הפרוטוקול שלנו מאפשר יצירת אנזימי הגבלה עם ספציפיות רצף שונה ומוחר יותר באמצעות מידור במבחנה ואסטרטגיית בחירה ייחודית באבולוציה מכוונת. באופן פוטנציאלי זה די אוניברסלי, כפי שהוא צריך להיות ישים לכל endonuclease הגבלה הבחירה יכולה להיות מופנית כלפי כל גרסה מחמירה יותר של רצף קוגנט המקורי. אם גרסאות חדשות שנוצרו מתבטאות בתרגום תמלול במבחנה, הפרוטוקול מתאים לא רק לצמצום הספציפיות, אלא גם לשינוי הספציפיות.
כדי להחליט על אתרים עבור mutagenesis תת-קטגוריה, בחר תדרי mutagenesis על פי החשיבות ההיפותטית של האתרים, תוך שמירה על מגבלות על מורכבות הספרייה הכוללת בחשבון. כדי להתחיל את הסינתזה, הוסף עמודות שנארזו עם שף חדש לתוך הסינתיסייזר. לסנתז אוליגונוקלאוטידים בכל העמודים עד לשלישייה, מיד לפני האתר השני של מוטגנציה תת-אזורית סופר מקצה שלושת הפריים.
לסנתז, עוזב קבוצת trityl חמישה ראשונים בסוף. קבוצת ההגנה תוסר בתחילת מחזור הסינתזה הבא. פתח את עמודי הסינתזה וצנטריפוגה לזמן קצר לתוך צינורות יבשים 1.5 מיליליטר כדי לאסוף את הרף.
משוך את התמיכה בסינתזה CPG וערבב על ידי מערבולת. חלק מחדש את שף CPG המעורב לעמודות סינתזה חדשות. הימנע החדרת לחות כי זה יקטין את התשואה הכוללת.
המשך את הסינתזה, החל משלישיית אתר המוטגנס של תת-האתר. הקצה עמודות לשלישיות NNS אקראיות או לשלישייה מסוג פראי בהתאם לתדר המוטגנסיס הרצוי. אם קיימים אתרי תת-אזור נוספים, המשך רק לשלישייה שלפני אתר mutagenesis תת-אזור הבא.
אם לא קיימים יותר אתרי תת-אזור במורד הזרם, השלם את הסינתזה, והשאיר קבוצת trityl של חמישה ראשונים בסוף. השתמש טיפים פיפטה נשא רחב להכין תערובת פעילי שטח שמן על ידי הוספת 225 microliters של Span 80 ו 25 microliters של Tween 80 כדי חמישה מיליליטר של שמן מינרלי בצינור חרוט 15 מיליליטר. מערבבים היטב על ידי היפוך עדין 15 פעמים.
התערובת בשלב זה צריכה להיות שקופה. עבור כל ספרייה, להעביר 950 microliters של תערובת פעילי שטח שמן לבקבוקון קריוגני עגול שני מיליליטר תחתון. תווית עם שם ספרייה והעברה לקרח.
שים בר ערבוב גלילי אחד קטן לתוך כל בקבוקון. הכן תערובת תגובת תמלול-תרגום במבחנה בהתאם להצעות היצרן. משלימים את התערובת עם מגנזיום כלורי לריכוז סופי של 1.5 מילימולר.
לוותר על 50 aliquots microliter של תערובת התגובה לתוך 1.5 צינורות מיליליטר על קרח. מוסיפים 1.7 femtomoles של הספרייה לתערובת התגובה על הקרח. הכינו אמולסיה של מים בשמן ברציפות לכל ספרייה על ידי הנחת תחילה מקור קטן מלא בקרח על ערבוב מגנטי עם המהירות המרגשת שנקבעה ל-1150 סל"ד.
לאחר מכן להעביר בקבוקון קריוגני עם 950 microliters של תערובת פעילי שמן ובר ערבוב קטן לתוך מקור קר כקרח על המערבב המגנטי. תבדקו שהבר המרגש מסתובב. הוסיפו חמישה אליקוטים של 10 מיקרוליטר של תערובת התרגום לתעתיק בספרייה במבחנה במשך שתי דקות במרווחים של 30 שניות והמשיכו לבחוש במשך דקה נוספת.
מעבירים את הבקבוקון עם ההמולסה למיכל קרח. בשלב זה, הנוזל צריך להיות אטום, לא שקוף. לאחר מכן, המשך בספריה הבאה.
לאחר שכל הספריות מעובדות, התחל את הדגירה של כל הספריות על פי המלצות יצרן הערכה. מעבירים את הבקבוקונים לטמפרטורה אופטימלית עבור אנדונוקלאז מהונדס במשך שעתיים נוספות לפני הנחת אותם על קרח לפחות 10 דקות. מעבירים את האמולסיות מהבקבוקונים הקריוגניים לצינורות 1.5 מיליליטר.
הוסף מיקרוליטר אחד של EDTA 5 טוחן. וצנטריפוגה אותם ב 13, 000 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. אם לאחר צנטריפוגה אתה לא יכול לראות את ממשק שמן מים בבירור, להקפיא את התערובת לפני השאיפה של שלב השמן העליון.
להזיז את שלב השמן העליון עם פיפטה ולהשליך. מיד לבצע מיצוי על ידי הוספת 150 microliters של פנול כלורופורם ו 100 microliters של 10 מילימולרים טריס-HCl לשלב הממימי. מערבולת ולאחר מכן לבצע הפרדת פאזה באמצעות צנטריפוגה של 30 שניות ב 13, 000 פעמים גרם.
לאסוף את השלב הממימי העליון. לזרז את ה-DNA על ידי הוספת 15 microliters של אצטט נתרן שלוש טוחנות, 2.5 עד 5 מיקרוגרם של גליקוגן, ו 375 microliters של אתנול. לאחר דגירה הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת, צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 13, 000 פעמים g, ארבע מעלות צלזיוס.
השליכו את העל-טבעי ושטפו בקצרה את גלולה עם מיליליטר אחד של קר 70%אתנול. יבש את גלולת הגליקוגן DNA בvac מהירות או מייבש אוויר במשך יותר מחמש דקות. ואז להמיס את גלולה ב 50 microliters של 10 מילימולר טריס-HCl.
לאחר מכן, להוסיף חמישה microliters של חרוזים מגנטיים סטרפטבידין, מוכן על פי הוראות היצרן. מערבבים במשך שעה בטמפרטורת החדר, רצוי במיקסר קרוסלה או על ידי מערבולת עדינה. מעבירים את הצינורות לעמוד מגנטי כדי להפריד את חרוזים.
ואז לאסוף את הנוזל מועשר DNA ללא ביוטין. פרוטוקול זה הוא כלי להגדלת התדירות של גרסאות רצויות של אנדונוקלאזות הגבלה מהונדסות על ידי דלדול אנזימים לא פעילים אנדונוקלאזות עם ספציפיות רצף מסוג בר ללא שינוי. הקרנה מוצלחת יכולה לזהות עד 20% מהגרסאות המבטיחות.
גרסאות מסומנות כגרסאות מבטיחות אם הן מייצרות תבנית מחשוף הנבדלת מהאנזים הפראי. משתנים שעשויים לשנות את העדפת הרצף מסומנים גם הם בתווית. מוצג כאן הוא הקרנה לא מוצלחת עם רוב השונות לא פעיל גרסה אחת עם דפוס מחשוף ללא הפרעה לכאורה.
במקרה זה, הספריות נשלטות ככל הנראה על ידי גרסאות לא פעילות שנמלטו מצעד הבחירה של לכידת סטרפטבידין. זה קריטי לעצב בקפידה את הרצפים שנבחרו נגד נבחר ולהגביל את גיוון הספרייה על ידי אסטרטגיית mutagenesis המייצרת תחליפים רק כמה עמדות נבחרות. הגרסאות הטובות ביותר שנבחרו צריכות להיות מאופיינות ביסודיות לקינטיקה מחייבת ומחשוף על רצפים מועדפים ולא מחשוף המבוססים על התוצאות מההקרנה הראשונית.
במקרה הבדיקה שלנו, אתרי mutagenesis נבחרו על בסיס מודל הומולוגיה. באופן מפתיע, מבנה גבישי הראה מאוחר יותר כי כמה שאריות שהשתנו ככל הנראה אינן במגע ישיר עם DNA.
