DZ é suportado pelo MD Anderson Cancer Center e bolsas NIH AI079232. MD Anderson Cancer Center é apoiado em parte pelo NIH concessão CA16672.

1. Preocupações de segurança em laboratório <ol><li> Todos os solventes orgânicos devem ser armazenados em áreas específicas, com rotulagem clara. Veja rótulos pelos fabricantes para os tipos de extintores de incêndio necessários. </li><li> Vários reagentes utilizados são potencialmente carcinogénico e pode causar depressão mental. Estes reagentes devem ser tratados de uma capa química com ventilação (Veja a tabela de reagentes e equipamentos específicos para fins específicos). </li><li> Recomenda-se que ao trabalhar com solventes orgânicos, e as células, o equipamento de protecção individual, como luvas, bata e óculos de protecção ser utilizados em todos os momentos. </li></ol> 2. Extracção de Glicoesfingolipídeos de células de leucemia de rato <ol><li> Loja de ratos RBL células de leucemia 8 (de 10 a 100 milhões) em tubos de vidro 16x100 mm sob -80 ° C condições. As células são contadas por um hemocitómetro após coloração com azul de tripano. Viabilidade das células deve ser superior a 95%. </li><li> Extraia os lipídios usando sonicat extensaion quatro vezes para cada 1-2 horas com solventes de polaridade mistos. Use 6 ml de clorofórmio-metanol 1:1 (v / v) como solvente e sobrenome. Seis mililitros de isopropanol: hexano: H2O 55:25:20 (v / v / v, fase superior remover por aspiração antes da utilização) pode então ser utilizado como o solvente de segundo e terceiro. Este solvente é preparado por mistura de isopropanol: hexano: H 2 O numa proporção de 55:25:20, com agitação vigorosa, e uma fase superior que permite a aparecer, o qual será removido. Manter a fase inferior para utilização. </li><li> Siga sonicação com centrifugação para sedimentar o material insolúvel. A piscina do sobrenadantes. Secá-los num Speedvac durante 4 h. Corrente de azoto ou evaporador rotativo pode ser usado se Speedvac não está disponível. Use uma boa armadilha frio para segurar evaporaram solventes orgânicos. A contaminação de um solvente orgânico no óleo da bomba de vácuo irá diminuir a eficiência da bomba de vácuo. </li><li> Faça uma análise preliminar usando alto desempenho cromatografia em camada delgada (HPTLC). Para quantificar glicolipídios, Preparar uma orcinol a 0,2% em solução de ácido sulfúrico a 50% (100 mg em 50 ml) e um padrão de Galactose (40 mg em 100 ml de solução concentrada). Preparar, em 30 ul de volume de reacção de uma série de diluições para usar como curva padrão (de 0 g / L até 20 g / L). Adicionar 20 ul de metanol a cada amostra de séries de diluição. Dissolver cada amostra de glicolípidos em 200 ul de metanol, sonicar, e utilizar para a medição de 20 ul quantidade de glicolípidos. Em tubos de 1,5 ml de Eppendorf com tampas roscadas (Sarstedt, 72.692.005), adicionar 0,4 ml de 0,2% de orcinol em solução de ácido sulfúrico a 50% para cada uma das amostras, com uma série de Galactose-H 2 O-metanol soluções que servem para a curva padrão . Ferver durante 5 min em bloco de aquecimento a 100 ° C. Ler a densidade óptica de reação de cor a 440 nm usando Sunrise Tecan Leitora. Para executar HPTLC, utilizar clorofórmio: metanol: H2O 60:35:8 (v / v / v) como solvente de lipídeos neutros tratados com clorofórmio-metanol 1:1 (v / v). Use isopropanol: hexano: H2O 55:25:20 (v / v / v) comoo solvente para os lípidos ácido (gangliósidos). Os isolados GSLs neutros foi dissolvido em 200 ul de clorofórmio solvente: metanol 1:1 (v / v) e carregado em sílica Merck placa de cromatografia em camada fina de gel por Drummond microcaps. As placas foram analisadas em clorofórmio solvente: metanol: H2O 60:35:8 (v / v / v) e seca-se. Os glicoesfingolípidos foram visualizadas por orcinol-ácido sulfúrico a 300 ° C. </li><li> A fim de separar os lípidos neutros a partir dos ácidos, fracção de lípidos para fora os lípidos neutros e ácidos, por cromatografia de permuta aniónica sobre uma pequena coluna de DEAE Sephadex A-25 [a DEAE Sephadex A25 resina pode ser preparada por imersão de resina Sephadex A-25 pó em clorofórmio: metanol: H2O 30:60:8 (v / v / v) durante a noite. Aspirar o sobrenadante até que a resina Sephadex A25 é tudo o que resta. Adicionar clorofórmio fresco: metanol: H2O 30:60:8 (v / v / v) para lavar a resina. Repetir três vezes para remover os resíduos de carga negativa a partir de Sephadex] resina A25. </li><li> Dissolver, Sonicado (por não mais do que 10 min), e ressuspender os lipidos a partir do passo 2.1 em clorofórmio: metanol: H2O 30:60:8 (v / v / v), quando necessário. </li><li> Prepara-se uma pequena DEAE Sephadex A25 (Cl) Forma coluna usando lã de vidro e um 9 &quot;pipeta de Pasteur. Embalar a lã de vidro cuidadosamente, de modo que o pó de resina não passar através da coluna. Adicionar DEAE Sephadex A25 (Forma Cl) de resina para o&quot; pescoço &quot;da 9&quot; pipeta de Pasteur, sem deixar que a coluna seca. Certifique-se que você não vê qualquer resina em eluente. As amostras dissolvidas em clorofórmio: metanol: H2O 30:60:8 (v / v / v) foram dissolvidos. A fracção de lípido neutro é o fluxo através da fracção. </li><li> Eluir a fracção de lípido acídico (ligada às resinas) com 8 ml de acetato de sódio em metanol. Secar ambas as fracções neutros e ácidos, dessalinizar los por diálise, secá-los por Speedvac e analisá-las por HPTLC. </li></ol> A fracção ácida contém gangliósidos, que podem ser dialisados ​​para a reacção 3 Passo directamente.A fracção neutra contém não só glicoesfingolípidos neutros, mas também fosfolípidos (fosfatidilcolina e esfingomielina), que devem ser removidos por uma reacção de acetilação. Na nossa experiência, o método de uma cassete de diálise, é mais eficiente e conveniente do que um tubo de diálise ou cromatografia de coluna de fase reversa C18. <ol start="9"><li> O próximo passo é a remoção de fosfolípidos de glicoesfingolípidos neutros por uma reacção de acetilação e peracetylation. Seca-se o Sephadex DEAE A-25 fracção de passagem no Speedvac (com arrefecimento) durante 4 horas. Depois que as amostras são secas, colocá-los de volta para o Speedvac e seco para outro hr 4. Assegure-se que estas amostras são completamente seco, qualquer água residual que vai impedir que a reacção peracetylation. </li><li> Peracetylate as amostras com 1 ml de piridina e 0,5 ml de anidrido acético, no escuro, à temperatura ambiente ou a 37 ° C durante a noite. Esta quantidade de anidrido acético e piridina é adequada para sede 200 ug de glicoesfingolípidos. Esta reacção pode ser realizada a 37 ° C, enquanto os GSLs têm melhor solubilidade. </li><li> Secar o material peracetilado por Speedvac durante 3 horas, com a adição de 1 ml de tolueno 3x (coevaporação) para assegurar a completa evaporação. Se as amostras não são ainda completamente seco, Speedvac até secar. </li><li> Prepara-se uma coluna de Florisil (Sigma-Aldrich) (30-60 mesh, 10 x 80 mm) de uma pipeta de Pasteur com a lã de vidro, utilizando esferas de Florisil. Grânulos de florisil deve ser completamente seco antes da sua utilização, por incubação num forno a 110 ° C. Encha as pérolas na pipeta Pasteur até ao pescoço, e equilibrar em 1,2-dicloroetano-hexano 4:1 (v / v). </li></ol> A eluição a partir da coluna de Florisil é muito rápido. Volatilidade rápida dos solventes pode conduzir à secagem da coluna. Assim, todas as misturas de solventes deve ser preparada antes de correr a coluna, uma vez que não é possível parar a coluna durante a eluição. <ol start="13"><li> Aplique o peracetílicoated amostra em 1 ml de 1,2-dicloroetano-hexano 4:1 (v / v), e lava-se a coluna com 6 ml do mesmo solvente, seguindo-se 10 ml de 1,2-dicloroetano. Eluir neutros GSLs peracetilado com 6 ml de 1,2-dicloroetano-acetona 1:1 (v / v). Este passo remove os fosfolípidos peracetilado de glicoesfingolípidos, porque os glicoesfingolípidos peracetilado liga à coluna de Florisil, enquanto fosfolípidos peracetilado não. </li><li> Secam-se as fracções por Speedvac durante 2 horas e desacetilar com 2 ml de metóxido de sódio 0,5 M [Sigma-Aldrich, 403067] em 2 ml de metanol durante 3 horas à temperatura ambiente. </li><li> Neutraliza-se a mistura com 3 ml de ácido acético metanólico [ácido acético / metanol 15/85 v / v], seco por Speedvac, desalt por diálise [Dissolver os produtos secos, em 3 ml de água, e injectar no Slide-A-Lyzer Cassete de diálise, dializar contra água durante 24 h. Troque a água pelo menos duas vezes]. Secar os GSLs dialisados ​​(em solução aquosa) por Speedvac até as amostras estarem completamente secos. </li&gt; </ol> 3. Chemical Modification (permetilação) de 13 Glicoesfingolipídeos <ol><li> Introduzir GSLs (1-20 ug) para um tubo de vidro com tampa de rosca e revestimento de teflon, e adicionar sulfóxido de dimetilo (150 ul) sem o uso de condições de secagem especiais ou atmosfera de gás inerte. </li><li> Preparar hidróxido de sódio em pó (40-60 mg) a partir de partículas de hidróxido de sódio moendo-se num almofariz com um pilão de química. Certifique-se de armazenar os pós em um ambiente muito seco e ter o cuidado de fazer a retificação na capa química para evitar respirar o pó. </li><li> Em seguida adicione o pó de hidróxido de sódio à solução de amostra, com uma espátula. Adicionar iodometano (80 uL) com uma seringa de 100 microlitros Halmilton, [ou um VWR microlitro 100 calibrado pipeta ligada a uma seringa através de uma tubagem de borracha podem ser usados], e agitar a mistura à temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Extingue-se a reacção de metilação com água (2 ml). Extrair os produtos permetilada 3 vezes pora adição de diclorometano (2 ml) [glicolipidos estão em fase de diclorometano, que é a fase mais baixa, então a fase superior é transferida para um tubo de vidro de novo, e foi extraída de novo com diclorometano]. </li><li> Lavar os extractos combinados de diclorometano a 3 vezes com 2 ml de água [a fase superior, que é a água, pode então ser eliminados]. Após a lavagem final, transferir as amostras para um novo tubo, e secar utilizando o Speedvac. </li><li> As amostras podem então ser dissolvido em 100 a 200 ul de metanol para análise ESI-MS. </li></ol> 4. MALDI-TOF Análise dos Gycosphingolipids permetilada <ol><li> Executar MALDI-TOF-MS e MALDI-TOF/TOF-MS/MS experiências num TOF-TOF MALDI Mass Spectrometer (Applied Biosystems 4700, Foster City, CA). Preparar a matriz através da mistura de volume de 50% de 10 mg / ml de ácido di-hidroxibenzóico (DHB) em acetonitrilo e 50% de volume de 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) em água. </li><li> A matriz DHB pode ser visto no targe MALDIt (1 ul), seguido por um pi 1 (contendo 100 ng GSLs) mancha da amostra dissolvida em metanol. Aplicar lentamente e deixá-la secar antes da análise. </li></ol> 5. Ion trap MS Análise de Glicoesfingolipídeos permetilada <ol><li> Realizar a espectrometria de massa de um espectrómetro de massa linear ion trap (LTQ, ThermoScientific, San Jose, CA), utilizando uma fonte de nanoelectrospray, 0,30 caudal ul / min a 230 ° C de temperatura capilar em modo de ião positivo com uma energia de colisão de 30-50%. Definir as energias de colisão para deixar uma abundância mínima residual do ião precursor. Detectar todos os iões de sódio como adutos. </li><li> Identificar o iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) numa mistura de Gb3 isobárica (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) e (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) iGb3 padrões ao comparar os diferentes padrões de MS quatro iões dos produtos a partir do ião molecular sodiated através do fragmento de glicano m / z 667 e do terminal de dissacarídeo 1 - eno ião de m / z 445 (isto é,X → 667 → 445 →, X significa o ião molecular detectado em MS 1) de puras permetilada iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) Normas via ESI-LIT-MS com as do permetilada Gb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer). </li></ol>

<ol>
	<li>Schnaar, R. L., Suzuki, A., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10+Glycosphingolipids.">Chapter 10 Glycosphingolipids.</a> Essentials of Glycobiology. , (2009).</li><li>Bendelac, A., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+17+NKT+cells+and+other+Innate-like+T+and+B+lineages.">Chapter 17 NKT cells and other Innate-like T and B lineages.</a> Fundamental Immunology. , (2011).</li><li>Jacewicz, M., Clausen, H., Nudelman, E., Donohue-Rolfe, A., Keusch, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+shigella+diarrhea.+XI.+Isolation+of+a+shigella+toxin-binding+glycolipid+from+rabbit+jejunum+and+HeLa+cells+and+its+identification+as+globotriaosylceramide.">Pathogenesis of shigella diarrhea. XI. Isolation of a shigella toxin-binding glycolipid from rabbit jejunum and HeLa cells and its identification as globotriaosylceramide.</a> J. Exp. Med. 163 (6), 1391-1404 (1986).</li><li>Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+function+of+iGb3.">The immunological function of iGb3.</a> Curr. Protein Pept. Sci. 7 (4), 325-333 (2006).</li><li>Miyamoto, K., Miyake, S., Yamamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+glycolipid+prevents+autoimmune+encephalomyelitis+by+inducing+TH2+bias+of+natural+killer+T+cells.">A synthetic glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells.</a> Nature. 413 (6855), 531-534 (2001).</li><li>Zhou, D., Levery, S. B., Hsu, F. F., Wang, P. G., Teneberg, S., Almeida, I. C., Li, Y., Xu, H., Wang, L. X., Xia, C., Ibrahim, N. K., Michael, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+mapping+of+glycomes:+implications+for+cancer+diagnosis+and+therapy.">Immunologic mapping of glycomes: implications for cancer diagnosis and therapy.</a> Frontiers in Bioscience. S3, 1520-1532 (2011).</li><li>Li, Y., Thapa, P., Hawke, D., Kondo, Y., Furukawa, K., Furukawa, K., Hsu, F. F., Adlercreutz, D., Weadge, J., Palcic, M. M., Wang, P. G., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+glycosphingolipidomics+and+NKT+cell+development+in+mouse+thymus.">Immunologic glycosphingolipidomics and NKT cell development in mouse thymus.</a> J. Proteome Res. 8 (6), 2740-2751 (2009).</li><li>Li, Y., Zhou, D., Xia, C., Wang, P. G., Levery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+quantitation+of+isoglobotriaosylceramide+in+the+presence+of+isobaric+components+using+electrospray+ionization-ion+trap+mass+spectrometry.">Sensitive quantitation of isoglobotriaosylceramide in the presence of isobaric components using electrospray ionization-ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 166-176 (2008).</li><li>Li, Y., Teneberg, S., Thapa, P., Bendelac, A., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+detection+of+isoglobo+and+globo+series+tetraglycosylceramides+in+human+thymus+by+ion+trap+mass+spectrometry.">Sensitive detection of isoglobo and globo series tetraglycosylceramides in human thymus by ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 158-165 (2008).</li><li>Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+permethylation+of+glycolipid,+and+polysaccharide+catalyzed+by+methylsulfonyl+carbanion+in+dimethyl+sulfoxide.">A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfonyl carbanion in dimethyl sulfoxide.</a> J. Biochem. (Tokyo). 55, 205 (1964).</li><li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simultaneous+methylation+of+fatty+and+hydroxy+fatty+acids+for+gas-liquid+chromatographic+analysis.">Rapid and simultaneous methylation of fatty and hydroxy fatty acids for gas-liquid chromatographic analysis.</a> Carbohydr. Res. 131, 209 (1984).</li><li>Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (23), 3421-3428 (2005).</li><li>Levery, S. B., Hakomori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+methylation+analysis+of+glycolipids+using+capillary+gas+chromatography-chemical+ionization+mass+fragmentography+with+selected+ion+monitoring.">Microscale methylation analysis of glycolipids using capillary gas chromatography-chemical ionization mass fragmentography with selected ion monitoring.</a> Methods Enzymol. 138, 13-25 (1987).</li><li>Spooncer, E., Fukuda, M., Klock, J. C., Oates, J. E., Dell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+polyfucosylated+lactosaminoglycan+from+human+granulocytes.">Isolation and characterization of polyfucosylated lactosaminoglycan from human granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 259 (8), 4792-4801 (1984).</li><li>Ciucanu, I., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+oxidative+degradation+during+the+per-O-methylation+of+carbohydrates.">Elimination of oxidative degradation during the per-O-methylation of carbohydrates.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 16213 (2003).</li><li>Platt, F. M., Neises, G. R., Karlsson, G. B., Dwek, R. A., Butters, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-butyldeoxygalactonojirimycin+inhibits+glycolipid+biosynthesis+but+does+not+affect+N-linked+oligosaccharide+processing.">N-butyldeoxygalactonojirimycin inhibits glycolipid biosynthesis but does not affect N-linked oligosaccharide processing.</a> J. Biol. Chem. 269 (43), 27108-27114 (1994).</li><li>Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+47+Structural+Analysis+of+Glycans.">Chapter 47 Structural Analysis of Glycans.</a> Essentials of Glycobiology. , (2009).</li><li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li><li>Zhang, H., Singh, S., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+2.+FragLib:+an+MSn+spectral+library.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 2. FragLib: an MSn spectral library.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6263-6270 (2005).</li></ol>

DZ é um consultor para Biotex, Houston, TX, e um inventor envolvido em patentes relacionadas a tecnologias mencionadas neste artigo, emitidos ou na aplicação.

O glycome, cunhado em analogia com o genoma e proteoma, refere-se a todas as estruturas de sacarídeos de um organismo. Para compreender plenamente as funções múltiplas de glicosilação exigirá uma abordagem integrada, incluindo ambos os estudos funcionais e estruturais Glicômica. Ambos são complicados pela natureza não-molde dirigido de glicano biossíntese, a complexidade resultante e diversidade de estruturas de glicano, o frequente envolvimento de estrutura aglicona na modulação de glicano interacções ligando-receptor ao nível molecular, bem como a importância funcional de ligandos de baixa abundância. É geralmente aceite que a espectrometria de massa (MS) é um método indispensável para estudos estruturais Glicômica, especialmente para identificação e caracterização de ligandos de baixa abundância. Para observar glicanos ou glicoconjugados como espécies moleculares, muitas vezes usamos um altamente eficiente, o método de ionização baixa energia, chamado de ionização electrospray (ESI). Para mais detailed caracterização da estrutura de glicano, é essencial para seleccionar espécies moleculares individuais e quebrar os glicanos em pedaços menores. Isto é normalmente feito por dissociação induzida por colisão, o que envolve a activação dos glicanos por colisão com as moléculas de gás inerte. O aumento da energia induz quebras ligação, e uma análise sistemática dos fragmentos resultantes fornece informações sobre a estrutura molecular do glicano. Muitas vezes, &quot;assinatura&quot; de fragmentos pode ser gerada, que é diagnóstico para determinadas características estruturais de glicano. Em conjunto com a massa molecular, estes fragmentos podem, por vezes, ser suficiente para a identificação de glicanos, mas no passado muito mais informação tiver sido solicitada para caracterizar completamente a eles, em particular, se a estrutura é nova. Estes métodos incluem a análise de açúcar a composição, a análise de cromatografia gasosa espectrometria de massa de parcialmente metilados alditol acetatos para a análise de ligação e digestão glicosidase específico 17. 18-19, múltiplos ciclos de fragmentação de baixa energia, o qual pode ser eficazmente levada a cabo num espectrómetro de massa de armadilha de iões-(IT-MS), melhora significativamente o rendimento de informações a partir de glicano análise espectral de massa . Com quatro ou cinco ciclos de fragmentação (que não pode ser feito com outros instrumentos de MS), é possível distinguir glicanos isoméricas que contêm os componentes de açúcar mesmas dispostas em ligações de açúcar diferentes, mesmo quando estes estão presentes em conjunto em misturas de componentes com a mesma massa molecular (isóbaras). Para esta análise, os glicanos foram derivatizadas, substituindo todos os grupos hidroxilo livres com grupos metilo utilizando permetilação. Enquanto atribuição estrutural dos glicanos é possível sem permetilação, a permetilação aumenta a sensibilidade 17. Levery e Zhou, têm combinado de todas as vantagens potenciais da TI-MS metodologia, incluindo a detecção de isomérica structures utilizando iões de assinatura de diagnóstico, apenas observáveis ​​em MS 4 e 5, os espectros de MS para a identificação de elevada sensibilidade e quantificação de glicoesfingolípidos presentes sob a forma de misturas de várias isobáricas 7-9. Em teoria, pode ser capaz de identificar cada estrutura glicolipídeo existente, enquanto se aguarda a disponibilidade de glicolipídeos padrão, que podem ser sintetizados quimicamente. Os passos críticos dessa análise são a taxa de recuperação de GSLs de amostras biológicas. Tipicamente 80 ug de GSL podem ser recuperados a partir de 100 milhões de células de tumor, tais como RBL. Para gerar suficientes iões moleculares para múltiplos ciclos de fragmentação em espectrómetros ion-trap de massa, pelo menos 10 microgramas de GSLs tumorais são necessários. Baixo rendimento durante a purificação de GSLs conduzirá a baixa abundância de iões, que não podiam ser submetidos a nova fragmentação. O sucesso da análise é dependente da quantidade de GSL que são recuperados. Tipicamente, concentração finalentration de GSLs permetilada deve chegar a 1 mg / ml, dissolvida em metanol, antes de ser analisado numa fonte de nano-electrospray. O limite de uma análise minuciosa MS n depende da abundância de iões específico em MS perfil 1. Um típico e abundância de iões 7 é necessário para uma completa análise MS 5. O baixo rendimento de GSLs durante a purificação pode ser causada por uma perda de GSLs durante o passo peracetylation (que remove os fosfolípidos), quando os GSLs per-acetilados devem ser ligados a resina de cromatograf ia de coluna de Florisil, lavou-se, e subsequentemente eluída. A fim de assegurar a ligação de per-acetilados GSLs para gel de sílica, as amostras devem ser recarregado duas vezes para a coluna de cromatograf ia depois flui através.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,2 Dichloroethane</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34872</td>
 <td>Carcinogenic </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>VMR</td>
 <td>JT9524-0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic anhydride</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>45830</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>A18P-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>C606-1 </td>
 <td>Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEAE Sephadex A25 (Cl Form)</td>
 <td>GE Healthcare Biosciences</td>
 <td>AB 17&mdash;170-01 </td>
 <td>100 gram</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Decane (anhydrous): </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>457116 </td>
 <td>100 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichloroacetic acid</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D54702 </td>
 <td>Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dialysis cassette </td>
 <td>Fischer(Pierce) </td>
 <td>66110 </td>
 <td>Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>20684 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl acetate </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>UN1173 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Florisil</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>46384 </td>
 <td>for packing chromatography column</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hexanes </td>
 <td>EMD</td>
 <td>HX0290-6 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodomethane </td>
 <td>Riedel de Haen, Germany</td>
 <td>03810 </td>
 <td>stabilized with silver foil Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol </td>
 <td>VWR/EMD</td>
 <td>MXO475-1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral glycosphingolipid Qualmix </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1505</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monosialganglioside mixture</td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1508</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disialoganglioside mixture </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1509</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lactosyl ceramide and sialosylderivatives </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1511</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>13-678-6A </td>
 <td>9"''</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyridine: </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>270407 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Hydroxide: </td>
 <td>BDH </td>
 <td>0292 </td>
 <td>500 gram</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium methoxide </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>404367 </td>
 <td>0.5 M solution in methanol</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Toluene </td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>9351-03 </td>
 <td>4 L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Name of the equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>13-678-6A </td>
 <td>9"''</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber glass (glass wool)</td>
 <td>Corning Incorporated</td>
 <td>3950 </td>
 <td>Pyrex 9989 glass</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm glass tubes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>14-962-10B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calibrated pipettes (100 microlitter)</td>
 <td>VMR</td>
 <td>53432-921</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>16x100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>14-961-29 </td>
 <td>With screw caps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Caps for glass tubes</td>
 <td>Kimble</td>
 <td>40566C </td>
 <td>size/13-415 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Merck TLC plates</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 29, 301-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tank for TLC</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 12,619-5 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Drummond Microcaps </td>
 <td>Drummond scientific company</td>
 <td>1-000-0100 </td>
 <td>10 &mu;l, for loading of TLC samples</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sunrise Microplate Absorbance Reader</td>
 <td>Tecan</td>
 <td>A-5082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Whatman Chromatography Paper</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>05-716-3E</td>
 <td>18 cm x 34 cm For TLC Tank</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Orcinol ferric chloride spray reagent</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>O7875</td>
 <td>For detecting glycosphingolipids on TLC plates</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Prevel Spray Unit</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 36,555-6 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sonicator</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>FS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Sorvall</td>
 <td>Legend RT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Speedvac</td>
 <td>Savant</td>
 <td>AS160 </td>
 <td>With chemical trap for organic solvants</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF-TOF Mass spectrometer</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Proteomics 4700 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ion Trap Mass spectrometer</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>LTQ </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

mass spectrometric analysis of glycosphingolipid antigens

Glicoesfingolípidos (GSL) pertencem à classe de glicoconjugado biomacromoléculas, que levam informações estruturais significativas para os processos biológicos, tais como o desenvolvimento embrionário, a transdução de sinal, e no reconhecimento imunológico do receptor 1-2. Eles contêm porções de açúcar complexos, sob a forma de isómeros, e porções lipídicas, com variações, incluindo comprimento de cadeia acilo gordo, de insaturação, e hidroxilação. Ambas as porções de hidrato de carbono e de ceramida pode ser base de significância biológica. Por exemplo, o tri-hexosylceramides incluem globotriaosilceramida (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) e isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), que possuem massas moleculares idênticas mas ligações de açúcar diferentes de fracção de hidratos de carbono, completamente responsável por diferentes funções biológicas 3-4. Em outro exemplo, demonstrou-se que a modificação da parte ceramida de alfa-galactosilceramida, um ligando agonista potente para invariantecélulas NK, mudanças de formigas seus perfis de citocinas secreção e função em modelos animais de câncer e doenças auto-imunes 5. A dificuldade na realização de uma análise estrutural de isómeros nos órgãos e células imunes servir como uma barreira para a determinação muitas funções biológicas 6. A seguir, apresentamos uma versão visualizada de um método de análise relativamente simples, rápido, sensível e de perfis de glicoesfingolipídeos em células imunes 7-9. Este método baseia-se na extracção e modificação química (permetilação, ver abaixo Figura 5A, todos os grupos OH de hexose foram substituídos por MeO após reacção permetilação) de glicoesfingolípidos 10-15, seguido de posterior análise usando laser assistida por matriz de dessorção / ionização-tempo de vôo espectrometria de massa (MALDI-TOF/MS) e espectrometria de massa de íons armadilha. Este método exige 50 milhões de células imunes para uma análise completa. Os experimentos podem ser concluídas dentro de uma semana. A abundância relativa dos vários glicoesfingolípidos pode ser delineada por comparação com padrões sintéticos. Este método tem uma sensibilidade de medição de 1% entre iGb3 Gb3 isómeros, quando da mistura de 2 fmol iGb3/Gb3 total está presente 9. Espectrometria de massa de iões de captura podem ser utilizadas para analisar os isómeros. Por exemplo, para analisar a presença de globotriaosilceramida isoglobtriaosylceramide e na mesma amostra, pode-se utilizar a fragmentação de moléculas estruturalmente glicoesfingolipídeos a discriminar entre os dois (ver Figura 5 abaixo). Além disso, a modificação química das porções açúcar (por meio de uma reacção de permetilação) melhora a eficiência de ionização e fragmentação de maior sensibilidade e especificidade, e aumenta a estabilidade dos resíduos de ácido siálico. A modificação química de extracção e glicoesfingolípidos pode ser realizada em um capuz clássico químicas certificadas, e a espectrometria de massa pode ser realizada por núcleoinstalações com instrumentos ion trap MS.

Um exemplo de uma análise de MS MALDI dos glicoesfingolípidos de rato RBL linha de leucemia de células (um tipo de célula que apresenta o antigénio que apresenta antigénios glicoesfingolipídeos de células NKT) é mostrado na Figura 3. Os iões podem ser atribuídos a estruturas específicas glicoesfingolipídeos (Figura 3A). Em células RBL tratados por NB-DGJ 16, uma droga que inibe a síntese de glicosfingolípidos, redução significativa de todos os glicoesfingolípidos foi observado (Figura 3B). Isómeros estruturais não podem ser distinguidas. A capacidade de MS / MS do Applied Biosystems 4700 permite a fragmentação de iões MS1 para MS 2 fragmentos, permitindo que a informação estrutural limitado a ser gerado. No entanto, a análise de MS2 muitas vezes não é suficiente para discriminar isómeros de oligossacáridos. O Ion-Trap MS análise de glicoesfingolípidos permite o estudo de isómeros, tais como iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) e Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) que podem existir como os iões trihexosylceramide detectados na Figura 3A. Para detectar esses isómeros, padrão iGb3 Gb3 e foram analisados ​​por múltiplos ciclos de fragmentação, até que foram encontradas diferenças (Figura 4A e 4B). No exemplo aqui apresentado (Figura 5C) e iGb3 Gb3 puderam ser discriminados por comparação com o padrão iGb3 e Gb3. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxograma do procedimento de extracção, glicosfingolípidos e modificação química de glicoesfingolípidos (permetilação). Glicoesfingolipídeos foram extraídas a partir de células por solventes orgânicos. Para remover não-glicoesfingolípidos, lípidos pode ser peracetilado e desacetilado. Em segundo lugar, glicoesfingolípidos foram quimicamente modificados através de uma reacção permetilação, o que melhora a sensibilidade e especificidade do MS detection. Por fim, os perfis glicoesfingolipídeos foram determinados utilizando MALDI-TOF de espectrometria de massa e espectroscopia de massa de iões armadilha. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig2.jpg" /> Figura 2. Quantificação glicosfingolípidos pelo método do ácido sulfúrico orcinol: Quantificação dos glicoesfingolípidos usando um 0,2% orcinol em solução de ácido sulfúrico a 50% e uma curva padrão de glucose. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3.jpg" /> Figura 3. Glycosphingolipidomics de células de leucemia de rato A. Representante de espectro de massa MALDI, cada ião. Representa uma estrutura específica glicosfingolípidos, isómeros estruturais não podem ser distinguidos B. NB-DGJ, uma droga que inibe a síntese de glicosfingolípidos, s.ignificantly reduz todos os glicoesfingolipídeos produzidos em células RBL. <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4.jpg" /> Figura 4. Tandem Espectrometria de Massa de isómeros de Glicoesfingolipídeos. A. Característica vias de decomposição de modo positivo a espectrometria de massa de íons armadilha de GSLs permetilada 3 GB Cer e igb Cer 3. Gb 3 e IGB 3 são claramente separados por seus padrões de fragmentação. As diferenças na ligação são reflectidos nas 4 ms iões de produtos compatíveis com as isobáricas m / z 445 precursores. B. Os resultados representativos mostrando iGB3 pode ser medido em uma mistura de isómeros iGb3/Gb3. Estrelas indicam íons diagnósticos para iGb3 apenas. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para</a>ver figura maior. <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5.jpg" /> Figura 5. Ion trap MS permite a análise de isômeros de glicoesfingolípidos. A. Padrão iGb3 e Gb3 demonstram diferença de perfil de fragmentação após quatro rodadas de fragmentação em uma armadilha de íons LTQ espectrômetro de massa. B. Característica MS 4 perfil de íons derivados de iGb3 ou Gb3. C. Trihexosyleramides são misturas de isómeros Gb3 iGb3 e que podem ser identificados por método de ion trap MS (Figura Dapeng por Zhou). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens at JoVE.com

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Um método específico e sensível para obter informações sobre o perfil de expressão de antígenos glicoesfingolipídeos em órgãos e células do sistema imunológico é descrito. O método tira partido da espectrometria de massa de iões armadilha permitindo passo a passo de fragmentação de moléculas de glicoesfingolipídeos para análise estrutural em comparação com padrões de síntese química.

Análise por espectrometria de massa de Antígenos glicoesfingolipídeos

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

mass-spectrometric-analysis-of-glycosphingolipid-antigens

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.4K visualizações.  Rice University. Um método específico e sensível para obter informações sobre o perfil de expressão de antígenos glicoesfingolipídeos em órgãos e células do sistema imunológico é descrito. O método tira partido da espectrometria de massa de iões armadilha permitindo passo a passo de fragmentação de moléculas de glicoesfingolipídeos para análise estrutural em comparação com padrões de síntese química.

Vídeo: Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Quantificação de Th-1 respostas imunes celulares contra antígenos microbianos

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Imunologia e Infecção

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell anemia 1-3. Due to the presence of multitude of antigens on the RBC surface (~308 known antigens 4), patients in the chronic blood transfusion therapy develop alloantibodies due to the miss match of minor antigens on transfused RBCs 4, 5. Grafting of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) and hyperbranched polyglycerol (HPG) forms an exclusion layer on RBC membrane that prevents the interaction of antibodies with surface antigens without affecting the passage of small molecules such as oxygen ,glucose, and ions3. At present no method is available for the generation of universal red blood donor cells in part because of the daunting challenge presented by the presence of large number of antigens (protein and carbohydrate based) on the RBC surface and the development of such methods will significantly improve transfusion safety, and dramatically improve the availability and use of RBCs. In this report, the experiments that are used to develop antigen protected functional RBCs by the membrane grafting of HPG and their characterization are presented. HPGs are highly biocompatible compact polymers 6, 7, and are expected to be located within the cell glycocalyx that surrounds the lipid membrane 8, 9 and mask RBC surface antigens10, 11.

The cell membrane modification of red blood cells (RBCs) with hyperbranched polyglycerol (HPG) is presented. Modified RBCs were characterized by aqueous two phase partitioning, osmotic fragility and complement mediated lysis. The camouflage of surface proteins and antigens was evaluated using the flow cytometry and Micro Typing System (MTS) blood phenotyping cards.

Antígenos funcionais protegidos glóbulos vermelhos pela membrana enxerto de compactos Poligliceróis hiper

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Desenvolvimento de uma colite Modelo Antigen-driven para o Estudo de apresentação de antígenos por células apresentadoras de antígenos às células T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

Usando cristalografia de raios X, Biofísica, e os ensaios funcionais para determinar a célula T mecanismos que regem o reconhecimento do receptor de Câncer Antígenos

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I molecules also known as cross-presentation (CP). CP plays an important role not only in the stimulation of na&#239;ve CD8+ T cells and memory CD8+ T cells for infectious and tumor immunity but also in the inactivation of self-acting na&#239;ve T cells by T cell anergy or T cell deletion. Although the critical molecular mechanism of CP remains to be elucidated, accumulating evidence indicates that exogenous antigens are processed through endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) after export from non-classical endocytic compartments. Until recently, characterizations of these endocytic compartments were limited because there were no specific molecular markers other than exogenous antigens. The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of these endocytic compartments. Using this purified microsome, we reconstituted the ERAD-like transport, ubiquitination, and processing of the exogenous antigen in vitro, suggesting that the ubiquitin-proteasome system processed the exogenous antigen after export from this cellular compartment. This protocol can be further applied to other cell types to clarify the molecular mechanism of CP.

The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of the cellular compartments where exogenous antigens are processed by endoplasmic reticulum-associated degradation in cross-presentation.

Purificação do compartimento da membrana retículo endoplasmático associado a degradação de antígenos exógenos em cruz-apresentação

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for protection against children&#39;s severe TB meningitis and some forms of disseminated TB, but fails to protect against pulmonary TB, which is the most prevalent form of the disease. Promising strategies to improve BCG currently rely either on its transformation with genes encoding immunodominant M. tuberculosis (Mtb)-specific antigens and/or complementation with genes encoding co-factors that would stimulate antigen presenting cells. Major limitations to these approaches include low efficiency, low stability, and the uncertain level of safety of expression vectors. In this study, we present an alternative approach to vaccine improvement, which consists of BCG complementation with exogenous proteins of interest on the surface of bacteria, rather than transformation with plasmids encoding corresponding genes. First, proteins of interest are expressed in fusion with monomeric avidin in standard E. coli expression systems and then used to decorate the surface of biotinylated BCG. Animal experiments using BCG surface decorated with surrogate ovalbumin antigen demonstrate that the modified bacterium is fully immunogenic and capable of inducing specific T cell responses. Altogether, the data presented here strongly support a novel and efficient method for reshaping the current BCG vaccine that replaces the laborious conventional approach of complementation with exogenous nucleic acids.

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

A novel technique for rapid antigen display on a bacterial surface is presented, which involves surface biotinylation followed by exposure to proteins of interest in fusion with monomeric avidin. Loading BCG with selected antigens successfully improves its immunogenicity, suggesting that surface decoration can replace traditional genetic approaches.

Expressão de antígenos exógenos a Mycobacterium bovis BCG através da decoração de superfície Non-genética com o sistema de avidina-biotina

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies in an attempt to understand the precise mechanisms that lead to the breakdown of self-tolerance and subsequent autoimmunity. Approaches thus far have been based on the study of one specific aspect of the immune system (a single or few cell types or cytokines), and do not offer a global assessment of complex autoimmune disease. While patient sera-based studies have afforded important insights into autoimmunity, they do not provide the specific cellular source of the dysregulated cytokines detected. A comprehensive single-cell approach to evaluate cytokine production in multiple immune cell subsets, within the context of &#34;intrinsic&#34; patient-specific plasma circulating factors, is described here. This approach enables monitoring of the patient-specific immune phenotype (surface markers) and function (cytokines), either in its native &#34;intrinsic pathogenic&#34; disease state, or in the presence of therapeutic agents (in vivo or ex vivo).

Here we describe a single-cell proteomic approach to evaluate immune phenotypic and functional (intracellular cytokine induction) alterations in peripheral whole blood samples, analyzed via mass cytometry.

Análise de célula única do imunofenótipo e produção de citocinas no sangue periférico através de citometria de massa

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure makes the spore extremely stable and resistant and has suggested the use of the spore as a platform to display heterologous molecules. So far, a variety of antigens and enzymes have been displayed on spores of Bacillus subtilis and of a few other species, initially by a recombinant approach and, then, by a simple and efficient nonrecombinant method. The nonrecombinant display system is based on the direct adsorption of heterologous molecules on the spore surface, avoiding the construction of recombinant strains and the release of genetically modified bacteria in the environment. Adsorbed molecules are stabilized and protected by the interaction with spores, which limits the rapid degradation of antigens and the loss of enzyme activity at unfavorable conditions. Once utilized, spore-adsorbed enzymes can be collected easily with a minimal reduction of activity and reused for additional reaction rounds. In this paper is shown how to adsorb model molecules to purified spores of B. subtilis, how to evaluate the efficiency of adsorption, and how to collect used spores to recycle them for new reactions.

This protocol focuses on the use of bacterial spores as a &#34;live&#34; nanobiotechnological tool to adsorb heterologous molecules with various biological activities. The methods to measure the efficiency of adsorption are also shown.

Adsorção de esporos, como um sistema de exibição Nonrecombinant por enzimas e antígenos

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...