not+affect+the+proportion+of+mononucleated+and+multinucleated+myocytes+in+the+human+heart.">Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 28, 1463-1477 (1996).</li><li>Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+sorting+of+neuronal+and+glial+nuclei+from+central+nervous+system+tissue.">Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue.</a> Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Nuclei+Isolation+from+Human+Postmortem+Brain+Tissue.">Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (20), e914 (2008).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

זיהוי מדויק של גרעיני cardiomyocyte הוא קריטי לניתוח תהליכי ההתחדשות של שריר הלב 2,3. טכניקות קונבנציונאלי לבודד מרקמות cardiomyocytes טרי מבוססים בעיקר על עיכול אנזימטי של חלבונים תאי מטריקס וטיהור הבאים מתאי ביניים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה. טיהור נוסף של cardiomyocytes חיי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1. מאגר תמוגה </td></tr><tr><td> שם מגיב </td></tr><tr><td> 0.32 מ &#39;סוכרוז </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;מ CaCl 2 </td></tr><tr><td> 5 mM מגנזיום אצטט </td></tr><tr><td> 2.0 mM EDTA </td></tr><tr><td> 0.5 מ&quot;מ EGTA </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 2. סוכרוז חיץ </td></tr><tr><td> שם מגיב </td></tr><tr><td> 2.1 מ &#39;סוכרוז </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM מגנזיום אצטט </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 3. אחסון גרעינים חיץ (NSB פלוס) </td></tr><tR&gt; <td> שם מגיב </td></tr><tr><td> 0.44 מ &#39;סוכרוז </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) </td></tr><tr><td> 70 mM KCl </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 1.5 מ&quot;מ spermine </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חומרים כימיים וציוד </td><td> חברה </td></tr><tr><td> Isotype ארנב IgG-Chip כיתה, # ab37415 </td><td> Abcam </td></tr><tr><td> הארנב נגד PCM-1 נוגדנים, # HPA023374 </td><td> אטלס נוגדנים </td></tr><tr><td> החמור שניות. , נוגדנים נגד ארנב Alexa 488 פלואוריד, # 21206, או שווה ערך שניות. ניאון נוגדן </td><td> החיים טכנולוגיות </td></tr><tr><td> DRAQ5 </td><td> Biostatus </td></tr><tr><td> תא מסננות 30 מיקרומטר, 70 מיקרומטר ו 100 מיקרומטר </td><td> BD Biosciences </td></tr><tr><td> זכוכית douncer (40 מ&quot;ל) ובוכנה &quot;L&quot; </td><td> VWR (ויטון תעשיות בע&quot;מ) </td></tr><tr><td> T-25-Ultra Turrax Homogenizer </td><td> איקא גרמניה </td></tr><tr><td> פיזור S25 N-18 כלי G </td><td> איקא גרמניה </td></tr><tr><td> Beckman צנטריפוגה אוואנטי </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> פלקון צינורות 15 מ&quot;ל ו -50 מ&quot;ל </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman צינורות צנטריפוגות # 363664 </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> JS13.1 הרוטור מתנדנד חינם </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> גל cytometer </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> צינור Rotator </td><td> VWR </td></tr></tbody></table>

isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue

זיהוי של גרעיני cardiomyocyte כבר מאתגר בסעיפים רקמות כמו רוב אסטרטגיות לסמוך רק על חלבונים סמן cytoplasmic 1. אירועים נדירים מיוציטים לב כגון התפשטות אפופטוזיס מחייבים זיהוי מדויק של גרעיני myocyte לב לנתח חידוש הסלולר הומאוסטזיס ובתנאים פתולוגיות 2. כאן, אנו מספקים שיטה לבודד את הגרעינים cardiomyocyte מרקמות מורטם הודעה על ידי שקיעה צפיפות immunolabeling עם נוגדנים נגד החומר pericentriolar 1 (PCM-1) ומיון לאחר cytometry הזרימה. אסטרטגיה זו מאפשרת ניתוח התפוקה בידוד גבוה עם יתרון של עובד באותה מידה על רקמות טרי חומר ארכיוני קפוא. זה מאפשר ללמוד החומר שנאסף כבר biobanks. טכניקה זו ישימה ונבדקו מגוון רחב של מינים מתאימים ליישומים רבים במורד הזרם כמו פחמן 14 תיארוך 3, תאים סיCLE ניתוח 4, ויזואליזציה של אנלוגים תימידין (למשל BrdU ו IdU) 4, ניתוח transcriptome ו epigenetic.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue at JoVE.com

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

גרעינים לב מבודדים באמצעות שקיעה צפיפות immunolabeled עם נוגדנים נגד החומר pericentriolar 1 (PCM-1) כדי לזהות ולמיין גרעינים cardiomyocyte ידי cytometry הזרימה.

הבידוד של גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

isolation-of-cardiomyocyte-nuclei-from-post-mortem-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

16.9K Views.  University of Lund. גרעינים לב מבודדים באמצעות שקיעה צפיפות immunolabeled עם נוגדנים נגד החומר pericentriolar 1 (PCM-1) כדי לזהות ולמיין גרעינים cardiomyocyte ידי cytometry הזרימה.

Video: Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 diabetic islets from organ donors2. Here we share our protocol for isolating islets from human pancreatic tissue obtained from type 2 diabetic and non-diabetic patients who have undergone partial pancreatectomy due to different pancreatic diseases (benign or malignant pancreatic tumors, chronic pancreatitis, and common bile duct or duodenal tumors). All patients involved gave their consent to this study, which had also been approved by the local ethics committee. The surgical specimens were immediately delivered to the pathologist who selected soft and healthy appearing pancreatic tissue for islet isolation, retaining the damaged tissue for diagnostic purposes. We found that to isolate more than 1,000 islets, we had to begin with at least 2 g of pancreatic tissue. Also essential to our protocol was to visibly distend the tissue when injecting the enzyme-containing media and subsequently mince it to aid digestion by increasing the surface area.
To extend the applicability of our protocol to include the occasional case in which a large amount (&gt;15g) of human pancreatic tissue is available , we used a Ricordi chamber (50 ml) to digest the tissue. During digestion, we manually shook the Ricordi chamber3 at an intensity that varied by specimen according to its level of tissue fibrosis. A discontinous Ficoll gradient was then used to separate the islets from acinar tissue. We noted that the tissue pellet should be small enough to be homogenously resuspended in Ficoll medium with a density of 1.125 g/ml. After isolation, we cultured the islets under stress free conditions (no shaking or rotation) with 5% CO2 at 37 &deg;C for at least 48 h in order to facilitate their functional recovery. Widespread application of our protocol and its future improvement could enable the timely harvesting of large quantities of human islets from diabetic and clinically matched non-diabetic subjects, greatly advancing type 2 diabetes research.

The supply of type 2 diabetic islets for research is insufficient. Here we share our protocol for isolating islets from patients undergoing partial pancreatectomy. This approach represents a unique venue for obtaining islets from type 2 diabetic and clinically matched non-diabetic subjects in adequate numbers for basic and clinical studies.

הבידוד של איי האדם מן המטופלים Pancreatectomized חלקית

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

בידוד של תאי גזע סרטני מדגימות אדם סרטן הערמונית

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents responsible for the action potential can cause pro-arrhythmic substrates that underlie arrhythmias, such as atrial fibrillation, which are highly prevalent in many conditions and disease states. Isolating adult mouse atrial cardiomyocytes for use in patch-clamp experiments has greatly advanced our knowledge and understanding of the cellular electrophysiology in the healthy atrial myocardium and in the setting of atrial pathophysiology. In addition, studies using genetic mouse models have elucidated the role of a vast array of proteins in regulating atrial electrophysiology. Here we provide a detailed protocol for the isolation of cardiomyocytes from the atrial appendages of adult mice using a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation of these tissues. This approach consistently and reliably yields isolated atrial cardiomyocytes that can then be used to characterize cellular electrophysiology by measuring action potentials and ionic currents in patch-clamp experiments under a number of experimental conditions.

This protocol is used to isolate single atrial cardiomyocytes from the adult mouse heart using a chunk digestion approach. This approach is used to isolate right or left atrial myocytes that can be used to characterize atrial myocyte electrophysiology in patch-clamp studies.

בידוד של פרפור מיוציטים מעכברים למבוגרים

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including the heart. While Channelrhodopsin-2 (ChR2) is a common tool to depolarize the membrane potential in cardiomyocytes (CM), potentially eliciting action potentials (AP), an effective tool for reliable silencing of CM activity has been missing. It has been suggested to use anion channelrhodopsins (ACR) for optogenetic inhibition. Here, we describe a protocol to assess the effects of activating the natural ACR GtACR1 from Guillardia theta in cultured rabbit CM. Primary readouts are electrophysiological patch-clamp recordings and optical tracking of CM contractions, both performed while applying different patterns of light stimulation. The protocol includes CM isolation from rabbit heart, seeding and culturing of the cells for up to 4 days, transduction via adenovirus coding for the light-gated chloride channel, preparation of patch-clamp and carbon fiber setups, data collection and analysis. Using the patch-clamp technique in whole-cell configuration allows one to record light-activated currents (in voltage-clamp mode, V-clamp) and AP (current-clamp mode, I-clamp) in real time. In addition to patch-clamp experiments, we conduct contractility measurements for functional assessment of CM activity without disturbing the intracellular milieu. To do so, cells are mechanically preloaded using carbon fibers and contractions are recorded by tracking changes in sarcomere length and carbon fiber distance. Data analysis includes assessment of AP duration from I-clamp recordings, peak currents from V-clamp recordings and force calculation from carbon fiber measurements. The described protocol can be applied to the testing of biophysical effects of different optogenetic actuators on CM activity, a prerequisite for the development of a mechanistic understanding of optogenetic experiments in cardiac tissue and whole hearts.

We present a protocol for evaluating the electromechanical effects of GtACR1 activation in rabbit cardiomyocytes. We provide detailed information on cell isolation, culturing and adenoviral transduction, and on functional experiments with the patch-clamp and carbon-fiber techniques.

הערכה אלקטרו-מגנטית של אלקטרואופטיקה פעילות מודולציט

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including ...

Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with small-animal models such as rodents. However, the physiology of the human heart differs significantly from that of the rodent heart, underscoring the need for clinically relevant models to study heart disease. Here, we present a protocol to model ischemic heart disease using cardiomyocytes differentiated from human induced pluripotent stem cells (hiPS-CMs) and to quantify the damage and functional impairment of the ischemic cardiomyocytes. Exposure to 2% oxygen without glucose and serum increases the percentage of injured cells, which is indicated by staining of the nucleus with propidium iodide, and decreases cellular viability. These conditions also decrease the contractility of hiPS-CMs as confirmed by displacement vector field analysis of microscopic video images. This protocol may furthermore provide a convenient method for personalized drug screening by facilitating the use of hiPS cells from individual patients. Therefore, this model of ischemic heart disease, based on iPS-CMs of human origin, can provide a useful platform for drug screening and further research on ischemic heart disease.

We present a model of ischemic heart disease using cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells, together with a method for quantitative evaluation of tissue damage caused by ischemia. This model can provide a useful platform for drug screening and further research on ischemic heart disease.

מודל של מחלות לב איסכמיות והשוואה מבוססת וידאו של התכווצות קרדיומיוציטים באמצעות קרדיומיוציטים נגזר hiPSC

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release different bioactive molecules that control metabolic, hormonal, and immune processes; currently, it is unclear how these processes are regulated within the adipose tissue. Therefore, the development of methods evaluating the contribution of each cell population to the pathophysiology of adipose tissue is crucial. This protocol describes the isolation steps and provides the necessary troubleshooting guidelines for efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF from human VAT biopsies in a single process, using a collagenase enzymatic digestion technique. Moreover, the protocol is also optimized to identify macrophage subsets and perform mature adipocyte RNA isolation for gene expression studies, which allows performing studies dissecting the interaction between these cell populations. Briefly, VAT biopsies are washed, minced mechanically, and digested to generate a single-cell suspension. After centrifugation, mature adipocytes are isolated by flotation from the SVF pellet. The RNA extraction protocol ensures a high yield of total RNA (including miRNAs) from adipocytes for downstream expression assays. Simultaneously, SVF cells are used to characterize macrophage subsets (pro- and anti-inflammatory phenotype) through flow cytometry analysis.

This protocol provides an efficient collagenase digestion method for isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction-SVF cells from human visceral fat in a single process, including methodology to obtain high-quality RNA from adipocytes and phenotypification of SVF-macrophages through staining of multiple membrane-bound markers for analysis by flow cytometry.

בידוד אדיפוציטים בני קיימא ומקטע כלי דם סטרומלי מרקמת השומן הקרבית האנושית המתאימה לניתוח RNA ופנוטיפ מקרופאגים

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are a promising cell source for cardiac repair after ischemic damage. However, a low grafted rate is a significant obstacle for effective cardiac tissue regeneration after transplantation. This protocol shows that multiple hiPSC-CM ultrasound-guided percutaneous injections into an MI area effectively increase cell transplantation rates. The study also describes the entire hiPSC-CM culture process, pretreatment, and ultrasound-guided percutaneous delivery methods. In addition, the use of human mitochondrial DNA help detect the absence of hiPSC-CMs in other mouse organs. Lastly, this paper describes the changes in cardiac function, angiogenesis, cell size, and apoptosis at the infarcted border zone in mice 4 weeks after cell delivery. It can be concluded that echocardiography-guided percutaneous injection of the left ventricular myocardium is a feasible, relatively invasive, satisfactory, repeatable, and effective cellular therapy.

Ultrasound-guided cell delivery around the site of myocardial infarction in mice is a safe, effective, and convenient way of cell transplantation.

השתלת קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אולטרסאונד בעכברים עם אוטם שריר הלב

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more than half of the total cardiac cell population, and they contribute to adaptive compensations upon myocardial injury, including inflammatory responses, tissue repair, and scar formation. To study the post-MI cardiac microenvironment, single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) is widely used to identify different cardiac cell types and intercellular communications. Among the procedures of scRNA-seq sample preparation, preparing the cell suspension is one of the most critical steps, because the cell viability can affect the quality of the scRNA-seq results. Therefore, we designed an experimental protocol for preparing a non-cardiomyocyte cell suspension from post-MI mouse hearts with an extra focus on improving the cell viability by choosing mild digestive enzymes, controlling the digestion time, and applying fluorescence-activated cell sorting (FACS). Finally, we isolated CD45+ cells from the non-cardiomyocyte cell suspension obtained through this protocol, and then we performed scRNA-seq.

Here, we describe a protocol to isolate a sufficient amount of single non-cardiomyocytes with high viability from a post-myocardial infarction (MI) mouse heart. This can be used for subsequent single-cell sequencing, flow cytometry analysis, and primary cell culture.

הכנת תרחיף תאים שאינו קרדיומיוציטים לריצוף RNA חד-תאי מלב עכבר בוגר לאחר אוטם שריר הלב

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more ...

Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission due to the introduction of animal-derived products during in vitro manipulation. The xenogeneic components, such as collagenase or fetal bovine serum, commonly used during the cell isolation and expansion steps could be associated with the potential risks of immune reactivity or viral, bacterial, and prion infection in the receiving patients. Following good manufacturing practice guidelines, chemical tissue dissociation should be avoided, while fetal bovine serum (FBS) can be substituted with xenogeneic-free supplements. Moreover, to ensure the safety of cell products, the definition of more reliable and reproducible methods is important. We have developed an innovative, completely xenogeneic-free method for the isolation and in vitro expansion of human adipose-derived stem cells without altering their properties compared to collagenase FBS-cultured standard protocols. Here, human adipose-derived stem cells (hASCs) were isolated from abdominal adipose tissue. The sample was mechanically minced with scissors/a scalpel, micro-dissected and mechanically dispersed in a 10 cm Petri dish, and prepared with scalpel incisions to facilitate the attachment of the tissue fragments and the migration of hASCs. Following the washing steps, hASCs were selected due to their plastic adherence without enzymatic digestion. The isolated hASCs were cultured with medium supplemented with 5% heparin-free human platelet lysate and detached with an animal-free trypsin substitute. Following good manufacturing practice (GMP) directions on the production of cell products intended for human therapy, no antibiotics were used in any culture media.

Xenogeneic (chemical or animal-derived) products introduced in the cell therapy preparation/manipulation steps are associated with an increased risk of immune reactivity and pathogenic transmission in host patients. Here, a complete xenogeneic-free method for the isolation and in vitro expansion of human adipose-derived stem cells is described.

בידוד ותרבית של תאי גזע שמקורם בשומן אנושי בשיטה חדשנית נטולת קסנוגניות לטיפול בבני אדם

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of primary fibroblasts derived from keloid tissue are the basis for further studies of the biological function and molecular mechanisms of keloids, as well as new therapeutic strategies for treating them. The traditional method of obtaining primary fibroblasts has limitations, such as poor cellular state, mixing with other types of cells, and susceptibility to contamination. This paper describes an optimized and easily reproducible protocol that could reduce the occurrence of possible issues when obtaining fibroblasts. In this protocol, fibroblasts can be observed 5 days after isolation and reach nearly 80% confluency after 10 days of culture. Then, the fibroblasts are passaged and verified using PDGFR&#945; and vimentin antibodies for immunofluorescence assays and CD90 antibodies for flow cytometry. In conclusion, fibroblasts from keloid tissue can be easily acquired through this protocol, which can provide an abundant and stable source of cells in the laboratory for keloid research.

This study describes an optimized protocol for establishing primary fibroblasts from keloid tissues that can effectively and steadily provide pure and viable fibroblasts.

בידוד, תרבית ואפיון פיברובלסטים עוריים ראשוניים מרקמת קלואיד אנושית

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...