הפרוטוקול שלנו מבטיח הן את כדאיות התא והן את יעילות הבידוד של תרחיף תא בודד בעלויות נמוכות יחסית. עלויות נמוכות יחסית ודרישות עבור ציוד מעבדה הם היתרונות העיקריים של טכניקה זו. ריצוף תא בודד חושף את ההטרוגניות של לא קרדיומיוציטים בפתופיזיולוגיה של הלב, וגם מספק רעיונות למחקרים בסיסיים וקליניים למחלות לב.
פרוטוקול זה יכול לשמש במחקר זה על הסביבה הקרדיווסקולרית שלאחר MI, כגון מעורבות של תאים חיסוניים. עבור הכנות ראשונות, אני מציע להקדיש תשומת לב מיוחדת לפפסין הדגימה ולזמן העיכול. לאחר הכנת החוצצים והתמיסות כמתואר בכתב היד, הניחו על שולחן הניתוחים עכבר שעבר המתת חסד שעבר אוטם שריר הלב שבועיים קודם לכן במצב שכיבה.
תקן את הגפיים האחוריות שלו באמצעות סרט הדבקה. כדי להסיר את הלב, לרסס את הגוף עם 70% אתנול. בצע חתך אנכי דרך עור הבטן והשרירים תוך הימנעות מהכבד.
מבלי לנקב את הלב, פתחו בזהירות את בית החזה ופזרו את החדר השמאלי בתמיסת PBS קרירה מראש עד שנוזל הזילוח חסר צבע. באמצעות מלקחיים, להרים בעדינות את הלב לחתוך את הרקמות העודפות המחוברות החיצוני שלה עם מספריים אופתלמיים. הניחו את הלב במיליליטר אחד של PBS מקורר מראש בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.
מעבירים את הלב לבאר של צלחת 24 באר המונחת על קרח. פיפט 150 מיקרוליטר של חיץ דיסוציאציה לבבית לתוך הבאר, וחתך את הלב לחתיכות בגודל מילימטר אחד באמצעות מספריים. מעבירים את רקמת הלב הטחונה לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של מאגר הדיסוציאציה של הרקמה.
מניחים את הצינור בשייקר הדדי תרמוסטטי. מקפיצים את המתלים למעלה ולמטה 10 פעמים כל 20 דקות. כדי להסיר גושים ורקמות לא מעוכלות, סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר באמצעות 25 מיליליטר של חיץ שטיפת תאים.
שטפו את צינור הצנטריפוגה ואת מסננת התא. לאחר מכן, סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי להסיר גושי תאים נוספים. צנטריפוגה את תרחיף התא המסונן ב 300 x גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
יש להשהות מחדש את דגימת התא בחמישה כרכים של חיץ ליזה RBC ולדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. כעת, הוסף ארבעה נפחים של חיץ שטיפת התאים במתלה התא ובצנטריפוגה כפי שהודגם בעבר. לאחר השלכת הסופרנטנט, השהה מחדש את התאים ב -10 מיליליטר של חיץ שטיפת התא והצנטריפוגה שוב.
בסוף הצנטריפוגה, להשליך את supernatant ולתלות מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של חיץ שטיפת תאים. קח 18 מיקרוליטר של המתלה בצינור צנטריפוגה אחר והוסף שני מיקרוליטרים של תמיסת צביעת יודיד תפוז אקרידין. הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסה מוכתמת זו לשקופית תא ספירה.
הערך את מספרי התאים ואת הכדאיות באמצעות מונה תאים אוטומטי. שברי תאים נצפו בהשעיית הלב של התא הבודד. מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות הפחית ביעילות את חלקם היחסי של מקטעי התא ואת התגבשות התא וכתוצאה מכך הקטנת גודל התא הממוצע.
ריצוף RNA הוכיח הפרדה ברורה של שבעה סוגים של תאים חיסוניים, כפי שהודגם על ידי אשכולות ללא פיקוח והטבעה מופחתת של שכנים סטוכסטיים מבוזרים T. כל תא חיסון הראה ביטוי גבוה של סמנים קלאסיים. רקמת הלב צריכה להיות חתוכה קטנה מספיק כדי למנוע עיכול חלקי, מה שמוביל הרבה גושים תאים השעיית התא.
תרחיף התא הבודד המתקבל על ידי פרוטוקול זה יכול להיות מיושם עוד יותר בניתוח זרימה של תרבית תאים ראשונית. פרוטוקול זה מועיל למחקרים על מיקרו-סביבה של זיהום שריר הלב, אשר עשוי לסייע לחוקרים להסתכל מעבר לרקמות הלב ולשקול זיהום שריר הלב כבעיה שיטתית.
